一株駱駝源大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

李璋赟金映紅薛晶汪陽汪萍陳古麗夏俊*

（1石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003；2新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所（新疆畜牧科學院動物臨床醫(yī)學研究中心），新疆烏魯木齊 830000；3新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830000）

大腸桿菌是正常腸道菌群的重要組成部分，但也導致了多種疾病，帶來了巨大的經(jīng)濟損失，尤其是對幼齡動物危害嚴重[1]。

駝羔患大腸桿菌病表現(xiàn)出厭食、虛弱、發(fā)熱、排出淡黃色水樣便等癥狀。剖檢可見小腸充血、充滿氣體和液體、腸系膜淋巴結(jié)水腫[2]。

2021年，新疆某駱駝園發(fā)生多例幼年駱駝腹瀉，臨床表現(xiàn)為嚴重水樣腹瀉，患病駝羔體溫升高，可達40℃以上。剖檢病死駝羔，可見腸系膜淋巴結(jié)腫大，小腸黏膜充血。為明確造成大量駝羔死亡的主要原因，本實驗室對分離菌進行細菌培養(yǎng)分離，對分離菌進行革蘭氏染色鏡檢、小鼠致病性試驗和16S rDNA基因鑒定后明確分離菌為大腸桿菌，然后進行藥敏試驗，合理選擇藥物，有效治療了該養(yǎng)殖場的駝羔大腸桿菌腹瀉病。

1 材料與方法

1.1 主要試驗試劑和儀器

1.1.1 主要試劑。腦心浸液培養(yǎng)基（BHI肉湯）購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；DL2000核酸Marker購自大連寶生物有限公司；革蘭氏染液購自北京索萊寶科技有限公司；90 mm細菌培養(yǎng)皿購自蘭杰柯科技有限公司；200 μL移液器購自普蘭德（上海）貿(mào)易有限公司；1 mL注射器購自武漢市王冠醫(yī)療器械有限責任公司；藥敏紙片購自青島易邦生物工程有限公司。

1.1.2 主要儀器。儀器有PCR儀、電泳儀、恒溫水浴鍋、微波爐、標準型單人超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、電子天平、空氣浴搖床、顯微鏡。

1.2 病料和試驗動物

病死駝羔肺臟、腸組織來自新疆某駱駝園；健康小鼠購買自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心實驗動物研究中心。

1.3 引物

參照文獻，設(shè)計并合成細菌鑒定通用引物：上游引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，按照說明書稀釋至10 μmol/L，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗方法

1.4.1 大腸桿菌疑似菌株的獲取。在無菌條件下，采集駝羔肺臟組織劃線接種于BHI培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～24 h；再抽取少量病死駝羔心血和肺臟組織放入BHI液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)12～24 h。

1.4.2 革蘭氏染色鏡檢。BHI固體培養(yǎng)基和BHI肉湯均進行革蘭氏染色，觀察細菌的形態(tài)特征和染色特征。

1.4.3 小鼠致病性試驗。將已培養(yǎng)出菌株的BHI肉湯給小鼠腹腔注射200 μL/只。同時，設(shè)置感染組和空白對照組，空白對照組不進行處理。

1.4.4 16S rDNA基因鑒定。取經(jīng)純化培養(yǎng)的細菌肉湯1 μL加入反應體系中進行PCR擴增。模板1 μL，上、下游引物各 1 μL，Mix 12.5 μL，用 ddH2O 將反應體系補充至25 μL。循環(huán)條件：94℃預變性5 min，95℃變性 30 s，56℃復性 30 s，72℃延伸 1 min，共30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR反應結(jié)束后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳條帶后回收PCR產(chǎn)物，送上海生工生物公司測序。

1.4.5 藥敏試驗。將經(jīng)過純培養(yǎng)的菌液50 μL滴入BHI固體培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻，用鑷子夾取藥敏紙片均勻放置于培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)12～24 h，觀察抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌疑似菌株的獲取

在BHI培養(yǎng)基上形成圓形，邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起灰白色、露珠樣的菌落，如圖1所示。在BHI肉湯中生長良好，均勻渾濁，如圖2所示。

2.2 革蘭氏染色鏡檢

革蘭氏染色鏡檢顯示，分離菌株為兩端鈍圓的革蘭陰性短桿菌狀，如圖3所示。

2.3 小鼠致病性試驗

感染組小鼠于接種4 h后，開始表現(xiàn)精神沉郁，在接種后24 h內(nèi)全部死亡（圖4）。剖檢取小鼠心血進行細菌培養(yǎng)，通過革蘭氏染色鏡檢和16S rDNA PCR鑒定，結(jié)果與病死駝羔肺臟組織和腸道中分離到的細菌一致，對照組無異常反應。

2.4 16S rDNA基因鑒定

吸取純培養(yǎng)菌液進行PCR擴增，分離菌株的16S rDNA擴增結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，擴增片段約1 500 bp，與預期目的片段大小一致。經(jīng)測序后其結(jié)果經(jīng)BLAST分析比對，該菌株16S rDNA基因部分序列與大腸桿菌同源性達99%，結(jié)合培養(yǎng)特性，鑒定該菌為大腸桿菌（圖5）。

2.5 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果見圖6。該分離菌對替米考星、頭孢曲松鈉、氟苯尼考敏感；對硫酸阿米卡星中度敏感；對阿奇霉素、左氧氟沙星、頭孢拉定、鹽酸林可霉素、克林霉素、硫酸慶大、乳酸環(huán)丙沙星耐藥。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

大腸埃希菌（Eschericha coli）為革蘭陰性菌，兩端鈍圓，無芽孢，大小為（0.4～0.7）μm×（2.0～3.0）μm，大多有鞭毛，能運動，散在或成對存在[3]。非致病大腸埃希菌是腸道正常菌群的組成部分之一，而致病性大腸埃希菌可引起動物發(fā)生腹瀉、敗血癥、衰竭，甚至死亡。動物腸道致病性大腸埃希菌可分為6種，即腸產(chǎn)毒素型大腸埃希菌、腸致病型大腸埃希菌、腸出血型大腸埃希菌、腸侵襲型大腸埃希菌、腸聚集型大腸埃希菌、彌散黏附型大腸埃希菌[4]。

大腸桿菌是所有哺乳動物腸道中某些部位的常在菌[5]。產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌能引起腸炎和脫水，是農(nóng)場中動物大腸桿菌性腹瀉最常見的原因[6]。在駱駝飼養(yǎng)場中，大腸桿菌病或大腸桿菌敗血癥多發(fā)生于幼年駱駝，給駱駝飼養(yǎng)場造成巨大的經(jīng)濟損失。大腸桿菌病的臨床癥狀與輪狀病毒、冠狀病毒、沙門氏菌、球蟲感染相似，應在診斷中進行微生物學檢測[7]。

駝羔腹瀉是最常見的駝羔疾病，多發(fā)生在春季產(chǎn)羔后期，發(fā)病率和死亡率都很高[8]。其病因除本案例中的大腸桿菌感染外，還有駝羔受寒、饑飽不均等造成消化不良或誤食污物等原因。主要癥狀均為腹瀉，但細菌性腹瀉時，病初體溫升高，患病駝羔食欲減退，之后腹瀉，排出粥樣糞便，色黃帶血或泡沫，隨后變?yōu)榈咨?，有不良臭味[9]；非細菌性腹瀉，患病駝羔體溫正常，糞便如清水帶黃色。由腹瀉造成脫水，患病駝羔精神沉郁，臥地不起。

對于本病的治療，應口服或腸外補充電解質(zhì)，以恢復體液平衡，同時使用抗生素治療。此外，為了降低駝羔的死亡率，可以給母駝注射畜群特異性大腸桿菌疫苗或給幼齡駱駝口服疫苗進行免疫。

3.2 結(jié)論

本次試驗在幼年駱駝中分離出大腸桿菌，明確了造成新疆某駱駝飼養(yǎng)場駝羔大量死亡的原因，并進行了微生物學檢測、16S rDNA基因鑒定、小鼠致病性試驗、藥敏試驗。最終確定本株分離自腹瀉駝羔的大腸桿菌致病性強，對替米考星、頭孢曲松鈉、氟苯尼考敏感；對硫酸阿米卡星中度敏感；對阿奇霉素、左氧氟沙星、頭孢拉定、鹽酸林可霉素、克林霉素、硫酸慶大、乳酸環(huán)丙沙星耐藥。本次試驗對減少駱駝飼養(yǎng)場損失有幫助。