唐氏綜合征胎兒羊水外泌體miRNA差異表達(dá)譜分析

唐氏綜合征（DS）又名21三體綜合征，是最常見(jiàn)的出生缺陷疾病之一，其在活產(chǎn)嬰兒中的發(fā)病率約為1/1000～1/1100，臨床表現(xiàn)為特殊面容和輕度至中度的智力障礙，部分患者合并先天性心臟病、兒童白血病、胃腸道畸形等。此外，幾乎所有的DS患者在30多歲時(shí)其神經(jīng)系統(tǒng)還會(huì)出現(xiàn)阿爾茲海默樣病變，并最終發(fā)展為早發(fā)性老年癡呆。

羊水是指羊膜腔內(nèi)包圍胎兒的液體，為胎兒提供物理保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。在不同胎齡時(shí)，羊水的組成是動(dòng)態(tài)的，內(nèi)含許多重要的生物分子，如胎兒脫落細(xì)胞、DNA、RNA和代謝產(chǎn)物，可反映胎兒自身的發(fā)育情況。臨床上正是通過(guò)遺傳學(xué)分析羊水中的胎兒脫落細(xì)胞，以此判斷胎兒是否罹患DS。然而，羊水中miRNA在DS胎兒發(fā)育中的作用卻很少受到關(guān)注。

外泌體是由多種細(xì)胞分泌的40～100 nm的膜性小囊泡，由細(xì)胞內(nèi)多泡體出芽形成，再與細(xì)胞膜融合后釋放至細(xì)胞外基質(zhì)中。羊水中游離的miRNA可選擇性組裝到外泌體中，外泌體通過(guò)未角化的胎兒皮膚從羊水傳遞到胎兒，在細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要作用。Sun等采用芯片技術(shù)檢測(cè)妊娠13、15、17 d的小鼠羊水中miRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與妊娠13、15 d小鼠相比，妊娠17 d小鼠羊水中有162個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)、71個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)以及靶基因GO分析和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)最富集的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路都與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)。提示羊水外泌體miRNA參與調(diào)控胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。孕中期正是胎兒神經(jīng)元發(fā)育的活躍階段，而DS最主要的表型就是先天智力低下，但羊水外泌體miRNA在DS胎兒發(fā)育中的變化和作用，目前為止國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。由此我們推測(cè)：在DS胎兒發(fā)育中期，羊水外泌體miRNA表達(dá)譜異常，miRNA通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，在DS胎兒神經(jīng)系統(tǒng)異常發(fā)育中起重要作用。

參考文獻(xiàn)[3-6]的配方和工藝略加修改，最終確定麻辣牛肉丁的配方(見(jiàn)表1)：精鹽2.5%，雞精1.4%，白糖1.5%，花椒1.5%，醬油1%，料酒1%，復(fù)合磷酸鹽0.4%，五香粉0.5%，味精1%，辣椒粉3.5%。

為此，本研究擬首先觀察DS胎兒和正常胎兒羊水外泌體中miRNA表達(dá)譜變化并對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，然后采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證miRNA，最后采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA和靶基因的調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步研究DS的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2021年3月～2021年5月于貴州省產(chǎn)前診斷分中心進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦。納入標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)翁ト焉铮状稳焉?，無(wú)創(chuàng)高危，孕周（18～23），無(wú)其他身體疾病，本研究經(jīng)貴陽(yáng)市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且所有參與者均已簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：通過(guò)輔助生殖手段受孕者；不良孕產(chǎn)史；合并惡性腫瘤、重度高血壓、糖尿病及慢性心腦血管病。經(jīng)羊水穿刺、羊水細(xì)胞培養(yǎng)-染色體顯帶技術(shù)證實(shí)胎兒為正常整倍體的20例、為DS的20例，兩組孕婦基本情況見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 羊水外泌體的分離 于超凈臺(tái)中將留取的DS胎兒羊水及對(duì)照組羊水25 mL分別加入到50 mL的離心管中，300 g，4 ℃離心10 min，取上清，2000，4 ℃離心10 min，留上清，10 000，4 ℃離心30 min，取上清，100 000，4 ℃離心70 min，取透明沉淀，并用200 μL的PBS重懸，所得即為外泌體溶液。

1.2.3 外泌體miRNA測(cè)序 使用miRNeasy Micro Kit（Qiagen）提取外泌體總RNA。小RNA測(cè)序文庫(kù)制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits（Illumina）試劑盒。文庫(kù)制備工作完成后，對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)使用Illumina Hiseq2000/2500進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為單端1×50 bp。對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)產(chǎn)出進(jìn)行過(guò)濾得到Valid數(shù)據(jù)，并對(duì)Valid數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的miRNA比對(duì)鑒定。

通過(guò)TargetScan、miRanda兩種軟件，對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，兩種軟件同時(shí)預(yù)測(cè)到的靶基因有9477個(gè)。經(jīng)過(guò)對(duì)靶基因篩選，發(fā)現(xiàn)這些miRNA都能靶向DS關(guān)鍵區(qū)段上的基因（表3）。GO分析發(fā)現(xiàn)富集的靶基因主要定位在膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體、高爾基體、胞內(nèi)囊泡，主要功能與蛋白結(jié)合、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、ATP結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、突觸等有關(guān)（圖2A）；Pathway通路分析發(fā)現(xiàn)富集相對(duì)顯著的功能通路主要為癌癥、軸突導(dǎo)向、鞘脂信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、自噬等（圖2B）。

BACH1 3'UTR-NC+let-7d-5p、BACH1 3'UTR-WT+let-7d-5p-NC、BACH1 3′UTR-WT+let-7d-5p、BACH1 3'UTR（MUT1+MUT2）+let-7d-5p-NC、BACH1 3'UTR（MUT1+MUT2）+let-7d-5p，各轉(zhuǎn)染組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量分別為：3'UTR 熒光素酶質(zhì)粒0.2 μg、miRNA 質(zhì)粒終濃度100 nmol/L，具體操作按lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后按Dual-Luciferase Reporter Assay System說(shuō)明書進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

1.2.2.2 ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀檢測(cè)外泌體濃度粒徑 去離子水清洗樣本池，聚苯乙烯微球（110 nm）校準(zhǔn)儀器，用1×PBS buffer 清洗樣本池后上機(jī)（Particle Metrix，ZetaView PMX 110）檢測(cè)。

測(cè)序結(jié)果顯示，DS組與對(duì)照組存在15個(gè)差異表達(dá)的miRNA。其中7個(gè)miRNA上調(diào)，包括：miR-329-3p、PC-3p-58054、miR-30a-5p、miR-877-5p、miR-361-5p、miR-323a-3p、miR-363-3p；8 個(gè)miRNA 表達(dá)下調(diào)，包括：miR-140-3p、let-7d-5p、PC-5p-15468、PC-5p-155238、PC-3p-119358、PC-5p-93415、PC-3p-22218、mir-4512-p3（表2）。

前幾天，我和幾個(gè)同學(xué)聚會(huì)，十多年未見(jiàn)面了，大家都異常興奮，在茶香氤氳的包間里，彼此親切地詢問(wèn)著對(duì)方的近況。多年不見(jiàn)，昔日青澀懵懂的學(xué)友，如今都已成熟睿智，我們談起了各自的生活，都想從別人那里尋找一些幸福感。

3.口腔內(nèi)的創(chuàng)面沒(méi)有愈合，飲酒是會(huì)出現(xiàn)疼痛的，這是常人不愿意忍受的。因此，咬傷后每天喝酒不一定是符合事實(shí)的。

1.2.4 生物信息學(xué)分析靶基因 使用TargetScan、miRanda兩款軟件對(duì)顯著性差異的miRNA分別進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。使用R包c(diǎn)lusterProfiler對(duì)靶基因進(jìn)行功能分析（GO）和信號(hào)通路分析，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算其中最為顯著的靶基因?！?.05作為顯著靶基因的閾值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組樣本均數(shù)比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的檢驗(yàn)，以＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6 通過(guò)雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)let-7d-5p 對(duì)BACH1的抑制作用 采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)let-7d-5p可能調(diào)控的靶基因，篩選并評(píng)估let-7d-5p 靶向調(diào)控BACH1 的可能性。從Pubmed 基因庫(kù)中獲取人BACH1基因3'UTR序列（NM_001186.4），設(shè)計(jì)并化學(xué)合成涵蓋let-7d-5p作用位點(diǎn)的BACH1基因3'UTR野生型與突變型片段，BACH1-3'UTR-WT 與let-7d-5p結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變處理即為BACH1-3'UTR（MUT1+MUT2）基因片段。用 于BACH1-3'UTR-WT 與BACH1-3'UTR（MUT1+MUT2）基因片段PCR擴(kuò)增的引物為BACH1-Fp：5'-GAGGAGTTGTGTTTGTGG AC-3'；BACH1-Rp：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'，PCR 產(chǎn)物兩端分別為MluI 及HindIII 酶切位點(diǎn)。BACH1基因3'UTR 野生型與突變型片段擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切鑒定，與H306 雙熒光素酶報(bào)告載體進(jìn)行酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，挑選陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行雙酶切鑒定及測(cè)序。鑒定正確的BACH1基因3'UTR野生型與突變型重組雙熒光素酶基因報(bào)告載體命名為BACH1 3'UTR（WT）及BACH1 3'UTR（MUT1+MUT2）。制備對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T細(xì)胞懸液，將細(xì)胞按70%的匯合度接種到96孔板，將3'UTR雙熒光素酶質(zhì)粒（BACH1 3'UTR-NC、BACH1 3'UTRWT、BACH1 3'UTR（MUT1+MUT2））與miRNA質(zhì)粒（let-7d-5p、let-7d-5p-NC）兩兩組合共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，形成6個(gè)共轉(zhuǎn)染組：BACH1 3'UTR-NC+let-7d-5p-NC、

1.2.2.1 醋酸雙氧鈾負(fù)染透射電鏡觀察外泌體形態(tài) 將提取的外泌體樣本從-80 ℃冰箱取出后置放于冰盒中，溶解后稍離心，使用移液槍吸取15 μL的外泌體樣本于銅網(wǎng)上靜置1 min。使用濾紙將銅網(wǎng)上的外泌體樣本吸干，然后使用移液槍吸取15 μL的2%醋酸雙氧鈾染色液室溫染色1 min。使用濾紙將銅網(wǎng)上的外泌體樣本吸干，將染色完成的樣本放于燈下烤10 min，于透射電鏡（FEI，G2 spititi）觀察拍照，保存圖片。

1.2.5 qPCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果 挑選3個(gè)靶向DS關(guān)鍵區(qū)域基因最多的miRNA 進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證。分離羊水外泌體、提取RNA，對(duì)目的miRNA設(shè)計(jì)引物、探針，以rRNAU6 為內(nèi)參，序列如下:miR-140-3p-F：ACGACCACA GGGTAGAACC，miR-140-3p-R：TTCGCACTGGAT ACGACGTCCGT；let-7d-5p-F：AAGGCGGAGAGGT AGTAGG，let-7d-5p-R：TTCGCACTGGATACGAC AACTATGCA；mir-4512-p3-F：CCGCCTCACTGTGT CG，mir-4512-p3-R：TTCGCACTGGATACGACGCC TG；U6-S：CTCGCTTCGGCAGCACA，U6-A：AACG CTTCACGAATTTGCGT。上樣體系：cDNA3 μL，qPCR Buffer 10 μL，Primer Mix（2 μmol/L）2 μL，ddHO 5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃、5 s；58 ℃，30 s；50 個(gè)循環(huán)。采用ΔΔCt 方法對(duì)miR-140-3p、let-7d-5p、miR-4512 表達(dá)水平定量分析。

2 結(jié)果

2.1 羊水外泌體鑒定

透射電鏡下可見(jiàn)兩組羊水外泌體直徑在30～200 nm之間，呈圓形或橢圓形的囊泡狀結(jié)構(gòu)（圖1A），ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀顯示羊水外泌體粒徑分布峰值為143.1 nm（圖1B），符合外泌體形態(tài)特征。Western blotting檢測(cè)兩組羊水外泌體標(biāo)志蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組羊水外泌體均表達(dá)CD9、CD63、HSP70、TSG101，且表達(dá)水平一致（圖1C）。

隧洞混凝土由混凝土拌和系統(tǒng)拌制混凝土，混凝土由混凝土罐車運(yùn)輸，混凝土泵輸送混凝土入倉(cāng)，分層鋪料。側(cè)墻頂拱采用邊掛模板邊澆筑。底板混凝土澆筑直接入倉(cāng)，軟軸振搗器振搗，人工找平收面。

2.2 兩組羊水外泌體miRNA差異表達(dá)情況

1.2.2.3 外泌體標(biāo)志蛋白的檢測(cè) 按照BCA蛋白測(cè)定試劑盒（Pierce BCA Protein assay Kit，Thermo）說(shuō)明書提取外泌體總蛋白。取80μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE（12%），電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉90 min，分別加入Anti-CD9（abcam，1∶1000）抗體、Anti-HSP70（SANTA，SC-24，1∶500）抗體、Anti-CD63（abcam，1∶1000）抗體、Anti-TSG101（abcam，Ab125011，1∶1000）抗體，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。第2天用TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（碧云天1∶4 000），室溫孵育90 min，TBST 洗膜3 次，ECL（Share-bio，SB-WB011）發(fā)光成像。用Image Lab圖像分析軟件對(duì)每個(gè)條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

2.3 生物信息學(xué)分析靶基因

1.2.2 羊水外泌體的鑒定

2.4 qPCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果

DS 組miR-140-3p、let-7d-5p 較對(duì)照組顯著降低（＜0.05），與測(cè)序結(jié)果一致。miR-4512較對(duì)照組顯著增加（＜0.05），與測(cè)序結(jié)果相反（圖3）。

范冰冰的出道，源于參演一部叫《女強(qiáng)人》的電視劇。當(dāng)年只有15歲的她，只參與拍攝了三天的戲。放在今天，也就是跑龍?zhí)椎?。但范冰冰的演藝?jīng)歷赫然寫著：1996年，范冰冰參與拍攝劉雪華與邵兵主演的電視劇《女強(qiáng)人》。這就像在北京的打工仔，稱自己參與首都建設(shè)差不多。不出名時(shí)可以理解，出了名還這樣做，說(shuō)明這三天短暫的拍攝對(duì)她之后的演藝事業(yè)足夠重要。

2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果

質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果如圖4顯示：let-7d-5p對(duì)空載體幾乎沒(méi)有作用；和空載組相比，let-7d-5p可以調(diào)控BACH1 帶有3'UTR的luciferase的表達(dá)（＜0.001），下降62.08%；而在結(jié)合位點(diǎn)突變后，這種調(diào)控關(guān)系明顯減弱（＜0.001），回升33.75%。

3 討論

本研究首次分析DS胎兒和正常胎兒羊水外泌體中miRNA表達(dá)譜，探索在DS胎兒發(fā)育過(guò)程中可能起調(diào)控作用的外泌體miRNA。測(cè)序結(jié)果顯示，與正常胎兒相比，DS 胎兒羊水外泌體miRNA 表達(dá)譜發(fā)生改變。Xie等應(yīng)用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，先天性梗阻性腎病胎兒的羊水外泌體中miR-300和miR-299-5p表達(dá)降低，且這兩個(gè)miRNA的靶基因主要參與Wnt信號(hào)通路，而Wnt信號(hào)通路已證實(shí)與腎纖維化有關(guān)，提示miR-300和miR-299-5p可能是先天性梗阻性腎病產(chǎn)前診斷的生物標(biāo)志物。由于外泌體源性的miRNA比細(xì)胞中普遍存在的miRNA更為穩(wěn)定，提示本研究中觀察到的差異表達(dá)的羊水外泌體miRNA可能是DS產(chǎn)前診斷新的標(biāo)記物。

大部分農(nóng)村目前都已經(jīng)修建了村村通的公路，加之當(dāng)下種類多樣的交通工具，交通十分快速便捷。以平原地區(qū)來(lái)說(shuō)，在5平方公里左右的范圍內(nèi)設(shè)立一個(gè)村鎮(zhèn)是可以滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求的。而在山區(qū)當(dāng)中的這個(gè)范圍可以縮至1.5平方公里的范圍左右。當(dāng)前我國(guó)鄉(xiāng)村當(dāng)中，大部分新鄉(xiāng)鎮(zhèn)的人口都不低于千人，甚至人口較多的，會(huì)在1萬(wàn)人或萬(wàn)人往上。在這樣的人口密度的情況下，村鎮(zhèn)居民進(jìn)行集中居住，有利于擴(kuò)大村鎮(zhèn)居民的活動(dòng)范圍，增加村鎮(zhèn)居民的信息量，促進(jìn)居民間的來(lái)往，這正是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)逐漸趨向于集約化以及專業(yè)化所需要的。而集中居住的另一個(gè)好處是能夠是農(nóng)業(yè)發(fā)展往市場(chǎng)農(nóng)業(yè)和產(chǎn)業(yè)農(nóng)業(yè)的方向轉(zhuǎn)變，是農(nóng)業(yè)發(fā)展多元化，促進(jìn)新農(nóng)村的生產(chǎn)力。

我們對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因篩選，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA或多或少都能靶向DS關(guān)鍵區(qū)段上的基因，與DS表型息息相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)靶基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)主要定位在膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體、高爾基體、胞內(nèi)囊泡，主要功能與蛋白結(jié)合、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、ATP結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、突觸等有關(guān)。從靶基因在各種細(xì)胞器膜和胞內(nèi)囊泡定位的情況看，這些miRNA可能與羊水外泌體的形成和釋放有關(guān)。此外，還有一個(gè)不能忽略的功能類別——突觸，“突觸”是一個(gè)神經(jīng)元的沖動(dòng)傳到另一個(gè)神經(jīng)元或傳到另一細(xì)胞間的相互接觸的結(jié)構(gòu)，而DS患者的突觸數(shù)量明顯減少，由此推測(cè)DS 患者在胎兒期，其突觸發(fā)育可能異常。Pathway分析發(fā)現(xiàn)富集相對(duì)顯著的通路主要為癌癥、軸突導(dǎo)向、鞘脂信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、自噬等。值得注意的是，其中部分通路已證實(shí)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有著密切的聯(lián)系，例如：軸突導(dǎo)向和Ras 信號(hào)通路。軸突導(dǎo)向是指在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)元的軸突只有精確的抵達(dá)其目標(biāo)位置才能形成具有正常生理功能的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向分子可與受體形成復(fù)合物，引導(dǎo)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的方向，但當(dāng)缺乏軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向分子時(shí)，位于DS關(guān)鍵區(qū)段的唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子可和受體形成受體復(fù)合物，該復(fù)合物通過(guò)激活Ras信號(hào)通路引起細(xì)胞骨架蛋白系統(tǒng)的重組，從而介導(dǎo)軸突生長(zhǎng)錐生長(zhǎng)，但在DS患者中，由于多了1條21號(hào)染色體，導(dǎo)致DS關(guān)鍵區(qū)段上的唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子的過(guò)度表達(dá)，從而擾亂軸突導(dǎo)向，最終導(dǎo)致DS患者神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)異常。

測(cè)序技術(shù)的引入促使miRNA研究領(lǐng)域進(jìn)入快速發(fā)展階段，但該技術(shù)只適合初篩，后續(xù)還需可靠性更好的qPCR技術(shù)驗(yàn)證。我們采用qPCR對(duì)靶向DS關(guān)鍵區(qū)段最多的3 個(gè)miRNA 進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DS 組中miR-140-3p、let-7d-5p表達(dá)較對(duì)照組降低，與測(cè)序結(jié)果一致，而miR-4512表達(dá)較對(duì)照組增加，與測(cè)序結(jié)果相反。分析原因可能是沒(méi)有用同一批樣品進(jìn)行兩種實(shí)驗(yàn)，同類型樣本進(jìn)行的驗(yàn)證差異原因主要是個(gè)體之間的差異，特別是異質(zhì)性非常高的疾病。

康復(fù)護(hù)理通過(guò)全程的心理干預(yù)，扭轉(zhuǎn)患者的消極、負(fù)面情緒，提高患者的康復(fù)能動(dòng)性及自我效能感，為康復(fù)訓(xùn)練奠定了堅(jiān)固的思想基礎(chǔ)；通過(guò)飲食干預(yù)與血糖監(jiān)測(cè)，在積極控制血糖水平的同時(shí)促進(jìn)患者搭建科學(xué)、合理的糖尿病飲食結(jié)構(gòu)，為患者血糖的長(zhǎng)期控制提供了方法與指導(dǎo)，促使患者以“五架馬車”并行模式進(jìn)行糖尿病的有效控制；通過(guò)專業(yè)的按摩手法，刺激患者患肢肢體感覺(jué)，加速局部血液循環(huán)，改善神經(jīng)功能，根據(jù)患者具體病情及自理能力進(jìn)行科學(xué)有效、循序漸進(jìn)的康復(fù)運(yùn)動(dòng)，最大程度上恢復(fù)患者的肢體功能。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)let-7d-5p 與BACH1 mRNA 3′UTR有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，且預(yù)測(cè)評(píng)分較高，表明let-7d-5p對(duì)BACH1可能存在靶向調(diào)控作用。BACH1位于21號(hào)染色體，是堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）和CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員。作為一種負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，BACH1能與DNA的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，從而抑制包括血紅素加氧酶-1（HO-1）在內(nèi)的參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。有研究發(fā)現(xiàn)BACH1在DS患者腦皮質(zhì)中的表達(dá)上調(diào)，抑制抗氧化基因HO-1的表達(dá)，使其無(wú)法發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能，從而增強(qiáng)氧化應(yīng)激，加重腦組織損傷。此外，F(xiàn)errando等在DS胎兒大腦皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，由21 號(hào)染色體編碼的4 種蛋白質(zhì)（BACH1、ERG、RUNX1、SIM2）中只有BACH1顯著表達(dá)，但此時(shí)的抗氧化基因HO-1的表達(dá)也是增加的，它還沒(méi)有受到BACH1的抑制，表明DS患者在胎兒期其大腦就已發(fā)生氧化應(yīng)激事件。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因法證實(shí)let-7d-5p可靶向作用于BACH1。結(jié)合let-7d-5p在DS胎兒羊水中的表達(dá)情況，我們推測(cè)DS胎兒腦組織中BACH1表達(dá)上調(diào)，可能與羊水外泌體中攜帶的let-7d-5p有關(guān)，但具體機(jī)制如何，尚需進(jìn)一步研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)DS胎兒與正常胎兒羊水外泌體miRNA表達(dá)譜存在差異。羊水外泌體let-7d-5p可能通過(guò)調(diào)控BACH1的表達(dá)促進(jìn)DS胎兒大腦氧化應(yīng)激，這對(duì)進(jìn)一步闡明該疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要的參考意義。