二氫楊梅素可逆轉SKBR3細胞對赫賽汀的耐藥：基于上調(diào)miR-98-5p抑制IGF1R/HER2二聚體形成

人表皮生長因子受體2（HER2）陽性乳腺癌約占新發(fā)乳腺癌比例的20%～25%，早期研究發(fā)現(xiàn)其與預后不良相關。人源化抗HER2單克隆抗體赫賽汀，是一種有效的抗HER2靶向藥物，極大地提高了HER2陽性乳腺癌患者的生存率，已被寫入診療指南。然而，并不是所有HER2陽性乳腺癌患者對赫賽汀的治療都有良好反應，臨床研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性及獲得性赫賽汀耐藥占30%～50%，失去有效治療后的部分患者最終發(fā)生腫瘤復發(fā)和遠處轉移，占乳腺癌死亡的90%。因此，赫賽汀耐藥成為HER2陽性乳腺癌臨床治療的一個重大障礙。迄今為止，依然缺乏有效預測赫賽汀療效的生物標志物以及克服耐藥的方法。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，赫賽汀耐藥細胞中胰島素樣表皮生長因子1受體（IGF1-R）下游信號通路IGF1R/AKT異常激活，天然黃酮類化合物二氫楊梅素（DMY）可抑制此通路激活，逆轉SKBR3乳腺癌細胞對赫賽汀耐藥。胰島素樣生長因子2（IGF2）是IGF1-R的內(nèi)源性配體，IGF2與IGF-1R特異性結合后，磷酸化特異性胞內(nèi)信號蛋白—胰島素受體底物1（IRS1），激活下游的絲裂原激活的蛋白激酶和磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號轉導，進而調(diào)節(jié)細胞的生長增殖及侵襲轉移。miR-98-5p是一種小分子非編碼MicroRNA，通過生物信息學數(shù)據(jù)庫TargetScan 預測其可靶向結合IGF2 mRNA 3'UTR，而目前對于miR-98-5p通過靶向調(diào)控IGF2表達影響HER2陽性乳腺癌細胞對赫賽汀的敏感性，尚未見報道。

100例患者隨機分組后，觀察組54例，對照組46例，兩組的年齡、性別、病程和文化程度等方面分別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

本研究通過細胞實驗驗證miR-98-5p/IGF2軸對赫賽汀敏感性的影響，然后建立裸鼠異種移植腫瘤模型，進一步探索二氫楊梅素對miR-98-5p/IGF2調(diào)控軸的影響，以及在體內(nèi)逆轉赫賽汀耐藥性的可能機制。為臨床提高HER2陽性乳腺癌赫賽汀治療的療效提供新思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑和細胞

重組人IGF2（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）。Western blot 檢測中使用的主要抗體：IGF2、IRS1、IGF-1R、p-IGF-1R/IR、Akt、p-Akt、p-Akt、S6K、p-S6K、HER2、β-actin（Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）。實驗所用的所有引物均采用Primer3 input設計，南京金斯瑞公司合成。人HER2陽性乳腺癌細胞系SKBR3（ATCC，Manassas，VA），保存在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。耐藥細胞株的培養(yǎng)和鑒定參見本研究組既往研究文獻［5］。

1.2 異種移植腫瘤模型建立

動物實驗獲得蚌埠醫(yī)學院動物保護與使用委員會（IACUC）批準（批準文號：［2020］No.203）。按照IACUC協(xié)議遵循標準的動物飼養(yǎng)和實驗室指南。小鼠被飼養(yǎng)在單獨通風的籠子中，在標準室溫（22 ℃）和濕度（55%）下，光照/黑暗周期為12/12。將腫瘤細胞接種于Balb/C裸鼠（購自蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心）腋窩皮下，產(chǎn)生異種移植瘤。當腫瘤大小達到100 mm時，將小鼠隨機分為：實驗組：二氫楊梅素灌胃（DMY 25 mg·g·d）+腹腔注射赫賽?。?00 μg·g·w）；對照組：腹腔注射赫賽?。?00 μg·g·w）；空白組：腹腔注射PBS；=5/組。治療共6周，每7 d游標卡尺測量一次腫瘤大小，計算腫瘤體積。

1.3 細胞轉染

用含有特異性shRNA的psi-LVRU6GP載體轉染細胞（慢病毒轉染），并用嘌呤霉素（2 μg/mL）篩選，以建立基因敲除或過表達的轉染物。分別使用Lipofectamin 3000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）轉染miRNA模擬物或抑制劑（Ribobio）。

1.4 免疫印跡

RIPA緩沖液從細胞中提取總蛋白。BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。將等量的蛋白質(zhì)與5×Lane Marker還原樣品緩沖液混合，用SDS聚丙烯酰胺凝膠溶解，然后轉移到Immobilon-P 轉移膜（Millipore，Burlington Mass，USA）上。用5%的脫脂牛奶在Tris緩沖鹽水中封閉細胞膜，然后用一抗和二抗孵育。采用增強化學發(fā)光Western blot 檢測試劑盒檢測信號。用ImageJ軟件（v2.0.0）對信號進行密度分析。

1.5 總RNA和miRNA的分離和RT-qPCR

RNA分離試劑盒（QIAGEN，Hilden，Germany）按照說明書從細胞中分離出總RNA。RT-qPCR 采用CFX96 Real-Time PCR 系統(tǒng)（Foster City，California，USA）。采用β-actin作為內(nèi)參。從培養(yǎng)的細胞中分離出miRNAs，并用miRCURY RNA Isolation Kit（Exiqon,Vedbaek,Denmark）純化。miRNA 序列特異性RTPCR引物和內(nèi)源對照RNU6購自GeneCopoeia。通過RNU6歸一化計算相對定量表達。

1.6 細胞增殖及侵襲實驗

使用CellTiter 96AQueous One Solution細胞增殖檢測試劑盒（Promega，Madison，WI，USA）進行細胞增殖（MTS）檢測。用不同濃度的赫賽汀，以2000/孔（0.20 mL/孔）的濃度將細胞接種到96孔板上。MTS孵育第2天測定細胞活力（0.02 mL/孔）。孵育2 h后，在BioTek Synergy 2系統(tǒng)上記錄各孔在490 nm處的吸光度，用以代表細胞活力，并計算各時間點的細胞活力。取處于對數(shù)生長期細胞，經(jīng)過消化、離心、PB5S清洗和無血清培養(yǎng)基重懸。取待測細胞懸液加入Transwell小室，1×10/孔，×24孔板，37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱過夜。取出棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，4%甲醛固定過夜。0.1%結晶紫染色30 min，棉簽輕拭去上層細胞，PBS清洗3遍，顯微鏡拍照（×100），選取3～5個非重復視野，并進行計數(shù)。

1.7 熒光素酶報告實驗

SKBR3-R細胞相較于SKBR3細胞，對赫賽汀的敏感性降低（＜0.01），值分別為220.53±12.21 μg/mL和23.52±2.02 μg/mL（圖1A）。

1.8 免疫共沉淀

免疫沉淀在4 ℃下用特異性Ab或IgG進行過夜（陰性對照）。用蛋白g-瓊脂糖（Amersham Biosciences）孵育免疫沉淀2 h。反應產(chǎn)物用裂解緩沖液洗滌，免疫復合物用SDS-PAGE 進行溶解，進行Western blot 檢測，采用β-actin作為內(nèi)參。

1.9 免疫組化

所有連續(xù)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差表示。利用SPSS 19.0和GraphPad Prism 9進行統(tǒng)計分析和繪圖，組間比較采用檢驗，＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。Kaplan-Meier plotter 生成患者生存曲線（https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast）。

1.10 統(tǒng)計學分析

經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋后的組織切成4 μm切片。在62 ℃干燥2 h后，在二甲苯中分離脫蠟，依次使用等濃度梯度的乙醇處理。經(jīng)過抗原修復，然后用3%過氧化氫在甲醇中處理玻片15 min。采用0.01 mol/L環(huán)酸鈉緩沖液（pH 6.0）微波提取抗原，以達到抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性的目的。在10%山羊血清中預孵育1 h后，將標本與一抗在4 ℃下孵育過夜。根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用了辣根過氧化物酶檢測系統(tǒng)（DAKO，Glostrup，Denmark）。閱片由兩位高年資病理科醫(yī)師獨立完成。

2 結果

2.1 SKBR3及SKBR3-R細胞中IGF2表達及其介導的IGF-1R/IRS1/AKT信號通路激活

將IGF2 mRNA 3'UTR的基因序列克隆到螢火蟲熒光素酶報告基因下游的pMir-Report質(zhì)粒中。將細胞接種到96孔板上，用pMir-Report熒光素酶載體共轉染。轉染48 h后，使用BioTek Synergy 2上的雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)（Promega）測定熒光素酶活性。以Renilla熒光素酶活性作為內(nèi)對照，以Renilla熒光素酶活性歸一化后的SD平均值計算螢火蟲熒光素酶活性。

甘草提取物對雷公藤甲素損傷后人肝L-02細胞中UGT1A、MRP2表達的影響 …………………………… 張 靖等（1）： 65

如蕓看著那一個個蝦仁，沒有一個完整的，樣子都很丑，還有許元生不經(jīng)意間出鏡的大拇指，大概是被蝦鉗刺出了血。她都被他氣樂了，又有點想哭。但她還是忍住了，沒回他的微信。

從一個普通青年成為一名保安，從一名保安又成為一個北大學子，從開始對事物的認識欠全面欠深刻，到現(xiàn)在凡事都有自己的思考和見解，我發(fā)現(xiàn)自己一直在成長在收獲，但其中唯一沒變的就是我的好學。

檢索生物信息學數(shù)據(jù)庫TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72/），預測IGF2 mRNA 的3'-UTR中許多具有保守結合位點的miRNAs。通過context scores和Pct對預測結果的可能性進行評分，其中miR-98-5p具有高靶向結合可能性（圖4）。熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)，miR-98-5p inhibitor增強了SKBR3細胞中野生型報告基因的熒光素酶活性（＜0.05），而不是突變結合位點型（＞0.05）。miR-98-5p mimic抑制了SKBR3-R細胞中野生型報告基因的熒光素酶活性（＜0.05），而不是的突變型的（＞0.05，圖5）。

其實無論是在任何企業(yè)管理中，人才是最為重要的財富，我國旅游業(yè)興起的年限比較短暫，在人才的選用上更是比較欠缺的，也正是因為這個原因，使旅游業(yè)的發(fā)展仍然沒有提升到更高的層次，但是最為缺少的人才還是精通以文化為依托的發(fā)展旅游業(yè)的人才，而且這個缺口是非常大的。

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，SKBR3及SKBR3-R細胞中蛋白相對含量p-IGF1R（0.20±0.101.02±0.43，＜0.01）；p-Akt（0.32±0.121.22±0.34，＜0.01）；p-S6K（0.50±0.151.35±0.60，＜0.05）；PTEN（1.39±0.550.60±0.14，＜0.05）差異均有統(tǒng)計學意義（圖2）。

2.2 IGF1-R/HER2異源二聚體形成

免疫沉淀法結果顯示，SKBR3-R 細胞CM 中IGF1R/HER2異源二聚體與HER2含量比值高于SKBR3細胞［（70±12.30）%（17±1.95）%，＜0.01，圖3）］。

2.3 miR-98-5p與IGF2靶向相互作用

SKBR3 及SKBR3-R 細胞條件培養(yǎng)基（CM）內(nèi)，IGF2 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（=0.129）；IGF2蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（22.52±3.79 ng/mL101.12±11.26 ng/mL，＜0.01，圖1B）。

SKBR3空白對照組侵襲細胞數(shù)為75.23±11.12，導入miR-98-5p mimic后侵襲細胞數(shù)21.89±7.23，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）；導入miR-98-5p inhibit后侵襲細胞數(shù)為98.91±9.52，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，圖7）。

2.4 miR-98-5p 靶向調(diào)控IGF2蛋白表達

SKBR3細胞中導入miR-98-5p inhibitor時，細胞內(nèi)IGF2含量增加（＜0.01）；同樣將SKBR3-R細胞中導入miR-98-5p mimic 時，細胞內(nèi)IGF2 含量下降（＜0.01，圖6）。

2.5 miR-98-5p 對SKBR3細胞侵襲性的影響

城市軌道交通的車輛密度大，運輸量較高，在工程設計上，主要以行車間隔縮短為主。在該種方式的作用下，可以進一步提升服務質(zhì)量，降低旅客的候車時間以及工程總體投資數(shù)額。但在信號ATP系統(tǒng)的作用下，該項操作的實際效果并沒有很好的體現(xiàn)出來，如“車、地”通信速率、軌道區(qū)段長度等因素，在具體應用過程中不能將行車距離無限縮短，而且最小行車間隔對整個系統(tǒng)方案設計影響較大。信號ATP系統(tǒng)的出現(xiàn)，主要是利用各種控制參數(shù)來確定行車間隔。站在實際工程角度來說，應該以實際施工方案內(nèi)容內(nèi)容、線路、距離等綜合因素為主，建立起一個合理的投資計劃，最終滿足車輛信號系統(tǒng)的設計要求。

2.6 裸鼠異種移植腫瘤模型建立及相關分子表達

赫賽汀能抑制SKBR3細胞異種移植腫瘤的生長，但對SKBR3-R細胞異種移植腫瘤生長影響減小。第6周測量腫瘤最大徑分別為5.5±1.7 mm和27.5±5.8 mm，差異具有統(tǒng)計學意義（＜0.05，圖8）。達到實驗終點后，切取腫瘤組織，免疫組化發(fā)現(xiàn)赫賽汀耐藥腫瘤組織中IGF2、磷酸化IGF-1R（p-IGF1R）、Akt（p-Akt）、S6K（p-S6K）含量水平高于赫賽汀敏感腫瘤組織（圖9）。

2.7 二氫楊梅素在體內(nèi)增加SKBR3-R細胞異種移植瘤對赫賽汀敏感性

裸鼠移植腫瘤體積達到～100 mm時，將小鼠隨機分3組，第6周瘤體積達到最大，3組分別為213.3±10.6 mm、605.5±8.8 mm、689.3±20.3 mm，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，圖10）。

2.8 二氫楊梅素在體內(nèi)通過miR-98-5p調(diào)節(jié)IGF2轉錄后表達水平

miR-98-5p在實驗組相對表達量4.32±0.88、對照組1.19±0.25、空白組1.10±0.27，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。IGF2 mRNA在3組相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。IGF2蛋白表達量在實驗組、對照組、空白組的差異有統(tǒng)計學意義（75.83±3.29208.3±12.11218.5±13.71，＜0.01，圖11）。

3 討論

HER2屬于生長因子受體家族成員，其在乳腺癌中過表達是促進癌細胞侵襲增殖的重要因素，與患者的預后密切相關?？笻ER2靶向藥物赫賽汀可有效阻滯HER2信號傳導，起到抗腫瘤作用，HER2陽性乳腺癌患者的生存期得到顯著提高，但是耐藥患者的預后依然較差。攻克耐藥是臨床面臨的重大挑戰(zhàn)。HER2的特殊性在于體內(nèi)缺乏天然配體，受體通過與自身或者其他生長因子受體家族形成同源或異源二聚體，激活下游信號通路，如PI3K/AKT通路。胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）信號通路的異常激活在赫賽汀耐藥中的重要性已越來越受到重視，尋找調(diào)控信號通路的特異性靶點來逆轉赫賽汀耐藥，是當前基礎研究的熱點。有研究發(fā)現(xiàn)，在HER2陽性人乳腺癌細胞中，IGF2/IGF-1R/IRS1信號被負反饋抑制，以維持基本的細胞生存和增殖。當這種負反饋被打破后，IGF-1R可通過自身下游信號通路激活使細胞對赫賽汀敏感性降低。本研究證實了上述結論，我們進一步發(fā)現(xiàn)赫賽汀誘導耐藥的SKBR3-R細胞中IGF-1R/HER2異源二聚體含量顯著增多，細胞通過這種方式對赫賽汀產(chǎn)生耐藥。有研究亦有報導，但沒有分析二聚體形成的原因。雖然IGF1R與HER2 有著共同的AKT/mTOR 下游信號通路，但IGF-1R 胞內(nèi)區(qū)特有的信號分子胰島素受體底物1（IRS1）是否激活是與HER2介導下游信號通路相鑒別的重要方法。研究表明，IRS1激活會通過AKT信號通路促進腫瘤生長。IGF2/IGF-1R/IRS1信號通路還與惡性腫瘤細胞之間的黏附過程有關，對癌細胞表型維持以及抗腫瘤治療耐藥過程中起了重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著IGF2水平的升高，SKBR3細胞的侵襲性顯著增強，同時對赫賽汀敏感性顯著降低。有研究亦發(fā)現(xiàn)IGF2水平升高促進乳腺癌細胞的轉移。本研究發(fā)現(xiàn)赫賽汀耐藥乳腺癌細胞高表達IGF2，并且細胞膜內(nèi)IRS1磷酸化水平顯著升高。細胞內(nèi)IGF2水平升高后，激活IGF1-R/HER2 異源二聚體大量形成，并通過IGF1-R 下游IRS1 介導的信號通路旁路激活AKT/mTOR，可能是導致SKBR3-R細胞對赫賽汀耐藥的重要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，SKBR3-R 細胞與SKBR3 細胞內(nèi)IGF2 mRNA水平并無顯著差異，而IGF2蛋白含量在耐藥細胞中卻顯著升高。提示很可能IGF2在mRNA轉錄后受到了調(diào)控。IGF2在腫瘤中表達水平受到上游基因調(diào)控在其他腫瘤中常有報道。MicroRNA是生物體內(nèi)最常見非編碼RNA之一，它們的主要功能就是結合目標mRNA并調(diào)控轉錄。檢索生物信息學數(shù)據(jù)庫TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72/），預測IGF2 mRNA 的3'-UTR 中許多具有保守結合位點的miRNAs。Context scores和Pct對預測結果的可能性進行評分，其中miR-98-5p具有高靶向結合可能性。同時miR-98-5p也已被證實在多種癌癥中均具有抑制腫瘤生長和轉移的作用，本研究進一步通過熒光素酶報告基因確定了miR-98-5p與IGF2存在靶向作用關系，表明miR-98-5p參與了IGF2的表達調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)轉染了miR-98-5p mimic的SKBR3細胞，IGF2蛋白表達下降，侵襲性顯著降低，驗證了miR-98-5p/IGF2調(diào)控軸在細胞侵襲中的重要作用。

在需提高認識油茶苗木重要性，加大投入力度。從現(xiàn)狀中看到，容器苗和嫁接苗長勢比裸根苗良好，造林效果較好[10-11]。為此，在油茶造林中，最大限度地培育更多的容器苗和嫁接苗，使用容器苗和嫁接苗，加大在容器苗和嫁接苗的培育工作力度，這樣更有利于提高苗木的質(zhì)量。

在我們既往研究中發(fā)現(xiàn)，黃酮類天然化合物DMY有顯著抑制乳腺癌細胞增殖的能力，可能的機制就是抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活。并且通過體內(nèi)實驗驗證了DMY在裸鼠體內(nèi)的安全有效的灌胃劑量為25 mg/g·d。本研究在前期研究基礎上發(fā)現(xiàn)，DMY顯著降低了SKBR3-R裸鼠異種移植腫瘤組織內(nèi)AKT/mTOR信號通路關鍵分子磷酸化水平，同時有效地逆轉了赫賽汀耐藥。腫瘤組織中miR-98-5p表達量在含DMY 治療組顯著高于未加入DMY 治療組，而IGF2蛋白水平正好相反。提示DMY可能是通過miR-98-5p下調(diào)IGF2表達，進而抑制IGF-1R下游信號通路的旁路激活，逆轉細胞對赫賽汀耐藥。對于DMY通過microRNA途徑調(diào)控效應蛋白的表達，在既往的研究中同樣有報道。其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，HER2過表達的乳腺癌細胞中IGF2高表達可促進IGF-1R/HER2異源二聚體形成，并激活下游信號通路造成赫賽汀耐藥。二氫楊梅素可以誘導miR-98-5p表達，降低IGF2水平，從而逆轉HER2陽性乳腺癌細胞對赫賽汀耐藥。本研究首次探究了SKBR3細胞中miR-98-5p/IGF2調(diào)控軸參與對赫賽汀耐藥以及二氫楊梅素逆轉細胞耐藥的可能機制，為臨床上克服赫賽汀繼發(fā)耐藥提供新的思路，值得進一步深入研究。