益氣化痰活血法對血脂異常痰濁阻遏證小鼠動脈粥樣硬化相關(guān)炎性因子IL-6、TNF-α表達的影響

陳 婧,薛曉琳,葉 超,楊 正,張 珊,馬 迪,王 悅,鄧 斌,趙瑞珍

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

隨著人們生活水平提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，血脂異常的患病人群在不斷增加。血脂異常已成為多種心血管疾病的誘因，脂質(zhì)水平升高使得脂質(zhì)沉積于動脈內(nèi)皮下，與此同時被平滑肌、巨噬細胞等吞噬形成泡沫細胞[1]，遷移至內(nèi)膜下，是動脈粥樣硬化形成的首要危險因素[2]，可通過誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)損傷血管內(nèi)皮細胞等促進動脈粥樣硬化的進展[3]。動脈粥樣硬化是活躍的炎癥過程，其包含了脂質(zhì)浸潤的過程和內(nèi)皮細胞損傷修復(fù)的過程[4]。在炎癥過程中，動脈粥樣硬化處廣泛存在的T淋巴細胞會促進巨噬細胞分泌大量促炎癥細胞因子，如白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[5]。痰濁阻遏證是血脂異常疾病的代表性證候[6]，TNF-α水平結(jié)合臨床癥狀、血脂檢查，有可能成為預(yù)測血脂異常痰濁阻遏證患者心腦血管疾病風(fēng)險的參考指標(biāo)之一[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣化痰活血法代表方劑調(diào)脂通脈顆粒可通過降低富含三酰甘油脂蛋白殘粒的水平，減少細胞黏附分子表達，延緩動脈粥樣硬化進展[8]。但該方劑對于血脂異常痰濁阻遏證動脈粥樣硬化相關(guān)炎性因子IL-6、TNF-α表達是否有干預(yù)作用尚未可知，因此本課題組基于前期研究基礎(chǔ)，應(yīng)用ApoE基因敲除小鼠作為研究對象，采用多因素復(fù)合建模的方法構(gòu)建血脂異常-痰濁阻遏證模型，探討不同濃度的調(diào)脂通脈顆粒對IL-6、TNF-α表達的影響，以期為益氣化痰活血法抑制血脂異常痰濁阻遏證所致的動脈粥樣硬化過程提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 ApoE基因敲除雄性小鼠24只， 6周齡，體重(20±5)g，由北京市昌揚西山養(yǎng)殖場提供，動物使用許可證號：SYXK(京)2016-0021。實驗過程中對動物的處置方法按照2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)要求。

1.2造模飼料 由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供的高脂飼料。

1.3藥物及主要試劑 調(diào)脂通脈顆粒由太子參、丹參、赤芍、紅花、草決明、黃芩、地龍、清半夏、陳皮、茯苓、澤瀉、山楂等組成，由北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥房制作為顆粒劑，其中4 g/(kg·d)為人鼠劑量換算方法換算的小鼠與60 kg 成人的等效劑量。小鼠IL-6、TNF-α檢測ELISA試劑盒(Raybio)。

1.4實驗方法 對所有ApoE基因敲除小鼠首先進行1周普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)，然后喂養(yǎng)高脂飼料4周完成血脂異常痰濁阻遏證小鼠的模型制作。將造模完成的ApoE基因敲除小鼠隨機分為4組，每組6只。參照文獻[9]方法，調(diào)脂通脈顆粒低、中、高劑量組分別給予2 g/(kg·d)、 4 g/(kg·d)、8 g/(kg·d)的調(diào)脂通脈顆粒灌胃，模型組給予等量的生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃4周[9]。灌胃過程中給予高脂飼料喂養(yǎng)。

1.5檢測指標(biāo) 各組小鼠灌胃4周后，禁食不禁水12 h，腹腔麻醉，摘眼球取血1～2 mL，加入抗凝管中，室溫靜置2 h，4 ℃下1 500 r/min離心(離心半徑8 cm)10 min，分離血清后分裝，迅速至-80 ℃冰箱保存。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明步驟檢測血清IL-6、TNF-α水平。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 本研究納入的ApoE基因敲除小鼠實驗過程中無死亡及脫失。

2.2各組血清IL-6、TNF-α水平比較 各組血清IL-6、TNF-α水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。隨著調(diào)脂通脈顆粒劑量的增加，血清IL-6、TNF-α水平依次下降；調(diào)脂通脈顆粒高劑量組血清IL-6水平均明顯低于模型組、調(diào)脂通脈顆粒低劑量組、調(diào)脂通脈顆粒中劑量組(P均<0.05)，調(diào)脂通脈顆粒高劑量組血清TNF-α水平明顯低于模型組、調(diào)脂通脈顆粒低劑量組(P均<0.05)；調(diào)脂通脈顆粒低、中劑量組與模型組比較，調(diào)脂通脈顆粒低劑量組與調(diào)脂通脈顆粒中劑量組比較，血清IL-6和TNF-α水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組血脂異常痰濁阻遏證小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較

3 討 論

血管內(nèi)皮是血液與血管壁之間的屏障，具有多種功能，如合成和釋放血管活性因子、調(diào)節(jié)血管收縮與舒張等[10]。動脈粥樣硬化是動脈壁對內(nèi)皮細胞損傷的炎癥反應(yīng)，內(nèi)皮功能損害是一個始動因素[11]，炎癥處于動脈粥樣硬化過程的始終[12]，血脂異常是動脈粥樣硬化所致內(nèi)皮功能障礙過程中重要的危險因素。

動脈粥樣硬化是血管炎癥，多種刺激對于血管內(nèi)皮的損傷可致內(nèi)皮功能紊亂，分泌的細胞因子導(dǎo)致泡沫細胞遷移，形成動脈粥樣硬化斑塊，造成動脈管腔狹窄[13]。其中炎癥作用產(chǎn)生依賴于促炎因子的作用，如TNF-α、IL-6等的產(chǎn)生和釋放與動脈粥樣硬化的形成和進展密切相關(guān)[14]。Ross[15]在1999年提出：動脈粥樣硬化是慢性炎癥性的脂類在血管內(nèi)皮下沉積的代謝疾病，因此對于血脂異常疾病中相關(guān)炎性因子特點的研究，對于防治血脂異常所致的動脈粥樣硬化具有重要的意義。

痰濁阻遏證是血脂異常疾病的主要證候之一。痰濁是血脂異常疾病代表性的中醫(yī)致病因素。嗜甘少動，體肥形胖，痰濁內(nèi)停，氣機郁滯，血脈不暢，凝結(jié)脈絡(luò)，導(dǎo)致動脈粥樣硬化。值得關(guān)注的是，血脂異常引發(fā)動脈粥樣硬化過程中可能出現(xiàn)“由痰致瘀”的證候變化。水濕代謝失常，痰濁內(nèi)生，阻血隔液，瘀血內(nèi)停，終致痰濁瘀血互結(jié)。臨床觀察發(fā)現(xiàn)血瘀證候的出現(xiàn)往往在痰濁證候之后，從另一個角度印證了“久病皆瘀”的理論[16]。由此可知，益氣化痰活血法切合該病的核心病機。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，血脂異常痰濁阻遏證患者ONOO-濃度可以在一定程度上反映該證候的嚴(yán)重程度[17]，ONOO-通過蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)引起血管內(nèi)皮的損傷[18]。因此從血管內(nèi)皮相關(guān)指標(biāo)進行血脂異常痰濁阻遏證的深入研究具有可行性。

調(diào)脂通脈顆粒以太子參益氣健脾，補而不燥；以丹參、赤芍、紅花、山楂清熱散瘀，活血通經(jīng)；以茯苓化痰利水、健脾滲濕；以清半夏、陳皮燥濕化痰，理氣和中；以決明子利水通便，以澤瀉利濕化濁；全方以益氣健脾、化痰降濁、活血化瘀為大法，使得脾氣得補，痰濁得化，瘀血得行。既往臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用調(diào)脂通脈顆粒對老年高血脂癥痰瘀證進行治療，不僅可改善血脂指標(biāo)，還能降低動脈硬化指數(shù)[19]。動物研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)脂通脈顆粒能降低高脂飼料造模后ApoE基因敲除小鼠血清三酰甘油(TG)及可溶性細胞間黏附分子-1(sICAM-1)、可溶性血管細胞黏附分子-1(sVCAM-1)水平，從而減緩動脈粥樣硬化的病變[20]。本研究應(yīng)用高脂飼料復(fù)制血脂異常痰濁阻遏證的病-證動物模型，觀察不同濃度調(diào)脂通脈顆粒對ApoE基因敲除小鼠血清IL-6、TNF-α水平的影響，深入探討調(diào)脂通脈顆粒對血脂異常痰濁阻遏證小鼠動脈粥樣硬化的干預(yù)作用。

IL-6為炎癥反應(yīng)的遞質(zhì)，是動脈粥樣硬化中的炎癥標(biāo)志物，可由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，參與動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展[21-22]，能產(chǎn)生并促進慢性炎癥反應(yīng)[23]，其在動脈粥樣硬化動物動脈內(nèi)膜中的濃度高于正常動物[24]。本實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用調(diào)脂通脈顆粒灌胃后，隨著藥物濃度增加，血清IL-6水平逐漸降低，調(diào)脂通脈顆粒高劑量組明顯低于模型組、調(diào)脂通脈顆粒低劑量組、調(diào)脂通脈顆粒中劑量組，但調(diào)脂通脈顆粒低、中劑量組與模型組比較未見統(tǒng)計學(xué)差異。說明高劑量調(diào)脂通脈顆粒可明顯降低血清IL-6水平，在治療時，對于血清IL-6水平起到明顯作用時需要調(diào)高使用劑量。

TNF-α主要由活化的巨噬細胞分泌，能加快內(nèi)皮細胞損傷，參與動脈粥樣硬化炎癥，促進動脈粥樣硬化進展[25-27]。本實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用調(diào)脂通脈顆粒灌胃后，隨著藥物濃度增加，血清TNF-α水平逐漸降低，調(diào)脂通脈顆粒高劑量組明顯低于模型組和調(diào)脂通脈顆粒低劑量組，但調(diào)脂通脈顆粒中劑量組和調(diào)脂通脈顆粒高劑量組比較未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異。說明調(diào)脂通脈顆?？山档脱錞NF-α水平，但調(diào)脂通脈顆粒濃度提高并不會進一步降低血清TNF-α水平。

綜上所述，調(diào)脂通脈顆粒可抑制血脂異常痰濁阻遏證小鼠血清IL-6、TNF-α表達，可以減輕血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)；高劑量調(diào)脂通脈顆?？筛行Ы档脱錓L-6水平，而TNF-α水平下降對藥物濃度的依賴程度不大。由于本次研究樣本量較小、檢測指標(biāo)較少等不足，未能明確調(diào)脂通脈顆粒的具體作用機制，有待做進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。