抑制鐵死亡可減輕膿毒癥小鼠的心肌損傷：脂鈣蛋白-2的作用

膿毒癥全球死亡率為10%，中國每年約有500萬膿毒癥患者，死亡率超過30%。心肌功能損傷是膿毒癥住院患者中常見并發(fā)癥，膿毒癥引起的心功能不全是膿毒癥死亡率高的主要原因，但其確切機制尚不完全清楚。鐵死亡最早被觀察到鐵離子螯合劑能抑制Erastin 誘導的癌細胞死亡不同于已知的細胞死亡途徑，如凋亡、焦亡和壞死。鐵死亡的機制主要涉及脂質(zhì)過氧化物增加和脂質(zhì)活性氧的進一步釋放。當谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）或谷胱甘肽活性降低時，可誘導鐵死亡的發(fā)生。研究表明，機體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡受FSP1-NAD(P)H-CoQ軸的調(diào)節(jié)，與經(jīng)典的GPX4 通路協(xié)同抑制脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。已有研究表明，鐵死亡抑制蛋白1（FSP1）在多個癌細胞系中具有鐵死亡抗性，闡明了一個新的抗癌靶點。

鐵死亡已被證實參與到各種病理過程，包括神經(jīng)毒性、急性腎功能衰竭、肝損傷、心臟病、以及膿毒癥等。然而，其在膿毒癥心臟損傷中的作用機制尚未研究清楚，F(xiàn)SP1介導的鐵死亡是否參與其中亦尚未被闡述。

采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用x±s表示，數(shù)據(jù)差異采用t檢驗；計數(shù)資料差異采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

脂鈣蛋白-2（Lcn2）與明膠酶基質(zhì)金屬蛋白酶9活動有關(guān)。Lcn2參與先天免疫，可誘導多種趨化因子參與炎癥反應，在多種生物過程發(fā)揮作用，包括隔離含鐵細菌的鐵載體，參與哺乳動物鐵代謝、氧化應激等。有研究報道在膿毒癥動物模型中，Lcn2在肝臟和肺臟中被強烈誘導，并持續(xù)存在。臨床和動物實驗中已證實Lcn2可作為早期腎損傷的生物標志物，心力衰竭時觀察到Lcn2在血清和心肌中表達升高。Lcn2作為參與細胞鐵代謝機制的關(guān)鍵因素之一亦參與心肌組織鐵的代謝。鐵代謝異常導致細胞內(nèi)鐵超載時，過量的鐵通過Fenton和Haber-Weiss 等聯(lián)級反應產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，誘導鐵死亡的發(fā)生。LPS誘導新生小鼠急性呼吸窘迫癥和人支氣管上皮細胞損傷中，Lcn2表達增高，鐵含量增高，GPX4表達降低；沉默Lcn2降低了鐵含量，抑制了鐵死亡引起的的炎癥發(fā)應和氧化應激損傷，但Lcn2在膿毒癥誘導的心肌損傷中如何表達，是否參與介導鐵死亡的發(fā)生目前尚未見報道。

因此，本研究旨在研究盲腸結(jié)扎與穿孔（CLP）誘導的小鼠膿毒癥心肌損傷變化，并采用鐵死亡特異性抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）分析膿毒癥心肌損傷中是否發(fā)生鐵死亡，進一步探討Lcn2在鐵死亡中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

與Sham 組相比，CLP 組小鼠LVEF%降低（=0.0187，圖1C）、LVFS%降低（=0.0072，圖1D）、LVIDs升高（=0.0146，圖1E）、LVIDd 降低（=0.0030，圖1F）。與CLP 組相比，CLP+Fer-1 組LVEF%升高（=0.0382，圖1C）、LVFS%升高（=0.0246，圖1D）、LVIDs降低（=0.0120，圖1E）、LVIDd升高（=0.0135，圖1F）。

1 《草原與草坪》從未設(shè)立其他采編點或分支機構(gòu)， 也從未委托任何單位或個人編輯出版《草原與草坪》 雜志。

1.2 實驗動物

本研究應用多菌膿毒癥動物模型金標準——CLP誘導小鼠膿毒癥心肌損傷的發(fā)生。結(jié)果顯示，在CLP誘導的膿毒癥小鼠模型中，心肌纖維損傷嚴重，部分線粒體腫脹；部分線粒體皺縮，嵴斷裂，呈現(xiàn)鐵死亡的表現(xiàn)；心動超聲顯示心臟收縮和舒張功能減弱，血清炎癥因子TNF-α和組織鐵含量升高明顯，同時依賴于谷胱甘肽的鐵死亡關(guān)鍵蛋白GPX4 蛋白和不依賴于谷胱甘肽的FSP1蛋白表達水平均明顯降低，提示小鼠膿毒癥誘導心肌損傷顯著，發(fā)生炎癥反應，并伴有鐵超載和不同途徑鐵死亡的發(fā)生。

1.3 小鼠CLP術(shù)膿毒癥模型建立及分組

小鼠隨機分為3個實驗組，10只/組。CLP組小鼠手術(shù)前12 h禁食不禁水。腹腔注射8%水合氯醛（0.1 mL/20 g）麻醉小鼠，腹部做縱向切口，依次剪開小鼠皮膚、腹肌進入腹腔。剪開2 cm 的切口，以定位和外化盲腸。小心分離盲腸以避免血管損傷，采用非吸收縫線結(jié)扎盲腸后1/3處，然后用18-G針從結(jié)扎到盲腸末端從腸系膜向反腸系膜方向穿孔2次，并擠出少量腸內(nèi)容物。術(shù)后盲腸被放回腹腔，消毒后將腹肌和皮膚依次閉合。皮下注射生理鹽水（1 mL/20 g）進行復蘇。CLP 模型在15 min內(nèi)完成。假手術(shù)（Sham）組小鼠除盲腸不結(jié)扎穿孔外，其余操作相同。CLP+Fer-1組在進行CLP手術(shù)前1 h腹腔注射濃度為5 mg/mL的Fer-1（5 mg/kg），其余操作與CLP組相同。

柳紅踏著三輪車從鎮(zhèn)上賣完西瓜回來，穿過蘇秋琴家的玉米地，就看到自家瓜地里的賊。好你個偷瓜賊！今天總算給我候著了。這幾天柳紅也不知怎么搞的，心里煩躁得很，跟火燒火燎似的，無法消停；這會兒瞧見有人偷她家的瓜，那還得了啊，心頭的火焰就噌地竄房頂了，她跳下三輪車來，迅速退回到玉米地前。隨即她就丟下三輪車，一頭鉆進蘇秋琴的玉米地。她從玉米地里包抄過去，今天要是捉不到賊，她就不姓柳！

1.4 超聲心動圖評估小鼠左心室結(jié)構(gòu)和功能

術(shù)后24 h吸入1%的異氟烷麻醉小鼠，剃除小鼠胸前區(qū)毛發(fā)，然后使用配備30 MHz的MS-400超聲探頭的Vevo2100 超高分辨率小動物超聲系統(tǒng)（VisualSonics）進行評估。在M型超聲模塊下檢測心率、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）等，計算左心室射血分數(shù)（LVEF%）和縮短分數(shù)（LVFS%），每只小鼠至少取3個心動周期，反映小鼠心臟的舒張和收縮功能。

1.5 心肌組織H&E染色觀察心肌形態(tài)變化

馬克思認為，“在無產(chǎn)階級和資產(chǎn)階級的斗爭所經(jīng)歷的各個發(fā)展階段上，共產(chǎn)黨人始終代表整個運動的利益”[14]P285，“他們沒有任何同整個無產(chǎn)階級的利益不同的利益”[14]P285，而是要“為絕大多數(shù)人謀利益”，為建設(shè)共產(chǎn)主義社會而奮斗。學習馬克思主義這一思想，就要始終同人民在一起，為人民利益而奮斗。永葆共產(chǎn)黨人政治本色，把黨建設(shè)成為始終走在時代前列、人民衷心擁護、勇于自我革命、經(jīng)得起各種風浪考驗、朝氣蓬勃的馬克思主義執(zhí)政黨?！八膫€偉大”“四個意識”“堅持把黨的政治建設(shè)擺在首位，堅持和加強黨的全面領(lǐng)導”等思想的提出都是馬克思主義這一思想在新的歷史條件下的新境界。

術(shù)后24 h，收集新鮮的心肌組織樣本，在PBS中泵出血液，4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，將固定的心肌組織切片（0.5 mm），蘇木精-伊紅染色，光鏡下（Nikon Eclipse E100）分析心肌組織結(jié)構(gòu)變化。

1.6 透射電子顯微鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化

取收集的心肌組織按重量體積比1 g∶9 mL的比例加入9倍體積的生理鹽水，用勻漿機將標本勻漿充分，2500 r/min，離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明，測定各管吸光度（A），計算組織鐵含量。

1.7 ELISA法檢測各組小鼠血清中炎癥因子TNF-α的表達

術(shù)后24 h收集小鼠全血放置2 h后，4 ℃低溫離心機中1000×離心15 min，取上清液，每個樣本吸取50 μL血清再加入50 μL的樣品稀釋液。按照試劑盒說明，按步驟測量各孔的吸光度（A），計算出各組血清TNF-α的濃度。

1.8 比色法測定組織鐵（Fe）的含量

術(shù)后24 h，取出小鼠心臟，在PBS中泵出血液，3 min內(nèi)取小鼠心尖組織約1 mm，立即放入提前裝好2.5%戊二醛電鏡固定液的離心管內(nèi)，4 ℃保存，組織在1%鋨酸避光室溫固定2 h，室溫脫水、滲透包埋、聚合后超薄切片（70 nm）、染色，在透射電子顯微鏡（HITACHI，HT7800）下觀察，采集不同倍數(shù)下觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)圖像。

1.9 Western blot 檢測各組小鼠心臟組織中Lcn2 和GPX4、FSP1的表達

取每只小鼠約20 mg 心肌組織，加入15 μL/mg RIPA裂解液和0.15 μL/mg PMSF蛋白酶抑制劑提取組織總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液后，定量30 μg上樣，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，山羊抗小鼠Lcn2抗體（1∶1000）、兔抗小鼠GPX4抗體（1∶3000）、兔抗小鼠FSP1抗體（1∶2000）和GADPH抗體（1∶6000）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，然后將膜與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1:8000）和兔抗山羊二抗（1∶8000）孵育1 h，TBST 洗膜4 次，發(fā)光化學發(fā)光成像系統(tǒng)（FluorChem M）曝光、顯影。Image J軟件分析各組蛋白表達水平。

1.10 統(tǒng)計學處理

在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中，氧自由基（ROS）的過度積累和炎性細胞因子如TNF-α的爆發(fā)在心肌損傷發(fā)病機制中占有重要地位，TNF-α可進一步誘導炎癥級聯(lián)反應，導致ROS過度增加，加劇心肌損傷的嚴重程度。長期以來細胞凋亡和焦亡被認為是膿毒癥誘導心肌損傷的主要形式。本研究關(guān)注于與鐵離子代謝密切相關(guān)的一種細胞死亡方式—鐵死亡。鐵死亡是一種鐵依賴性的程序性細胞死亡方式，主要由細胞內(nèi)鐵過載和脂質(zhì)過氧化所引發(fā)。鐵死亡時大量積累的脂質(zhì)ROS攻擊磷脂雙分子層，破壞細胞膜正常結(jié)構(gòu)和完整性。而GPX4是機體內(nèi)清除脂質(zhì)ROS所需的關(guān)鍵酶。當相關(guān)損傷因素誘發(fā)細胞膜上谷氨酸-胱氨酸的轉(zhuǎn)運受阻，引發(fā)GPX4 活性缺失，使其清除ROS 的能力下降，脂質(zhì)ROS堆積，加劇鐵死亡的發(fā)生。因此，GPX4 蛋白表達水平可反應鐵死亡的發(fā)生。FSP1 是一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性強效鐵死亡抑制因子，其不同于經(jīng)典的谷胱甘肽依賴性保護途徑，是通過抗氧化劑輔酶Q（CoQ）的還原形式（CoQ-H2）保護細胞免于鐵死亡。FSP1的肉豆蔻酰化使CoQ定位于質(zhì)膜，介導NADH 依賴性輔酶Q的減少，產(chǎn)生親脂性自由基捕獲抗氧化劑，進一步阻止脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥心肌損傷小鼠模型心臟超聲的變化

異氟烷（EZVET）；水合三氯乙醛（上海麥克林生物醫(yī)藥有限公司）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（CUSABIO）；組織鐵測定試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；Ferrostatin-1（sigma）；BCA試劑盒（碧云天）；兔抗小鼠GPX4 抗體（Abcam）；山羊抗小鼠Lcn2抗體（R&D systems）；兔抗小鼠FSP1抗體（Proteintech）；兔抗小鼠GAPDH 抗體（Absin）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（Biosharp）和兔抗山羊二抗（博士德）。

2.2 光鏡和電鏡下觀察各組小鼠心肌形態(tài)學和超微結(jié)構(gòu)的變化

小鼠心臟HE染色顯示，Sham組心肌纖維細胞完整，排列整齊，無壞死和炎癥細胞浸潤，心肌橫紋清晰可見，排列較整齊，細胞核為深藍色（圖2）。CLP組心肌纖維斷裂、心肌橫紋模糊，部分消失，間質(zhì)水腫，有紅細胞滲出，炎癥浸潤，細胞核為淡藍色。CLP+Fer-1組肌絲排列較整齊，無炎性浸潤和紅細胞滲出。電鏡下觀察顯示，Sham組線粒體排列整齊，膜完整，心肌纖維完整，排列整齊，閏盤、Z線清晰可見（圖3）。CLP組可見線粒體排列紊亂，部分線粒體腫脹變性，嵴減少、斷裂，外膜部分溶解消失，部分線粒體變小，密度增高，心肌纖維斷裂，肌絲束分離，Z線模糊。CLP+Fer-1組相較于CLP組線粒體損傷減輕，膜較完整，但線粒體仍有嵴斷裂和腫脹，心肌纖維排列較整齊。

2.3 各組小鼠血清中炎癥因子TNF-α和組織鐵的變化

與Sham 組相比，CLP 組血清中TNF-α含量升高（=0.0016，圖4A）、心肌組織鐵含量升高（=0.0086，圖4B）。與CLP 組相比，CLP+Fer-1 組TNF-α含量降低（=0.0118，圖4A）、組織鐵含量降低（=0.0212，圖4B）。

2.4 Western blot 檢測各組小鼠心臟組織中GPX4、FSP1和Lcn2的表達

與Sham 組相比，CLP 組Lcn2 蛋白表達升高（＜0.001，圖5A）、鐵死亡相關(guān)蛋白GPX4 表達降低（＜0.001，圖5A）、FSP1表達降低（＜0.01，圖5B）。與CLP組相比，CLP+Fer-1組Lcn2蛋白表達降低（＜0.01，圖5A）、GPX4蛋白表達升高（=0.0076，圖5A），F(xiàn)SP1蛋白表達升高（=0.035，圖5B）。

綜上所述，在農(nóng)村中學開展校園足球能夠很好地提高學生對足球的學習興趣，促進學生全面發(fā)展，豐富農(nóng)村學校大課間活動和課外活動內(nèi)容，提升農(nóng)村學校文化內(nèi)涵，進而有效促進農(nóng)村中學體育教學的發(fā)展。

3 討論

采用GraphPad Prism 9進行統(tǒng)計處理，定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，并用Tukey檢驗進行組間比較。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

8周齡SPF級雄性C57BL/6J雄性小鼠30只（體質(zhì)量18～22 g）（河南斯克貝斯生物科技股份有限公司）。本研究經(jīng)動物倫理委員會許可，動物的護理和處理嚴格遵守《實驗動物管理條例》進行。

鐵死亡抑制劑Fer-1通過抗氧化作用清除機體內(nèi)ROS，抑制脂質(zhì)過氧化，抵抗鐵死亡，減少細胞中不穩(wěn)定鐵的產(chǎn)生。為進一步分析鐵死亡在膿毒癥心肌損傷中的作用，本研究使用Fer-1進行干預，結(jié)果顯示：與CLP組相比，CLP+Fer-1組鐵含量降低、GPX4和FSP1蛋白表達升高的同時，心肌纖維與線粒體的損傷明顯減輕，TNF-α水平降低，心肌收縮和舒張功能有所恢復，表明抑制鐵死亡可減輕心肌組織學損傷和炎癥反應。Fer-1常被認為防止由GPX4 抑制、gpx4缺失或谷胱甘肽消耗引起的鐵死亡的機制。本研究提示其也可能通過上調(diào)FSP1 來有效抑制鐵死亡，從而抑制脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生，發(fā)揮其對膿毒癥心肌損傷的保護作用。

鐵超載是鐵死亡發(fā)生的重要原因之一，已有研究表明Lcn2 在生理和炎癥條件下可以作為一種關(guān)鍵鐵調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮作用。當細菌侵入體內(nèi)時分泌多種毒性因子，使其能夠在哺乳動物體內(nèi)維持生長和繁殖，機制之一是合成和分泌鐵載體如腸桿菌素，并從含鐵化合物如轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白中獲取鐵。Lcn2由宿主分泌，與含鐵腸桿菌素以極高的親和力結(jié)合，競爭性獲得鐵并阻止細菌通過這種方式攝取鐵。Lcn2蛋白的無鐵形式通過捕獲的鐵與這些鐵載體結(jié)合，形成與細菌死亡相關(guān)的holo-Lcn2復合體（鐵-鐵載體-Lcn2復合體，全鐵形式），從而保護機體免受細菌侵害。盡管Lcn2能夠通過該途徑剝奪細菌生長所必需的鐵，但holo-Lcn2通過與其受體24p3R/megalin結(jié)合內(nèi)化，轉(zhuǎn)運和釋放鐵到細胞質(zhì)中，增加細胞內(nèi)鐵的水平。在多菌膿毒癥發(fā)生的情況下，這種運載機制可能失調(diào)，大量鐵通過此通路進入細胞內(nèi)，引起細胞內(nèi)的鐵超載。本研究同時觀察到膿毒癥發(fā)生時，心肌細胞GPX4表達下降，清除脂質(zhì)ROS能力下降，加劇了細胞內(nèi)鐵對機體的損害。為進一步明確Lcn2是否參與膿毒癥心肌損傷鐵死亡的發(fā)生，我們同時測定了Lcn2蛋白表達的變化，觀察到CLP組鐵增高和鐵死亡發(fā)生時，Lcn2蛋白表達升高，提示Lcn2可能通過誘導鐵的釋放促進鐵死亡的發(fā)生；而與CLP組相比，CLP+Fer-1組中，Lcn2蛋白表達也降低，提示抑制鐵死亡也降低了Lcn2蛋白的表達，但鐵含量的下降是否來自于Fer-1對Lcn2的調(diào)控還有待進一步深入探討。

關(guān)于Lcn2對鐵死亡的影響多見于腫瘤相關(guān)報道，Lcn2 過表達通過抑制鐵死亡促進大腸癌的進展；NUPR1介導的Lcn2表達通過減少鐵積累和氧化損傷阻止胰腺癌細胞鐵死亡的發(fā)生，這與我們的研究結(jié)果似乎相悖。但在多柔比星誘導的心肌病中，敲除Lcn2基因能夠降低多柔比星誘導的氧化應激損傷；Lcn2敲除減少了紅藻氨酸誘導的小鼠海馬鐵過載和氧化應激，降低了鐵死亡標志蛋白環(huán)氧合酶的表達，Lcn2增多可能促進了鐵的增加及鐵死亡，加重神經(jīng)炎癥，與本研究結(jié)果一致。以上報道提示在腫瘤發(fā)生和臟器炎癥損傷中，Lcn2與鐵死亡之間的關(guān)系可能不一致，還有待進一步深入探究。

[17][18][20][21][22]何中華：《人的存在的現(xiàn)象學之真理觀》，《煙臺大學學報(哲學社會科學版)》2017年第5期。

綜上所述，來源于GPX4、FSP1不同途徑的鐵死亡參與CLP誘導的膿毒癥心肌損傷，抑制鐵死亡可通過減輕炎癥反應、降低Lcn2 蛋白表達和組織鐵含量減輕CLP誘導的心肌損傷。鐵死亡有可能成為膿毒癥心肌損傷新的治療靶點。本研究還關(guān)注到Lcn2在心肌損傷鐵死亡中高表達，未來其是否能作為心肌損傷新的生物標志物和其發(fā)生機制還待進一步探討。

提高學生學習興趣，可幫助學生改善學習效率，并使生物成績快速提升。在教學實踐中，教師可通過引導學生觀察大自然的方式提升學生對于生物課程的興趣。首先教師可利用假期時間，邀請學生進入到大自然中開展活動，在活動中，教師可開展相關(guān)的生物實驗，以幫助學生認識到大自然的魅力與生物的多樣性。之后教師可組織學生在課堂中將活動的體會進行分享。通過這樣的活動學生將對自然環(huán)境產(chǎn)生新的認識，并將在教師的引導下對生物課程產(chǎn)生較為濃厚的興趣。