ANA-12通過(guò)靶向阻斷BDNF/TrkB信號(hào)通路降低大鼠的脊髓炎癥和緩解病理性疼痛

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）通過(guò)與其高親和力受體—原肌球蛋白受體激酶B（TrkB）相互作用行使其生物學(xué)功能，包括細(xì)胞分化以及神經(jīng)發(fā)生等。在腦中，BDNF具有多種生理功能，包括神經(jīng)元的存活、新突觸的形成、興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)以及突觸可塑性的維持等。除了上述生理功能之外，BDNF還參與痛覺(jué)的調(diào)控，BDNF的異常表達(dá)與痛覺(jué)行為表現(xiàn)相關(guān)。BDNF在神經(jīng)損傷或炎癥相關(guān)的痛覺(jué)傳導(dǎo)區(qū)域過(guò)度表達(dá)，即傷害性途徑，主要分布區(qū)域包括背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)、脊髓背角以及軀體感覺(jué)皮層。BDNF的過(guò)度表達(dá)對(duì)于神經(jīng)性疼痛和炎癥痛的發(fā)展是必需的。BDNF/TrkB信號(hào)在脊髓中樞敏化中的作用是痛覺(jué)維持的基礎(chǔ)。BDNF通過(guò)激活TkrB而建立慢性痛覺(jué)，鞘內(nèi)注射TrkB受體阻斷劑能夠阻抑外源性BDNF引起的異常性疼痛。研究顯示，BDNF/TrkB信號(hào)的激活參與傷害信號(hào)傳遞的調(diào)控。目前發(fā)現(xiàn)與BDNF/TrkB信號(hào)途徑相關(guān)的分子途徑和調(diào)節(jié)因子包括PAR2-NF-κB、P2X4R-TLR4-p38 信號(hào)以及BDNF 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CREB等。在闡述痛覺(jué)敏感性增加的機(jī)制方面，多數(shù)研究聚焦于膠質(zhì)細(xì)胞。在多種信號(hào)途徑中，已明確P2X4R-TLR4-p38信號(hào)在特定細(xì)胞類(lèi)型，即小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，主要涉及炎癥反應(yīng)及炎癥因子的表達(dá)調(diào)節(jié)。但目前對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞在骨癌痛相關(guān)的炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制尚未完全明確。

在脊髓和腦中，各種受體系統(tǒng)的激活以及各種化合物的合成參與痛覺(jué)調(diào)控。脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞不僅參與了損傷引發(fā)的神經(jīng)性疼痛的發(fā)生，并且也是維持超敏反應(yīng)所必需的。BDNF在神經(jīng)病理性疼痛晚期介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元相互作用的信號(hào)分子。在疼痛晚期，中樞炎癥反應(yīng)明顯減弱，小膠質(zhì)細(xì)胞主要依賴(lài)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF來(lái)延長(zhǎng)疼痛超敏反應(yīng)。目前研究主要通過(guò)調(diào)控BDNF/TrkB下游信號(hào)途徑在膠質(zhì)細(xì)胞的作用，抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活并減少炎癥因子或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌，以達(dá)到改善動(dòng)物痛覺(jué)行為的目的。

BDNF的異常過(guò)度表達(dá)與動(dòng)物的痛覺(jué)行為表現(xiàn)密切相關(guān)，相關(guān)研究表明ANA-12可下調(diào)BDNF參與/誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥以及病理性疼痛；此外，ANA-12還參與慢性疼痛狀態(tài)維持的調(diào)控。上述研究表明，ANA-12可通過(guò)抑制BDNF/TrkB信號(hào)參與多種痛覺(jué)行為的調(diào)控，但目前關(guān)于ANA-12在痛覺(jué)調(diào)控中的內(nèi)在分子機(jī)制尚未明確。因此，為探究ANA-12在急性疼痛及慢性疼痛中的作用，小膠質(zhì)細(xì)胞激活與動(dòng)物痛覺(jué)行為的關(guān)系，本研究采用鞘內(nèi)給藥TrkB受體拮抗劑ANA-12靶向阻斷BDNF/TrkB信號(hào)，進(jìn)而分析BDNF/TrkB信號(hào)活性、小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)以及炎癥因子的表達(dá)情況，明確BDNF/TrkB信號(hào)在病理性疼痛中的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本實(shí)驗(yàn)使用42只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量180～200 g，6～8周齡。大鼠飼養(yǎng)在室溫為22±2 ℃的環(huán)境中，以12/12 h晝夜節(jié)律變換并提供充足的水和食物。將大鼠隨機(jī)分為兩大組，BDNF 處理組（4 小組，6 只/組）：包括對(duì)照組（control）、ANA-12 處理組（ANA-12）、BDNF 處理組（BDNF）以及BDNF 和ANA-12 聯(lián)合處理組（BDNF+ANA-12）；炎癥痛模型組（3小組，6只/組）：包括對(duì)照組（control）、CFA處理組（CFA）以及CFA和ANA-12聯(lián)合處理組（CFA+ANA-12）。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)湖北科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020-01-900）。

1.2 主要試劑

蛋白酶抑制劑、Radio Immunoprecipitation Assay裂解液、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BDNF（北京義翹神州科技股份有限公司）；ANA-12（Selleck）；完全弗氏佐劑（CFA）（Sigma-Aldrich）。本實(shí)驗(yàn)所用I抗如 下：anti-BDNF（A4873）、anti-TrkB（A19832）、phospho-TrkB-Y705（AP0423）、anti-Iba1（A1527）和anti-TNF-α（A0277）（武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司）。所用Ⅱ抗為HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司）。

1.3 模型建立及分組處理

BDNF-急性痛大鼠模型：大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（control）和模型組。首先大鼠背部注射部位進(jìn)行剃毛和皮膚消毒處理，然后用無(wú)菌微量注射器于L5和L6脊椎棘突間隙垂直進(jìn)針，進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，將注射器緩慢傾斜45°方向。模型組大鼠注入10 ng/10 μL BDNF溶液，對(duì)照組大鼠注射相同體積（10 μL）的生理鹽水。給藥處理如下：模型組大鼠隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組（BDNF）和ANA-12給藥組（BDNF+ANA-12）。BDNF注入30 min后，溶劑對(duì)照組鞘內(nèi)注射10 μL體積的DMSO+生理鹽水（體積比1∶1），ANA-12組注射200 μg/10 μL體積的ANA-12溶液。

將大鼠置于30 cm×30 cm×30 cm的透明有機(jī)玻璃盒內(nèi)，實(shí)驗(yàn)平臺(tái)高50 cm。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持環(huán)境安靜。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將大鼠放入玻璃盒中適應(yīng)30 min，觀察并記錄每5 min內(nèi)大鼠自發(fā)性縮足（或舔爪）反射次數(shù)，記錄3次，5 min/次。脊髓鞘內(nèi)注射BDNF后，將大鼠放回盒內(nèi)適應(yīng)30 min后，記錄每5 min內(nèi)縮足（或舔爪）次數(shù)，記錄3次。繼續(xù)鞘內(nèi)注射溶劑或ANA-12溶液，放回盒內(nèi)適應(yīng)30 min后，記錄每5 min內(nèi)縮足（或舔爪）次數(shù)，記錄3次。

1.4 大鼠自發(fā)性縮足反射次數(shù)記錄

CFA-慢性炎癥痛大鼠模型：大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（control）和模型組。模型組大鼠采用水合氯醛麻醉，將CFA按1∶1的比例與生理鹽水混勻?yàn)閼覞嵋?，將該懸濁液皮下注入大鼠左后肢足底，使其局部產(chǎn)生紅腫熱痛等炎性反應(yīng)。對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水。給藥處理：模型組大鼠隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組（CFA）和ANA-12給藥組（CFA+ANA-12）。CFA模型構(gòu)建7 d后，溶劑對(duì)照組鞘內(nèi)注射10 μL體積DMSO+生理鹽水（體積比1∶1），ANA-12組注射200 μg/10 μL體積的ANA-12溶液。

1.文章標(biāo)題分析。優(yōu)質(zhì)推文的標(biāo)題總體上具有以下特點(diǎn)：一是情感傾向明顯，語(yǔ)氣強(qiáng)烈。其中標(biāo)題中含有感嘆號(hào)的推文有32篇，占25.6%，有4篇推文的標(biāo)題包含多個(gè)感嘆號(hào)，以使感情表達(dá)更為強(qiáng)烈，如河北民建發(fā)布的《公職人員請(qǐng)注意！這些飯局不能去?。　?；標(biāo)題中含有問(wèn)號(hào)的推文有7篇，更容易吸引讀者的注意和興趣，如河北民建發(fā)布的《都是共產(chǎn)黨的官員，差距咋這大？》。二是成句形式活潑多樣，多使用網(wǎng)絡(luò)流行語(yǔ)。如九三學(xué)社之聲發(fā)布的《確認(rèn)過(guò)眼神！都是九三青年人！》，中國(guó)農(nóng)工民主黨發(fā)布的《【福利來(lái)襲】@所有人 喜迎新春，海量紅包等拿！》。

BDNF與TrkB 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，誘導(dǎo)受體二聚化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的酪氨酸（Y705）激酶活性和自磷酸化增加，依次觸發(fā)下游信號(hào)通路的激活。通過(guò)檢測(cè)TrkB在Y705位點(diǎn)的磷酸化水平以表征其活性變化情況。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，BDNF和CFA處理均誘導(dǎo)脊髓組織中磷酸化TrkB（Y705）水平增加（＜0.05）；經(jīng)ANA-12處理后BDNF或CFA組TrkB（Y705）磷酸化水平降低（＜0.05，圖3）。

筆者結(jié)合多年心理咨詢案例、歷年的學(xué)生就業(yè)壓力調(diào)查以及學(xué)生管理工作中特殊學(xué)生的問(wèn)題處理，發(fā)現(xiàn)高職生的心理健康問(wèn)題不僅需要學(xué)校高度重視，而且需要家長(zhǎng)充分發(fā)揮作用，需要家校合作才能取得成績(jī)。通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，家校合作方面的實(shí)踐性研究并不多。

1.5 50%縮足閾值（PWT）檢測(cè)

與對(duì)照組相比，BDNF 處理后縮足次數(shù)上升（＜0.05）。進(jìn)一步進(jìn)行鞘內(nèi)給藥ANA-12并記錄大鼠自發(fā)性縮足（或舔爪）反射次數(shù)，結(jié)果顯示，與BDNF組大鼠相比，ANA-12處理降低大鼠自發(fā)縮足次數(shù)（＜0.05）。ANA-12處理對(duì)正常大鼠的行為學(xué)影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05，圖1）。

1.6 免疫印跡法檢測(cè)脊髓組織蛋白質(zhì)表達(dá)

冠心病作為常見(jiàn)多發(fā)疾病，可見(jiàn)血液液體成分逐漸減少，且固體成分不斷增多，造成血液黏度升高。此疾病好發(fā)于中老年人群，患者血管壁逐漸失去彈性，管腔越來(lái)越狹窄，進(jìn)一步加重血粘度升高程度[2-3]，血液流速隨之減慢，引發(fā)心肌缺氧，出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈血栓、心絞痛，故而，研究血液流變學(xué)變化情況對(duì)冠心病治療、預(yù)后評(píng)估等均有重要意義。

2016年1月～2018年8月，本院骨科共收治年齡≥60歲患者1 381例，其中1 336例符合上述標(biāo)準(zhǔn)，納入本研究。男520例，女774例，年齡60～98歲，平均（68.86±7.58）歲。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。行為學(xué)數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，免疫印跡數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BDNF/TrkB信號(hào)活性抑制緩解大鼠BDNF-急性痛

各組大鼠給藥處理后0、2、4和6 h，根據(jù)up-down法檢測(cè)50%PWT。方法如下：將動(dòng)物放置于行為測(cè)試籠內(nèi)，待大鼠適應(yīng)30 min后，用Von Frey纖維（0.4～26 g）垂直剌激大鼠左側(cè)后肢足底正中，持續(xù)時(shí)間≤5 s，出現(xiàn)舔足或者抬足等行為視為陽(yáng)性反應(yīng)，反之則為陰性反應(yīng)。記錄6 次數(shù)據(jù)后結(jié)束檢測(cè)。根據(jù)公式50%PWT（g）=（10）/10000計(jì)算各組大鼠的縮足閾值。（Xf為本次行為學(xué)測(cè)試中使用的最后一個(gè)Von Frey纖維的階數(shù)，K為痛覺(jué)閾矯正系數(shù)，δ為相鄰不同纖維刺激之間的差異。）

行為學(xué)記錄結(jié)束后，給予過(guò)量麻醉劑處死大鼠，分離脊髓組織于預(yù)冷的PBS中，取腰段脊髓置于含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中在冰上進(jìn)行組織勻漿。收集組織勻漿液于離心管中，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min后取上清，加入1/3體積的4×上樣緩沖液，沸水中加熱10 min變性。樣品的蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白分析試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)樣品，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉l h，Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜。所用Ⅰ抗及比例如下：anti-BDNF（1∶500）、anti-TrkB（1∶500）、phospho-TrkB-Y705（1∶500）、anti-Iba1（1∶500）和anti-TNF-α（1∶500）。Ⅰ抗孵育之后，洗膜3 次，并用Ⅱ抗室溫孵育1 h，然后用LAS500凝膠成像系統(tǒng)掃描觀察，ImageJ軟件分析條帶灰度值。

通過(guò)足底注射CFA建立炎癥疼痛大鼠模型。注射CFA導(dǎo)致大鼠同側(cè)后爪對(duì)機(jī)械刺激的敏感性增加，痛覺(jué)閾值降低（＜0.05）。與CFA組比，ANA-12處理2、4、6 h后，大鼠縮足閾值升高（＜0.05，圖2A）。CFA處理對(duì)大鼠對(duì)側(cè)后爪的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，機(jī)械痛閾值在ANA-12處理前后的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05，圖2B）。

2.2 BDNF/TrkB信號(hào)活性抑制緩解大鼠CFA-慢性炎癥痛

為檢驗(yàn)該清潔機(jī)器人能否滿足實(shí)際光伏電站的使用需要,利用學(xué)校和合作單位提供的現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)條件,對(duì)樣機(jī)進(jìn)行了運(yùn)動(dòng)功能和清洗作業(yè)實(shí)驗(yàn)。

2.3 ANA-12鞘內(nèi)給藥阻斷BDNF/TrkB信號(hào)

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2.4 BDNF/TrkB信號(hào)活性抑制減輕脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化并抑制脊髓炎癥

免疫印跡分析顯示BDNF和CFA誘導(dǎo)脊髓組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物Iba1和促炎細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)上調(diào)（＜0.05，圖4），同時(shí)炎癥小體NLRP3 和caspase-1 以及炎癥組分IL-1β表達(dá)增加（＜0.05）。ANA-12處理后，Iba1、TNF-α、IL-β、NLRP3和caspase-1表達(dá)水平下降（＜0.05，圖5）。

3 討論

疼痛刺激以外周痛覺(jué)感受器的激活以及將“痛覺(jué)信號(hào)”傳遞到軀體感覺(jué)皮層為主要特征，“痛覺(jué)信號(hào)”傳遞需要至少3種不同類(lèi)型的神經(jīng)元。BDNF是痛覺(jué)信息傳遞中的重要神經(jīng)調(diào)質(zhì)，BDNF參與了痛覺(jué)途徑的初始敏化，在損傷的早期階段的增加可能是適應(yīng)性；然而，BDNF的持續(xù)釋放會(huì)觸發(fā)一種“不適應(yīng)的”和有害的影響，從而維持或?qū)е侣蕴弁?。本研究運(yùn)用BDNF和CFA處理建立動(dòng)物痛覺(jué)模型，從而探究其中BDNF信號(hào)在動(dòng)物痛覺(jué)行為調(diào)控中的作用及機(jī)制。

BDNF在痛覺(jué)傳導(dǎo)通路中的異常過(guò)度表達(dá)與動(dòng)物痛覺(jué)行為表現(xiàn)呈正相關(guān)性。在外周炎癥中，BDNF在DRG神經(jīng)元水平的增加與脊髓背角釋放增加相關(guān)，表明BDNF信號(hào)在炎癥性疼痛中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本研究中，BDNF鞘內(nèi)給藥處理可顯著誘導(dǎo)正常大鼠（即對(duì)照組大鼠）痛覺(jué)敏感性增加，表現(xiàn)為痛覺(jué)過(guò)敏。另外，本研究在BDNF 和CFA-誘導(dǎo)的痛覺(jué)模型中均觀察到TrkB信號(hào)的表達(dá)和活性均上調(diào)，而ANA-12處理可下調(diào)TrkB受體的表達(dá)及活性且降低動(dòng)物的痛覺(jué)敏感性。這表明抑制痛覺(jué)傳導(dǎo)通路中的BDNF-TrkB信號(hào)的活性可改善動(dòng)物的痛覺(jué)行為。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞以及它們的相互作用參與神經(jīng)炎癥過(guò)程的調(diào)控。小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是神經(jīng)炎癥反應(yīng)的主要來(lái)源，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以被小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活并進(jìn)一步引起神經(jīng)毒性，因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活也被認(rèn)為是神經(jīng)炎癥的一個(gè)重要調(diào)控因素。生理狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息態(tài)，感知和監(jiān)測(cè)周?chē)h(huán)境的變化，這使小膠質(zhì)細(xì)胞能夠有效地控制微環(huán)境，清除積累的代謝產(chǎn)物和惡化的組織成分；外周神經(jīng)損傷后，脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞活化，大量合成釋放諸多疼痛因子（白介素-6、腫瘤壞死因子、γ-干擾素、BDNF等）參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生及維持。有炎癥脊髓水平研究顯示，CFA誘導(dǎo)的動(dòng)物模型中，BDNF和促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)均上調(diào)。本研究中，脊髓組織蛋白質(zhì)水平分析表明BDNF 和CFA 處理均可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，上調(diào)NLRP3炎癥小體的表達(dá)，同時(shí)增加炎癥因子的表達(dá)。結(jié)合上述研究提示，不論在正常動(dòng)物還是炎癥痛模型動(dòng)物中，BDNF的過(guò)度表達(dá)均參與痛覺(jué)的誘導(dǎo)、形成和維持過(guò)程。BDNF可通過(guò)激活多種信號(hào)通路參與小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性疼痛反應(yīng)。BDNF可誘導(dǎo)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中PI3K和ERK的激活，該效應(yīng)是神經(jīng)性疼痛發(fā)展的基礎(chǔ)。另外，BDNF調(diào)節(jié)PKCλ和PKMζ的形成以及PKMζ的磷酸化，BDNF/aPKC信號(hào)形成了維持集中慢性疼痛狀態(tài)所需的信號(hào)軸。提示本研究中BDNF和CFA誘導(dǎo)的痛覺(jué)模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及炎癥因子的表達(dá)可能由上述激酶途徑介導(dǎo)。BDNF通過(guò)與其高親和力受體TrkB結(jié)合介導(dǎo)并激活下游信號(hào)通路參與疼痛調(diào)節(jié)，TrkB抑制劑可顯著下調(diào)痛覺(jué)模型動(dòng)物的痛覺(jué)敏感性并改善痛覺(jué)行為。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)已經(jīng)存在神經(jīng)病理性疼痛的大鼠鞘內(nèi)應(yīng)用ANA-12，有效的拮抗脊髓背角BDNF/TrkB信號(hào)的過(guò)度激活，即TrkB活性位點(diǎn)（Y705）磷酸化水平下調(diào)，大鼠痛覺(jué)過(guò)敏癥狀得到改善，進(jìn)一步說(shuō)明，BDNF在疼痛維持過(guò)程中起重要作用以及ANA-12的鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，BDNF/TrkB信號(hào)調(diào)節(jié)脊髓痛覺(jué)信息傳遞，TrkB受體拮抗劑ANA-12下調(diào)BDNF/TrkB信號(hào)從而抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活并下調(diào)炎癥因子的表達(dá)水平，進(jìn)而緩解動(dòng)物痛覺(jué)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。本研究作用于痛覺(jué)信號(hào)的源頭BDNF/TrkB，探究小膠質(zhì)細(xì)胞與炎癥信號(hào)的相關(guān)性在痛覺(jué)行為學(xué)中的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，為相關(guān)疾病治療靶標(biāo)的選擇提供了新的方向，但具體的分子機(jī)制還有待深入研究。