長(zhǎng)春新堿逆轉(zhuǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)白血病兒童門(mén)冬酰胺酶耐藥的研究*

徐清云 盧婕倫 曾曉珍 衛(wèi)風(fēng)桂 吳澤霖 鄒亞偉

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，廣東省廣州市 510000

聯(lián)合應(yīng)用左旋門(mén)冬酰胺酶(L-asp)治療后，兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的完全緩解率及長(zhǎng)期無(wú)病生存率有了顯著提高[1]，作為兒童ALL化療的一線藥物，L-asp在ALL患兒誘導(dǎo)緩解中有著不可替代的地位，卻容易產(chǎn)生耐藥[2]，對(duì)L-asp治療的耐藥與其臨床療效差存在直接相關(guān)性。關(guān)于L-asp的耐藥機(jī)制，目前尚未有定論，但有研究表明，可能與白血病細(xì)胞賴(lài)以生存的骨髓微環(huán)境中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的ASNS高表達(dá)有關(guān)[3]。白血病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)直接黏附和分泌細(xì)胞因子等機(jī)制對(duì)白血病細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡有重要作用[4-5]。白血病細(xì)胞與骨髓微環(huán)境的相互作用成為研究?jī)和籽∧退幍囊粋€(gè)重要方面。從干擾或切斷ALL細(xì)胞與MSCs的聯(lián)系著手，可能會(huì)找到更多解決門(mén)冬酰胺耐藥問(wèn)題的辦法，從而改善ALL的預(yù)后?，F(xiàn)今兒童ALL常用化療方案中均采用長(zhǎng)春新堿(VCR)和L-asp序貫治療[6]。VCR預(yù)處理MSCs，能否降低MSCs中ASNS的表達(dá)并逆轉(zhuǎn)共培養(yǎng)系統(tǒng)中MSCs介導(dǎo)的L-asp耐藥，這尚有待證實(shí)。本項(xiàng)目研究以體外模擬骨髓微環(huán)境中的白血病細(xì)胞為靶點(diǎn)，建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞—白血病細(xì)胞共培養(yǎng)模型，并對(duì)其進(jìn)行L-asp處理。通過(guò)比較L-asp處理前后白血病細(xì)胞的凋亡情況及其ASNS mRNA的表達(dá)水平，評(píng)估MSCs對(duì)白血病兒童L-asp治療耐藥的影響,并探索VCR能否逆轉(zhuǎn)MSCs介導(dǎo)的白血病細(xì)胞對(duì)門(mén)冬酰胺酶耐藥及其機(jī)制，為進(jìn)一步理解L-asp的化療耐藥機(jī)制并克服ALL細(xì)胞對(duì)L-asp的耐藥問(wèn)題奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 Ficol淋巴細(xì)胞分離液(天津TBD 公司)，胎牛血清(美國(guó)Hyclone 公司)，低糖DMEM 培養(yǎng)基(DMEM-LG)，1640 培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco 公司)，流式細(xì)胞術(shù)、抗體(美國(guó)BD PharMingen公司)，核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bio-Rad公司)、qPCR試劑盒(Thermo公司)，引物(Invitrogen公司)，低溫高速離心機(jī)(Beckman公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO公司)，倒置光學(xué)顯微鏡(Leica 公司)，PCR儀C1000(Bio-RAD公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI-7900HT(ABI公司)。

1.2 標(biāo)本采集 所有病例來(lái)自廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科ALL患兒。在知情同意下收集15例ALL患兒骨髓標(biāo)本，其中初治3例，化療緩解或部分緩解12例，平均年齡(5.53±3.18)歲，男7例，女8例。15例骨髓標(biāo)本全部用于體外培養(yǎng)，12例化療緩解或部分ALL骨髓標(biāo)本經(jīng)分離培養(yǎng)及傳代后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MSCs的體外分離、培養(yǎng)及鑒定：MSCs的體外分離、培養(yǎng)方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs的免疫表型。

1.3.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞株Jurkat L-asp IC50濃度：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat細(xì)胞，按1×105/孔，L-asp的終濃度分別為0.00、0.01、0.10、1.00、10.00IU/ml，每一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔；培養(yǎng)48h，加入MTT(5mg/ml)/孔，4h后終止培養(yǎng)，離心、吸掉上清；加入DMSO溶解MTT，酶標(biāo)儀490nm測(cè)A值；重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.3 建立MSCs-Jurkat共培養(yǎng)模型：取第2～5代MSCs按2×104/ml 的密度接種，待細(xì)胞鋪滿孔底80%～90%時(shí)，加入1 800μl(細(xì)胞懸液∶生理鹽水=19∶1，每孔共2 000μl)按5×105/ml密度重懸的Jurkat細(xì)胞，建立MSCs-Jurkat共培養(yǎng)模型，為共培養(yǎng)對(duì)照組；共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組1為加入IC50濃度的L-asp 200μl[細(xì)胞懸液∶L-asp(IC50的濃度)=19∶1，每孔共2 000μl]處理組共培養(yǎng)模型，培養(yǎng)48h后終止培養(yǎng)，收取Jurkat細(xì)胞；共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組2為加入含VCR 0.1μmol/ml(濃度相當(dāng)于臨床用藥濃度)的低糖DMEM完全培養(yǎng)液2 000μl預(yù)處MSCs，培養(yǎng)72h(VCR的生物半衰期在25.5h左右)后棄培養(yǎng)液，清洗，用VCR處理后的MSCs與Jurkat細(xì)胞建立共培養(yǎng)模型，后續(xù)步驟同共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組1。

1.3.4 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定：收集各組Jurkat細(xì)胞，沖洗后按每(1～5)×105細(xì)胞加入5μl AnnexinV-FITC和5μl PI，室溫避光染色15min；用AnnexinV-FITC/PI雙參數(shù)法流式細(xì)胞術(shù)定量測(cè)定細(xì)胞凋亡率(每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次)。

1.3.5 Real-Time qPCR檢測(cè)ASNS mRNA表達(dá)：ASNS cDNA提取步驟參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]，引物設(shè)計(jì)在Pubmed網(wǎng)站中查出Genebank提供的GAPDH和ASNS的 mRNA 序列，采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因引物：SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列GAPDH上游：5’-AATCCCATCACCATCTTCCA-3’，下游：5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’產(chǎn)物大小77bp；ASNS上游：5’-GGCAAATGCAGCCCAGAAAT-3’，下游：5’-GGCGTTCAAAGACTTGACGG-3’，產(chǎn)物大小80bp。擴(kuò)增的具體循環(huán)參數(shù)95℃ 3min；95℃3s，60℃20s，共40個(gè)循環(huán)；95℃5s，60℃1min，97℃30s。記錄Ct值并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)算公式：目的(ASNS)mRNA的表達(dá)量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=(Ct目的-Ct內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的-Ct內(nèi)參)對(duì)照組，Ct值就是熒光值達(dá)到閾值時(shí)候的PCR循環(huán)次數(shù)，根據(jù)Ct值計(jì)算ASNS mRNA進(jìn)行相對(duì)定量。目的基因的Ct值通過(guò)內(nèi)參基因的Ct值進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1 MSCs原代分離培養(yǎng)后流式細(xì)胞術(shù)鑒定 分離擴(kuò)增的MSCs表達(dá)CD105、CD29、CD90陽(yáng)性，CD14、CD19、CD11B、CD79a、HLADR、CD34和CD45表達(dá)陰性(圖1)，符合MSCs抗原標(biāo)志物表達(dá)特征，且隨著細(xì)胞的傳代免疫表型無(wú)變化[9]。

圖1 MSCs鑒定

2.2 白血病細(xì)胞株Jurkat IC50的測(cè)定 急性白血病細(xì)胞株Jurkat經(jīng)不同濃度L-asp(0.01IU/ml、0.1IU/ml、1IU/ml、10IU/ml)處理48h后細(xì)胞存活率分別為(76.33±3.44)%、(57.23±3.55)%、(50.17±3.09)%、(39.27±4.37)%，可知Jurkat細(xì)胞株L-asp IC50濃度為(1.08±0.86)IU/ml。

2.3 共培養(yǎng)及L-asp對(duì)Jurkat細(xì)胞凋亡率的影響 通過(guò)FITC-PI雙染色法檢測(cè)Jurkat細(xì)胞凋亡率，F(xiàn)ITC-Annexin V(+)/PI(-)細(xì)胞的百分比(A4象限)，即為凋亡率。見(jiàn)圖2。

圖2 1例標(biāo)本不同培養(yǎng)及處理組中Jurkat細(xì)胞凋亡率

2.3.1 L-asp對(duì)Jurkat細(xì)胞株凋亡率影響:通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Jurkat細(xì)胞株的凋亡率，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)培養(yǎng)的Jurkat經(jīng)L-asp處理后細(xì)胞凋亡率(36.83±5.69)%較對(duì)照組的(24.83±1.99)%增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)L-asp處理的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組1中Jurkat凋亡率(17.83±3.80)%也較共培養(yǎng)對(duì)照組(9.15±3.21)%高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。

2.3.2 MSCs對(duì)Jurkat細(xì)胞株凋亡率的影響:共培養(yǎng)對(duì)照組中Jurkat凋亡率(9.15±3.21)%較單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照組(24.83±1.99)%低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且L-asp處理的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組1(17.83±3.80)%比單獨(dú)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組Jurkat凋亡率(36.83±5.69)%低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明MSCs對(duì)Jurkat細(xì)胞有保護(hù)作用。

2.3.3 VCR預(yù)處理MSCs對(duì)Jurkat細(xì)胞株凋亡率的影響：VCR預(yù)處理的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組2 Jurkat凋亡率(25.87±4.68)%較無(wú)VCR預(yù)處理共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組1(17.83±3.80)%高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明VCR預(yù)處理MSCs可降低MSCs對(duì)Jurkat細(xì)胞的保護(hù)作用。

2.4 共培養(yǎng)及L-asp對(duì)Jurkat細(xì)胞ASNS mRNA的影響

2.4.1 L-asp對(duì)Jurkat細(xì)胞株ASNS mRNA表達(dá)的影響：通過(guò)RT-PCR檢測(cè)ASNS表達(dá)水平，在單獨(dú)培養(yǎng)組中，L-asp處理后ASNS mRNA表達(dá)水平升高(2-ΔΔCt=1.846±0.038，P<0.05)；在共培養(yǎng)組中，L-asp處理后ASNS mRNA表達(dá)水平也升高(2-ΔΔCt=4.102±2.212，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.2 MSCs對(duì)Jurkat細(xì)胞株ASNS mRNA的表達(dá)的影響：共培養(yǎng)對(duì)照組中ASNS mRNA的表達(dá)水平比Jurkat細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照組低(2-ΔΔCt=0.057±0.030)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但L-asp處理的共培養(yǎng)組實(shí)驗(yàn)組1與單獨(dú)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組ASNS的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(2-ΔΔCt=1.296±1.091)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4.3 VCR預(yù)處理MSCs對(duì)Jurkat細(xì)胞株ASNS mRNA表達(dá)的影響：VCR預(yù)處理的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組2 ASNS mRNA的表達(dá)水平較無(wú)VCR預(yù)處理共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組1無(wú)明顯變化(2-ΔΔCt=1.101±0.586)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

目前對(duì)BM-MSCs的分離鑒定主要有三個(gè)方面：梭形細(xì)胞，呈貼壁性生長(zhǎng)；細(xì)胞表面分子陽(yáng)性和陰性選擇標(biāo)記；自身增殖能力強(qiáng)，具有多向分化能力[9]。作為骨髓微環(huán)境主要組成部分之一，MSCs可以通過(guò)阻止藥物滲透入腫瘤細(xì)胞促進(jìn)抗藥性(被動(dòng)性)，也通過(guò)分泌保護(hù)細(xì)胞因子或改變腫瘤細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄覆蓋的抗癌藥物的細(xì)胞毒作用(主動(dòng)性)[4,10,11]。

與其他抗腫瘤藥物相比，L-asp的療效好、骨髓抑制等不良反應(yīng)相對(duì)較輕，臨床研究表明ALL的預(yù)后和門(mén)冬酰胺酶治療的劑量強(qiáng)度有直接關(guān)系[1,6]。然而，L-asp耐藥限制了其在ALL中發(fā)揮更好的療效，人們觀察到對(duì)L-asp治療耐藥與其臨床療效差存在直接相關(guān)性，通常認(rèn)為L(zhǎng)-asp耐藥這可能與谷氨酰胺依賴(lài)性天冬酰胺合成酶(ASNS)酶的上調(diào)有關(guān)[2]。但是，一項(xiàng)臨床ALL樣本中ASNS mRNA水平的研究質(zhì)疑了ASNS在L-asp耐藥性中的重要性。在16個(gè)細(xì)胞系中，ASNS基線基因表達(dá)模式將L-asp敏感性與耐藥性區(qū)分開(kāi)來(lái)。但是，對(duì)于28個(gè)兒科ALL樣本，沒(méi)有一致的基線表達(dá)模式與對(duì)L-asp敏感性相關(guān)[12]。這些結(jié)果表明，ALL樣本中ASNS以外的因素會(huì)影響L-asp的易感性。直到Iwamoto等人[3]發(fā)現(xiàn)MSCs細(xì)胞可分泌大量的ASNS，補(bǔ)充ALL細(xì)胞L-asp化療后門(mén)冬酰胺的消耗而導(dǎo)致耐藥。

在本研究中，L-asp處理單獨(dú)培養(yǎng)組后，Jurkat細(xì)胞株細(xì)胞凋亡率升高，其ASNS的mRNA表達(dá)水平升高，說(shuō)明Jurkat細(xì)胞株對(duì)L-asp敏感，L-asp消耗ASN后可至Jurkat細(xì)胞株中ASNS代償性升高；用L-asp處理共培養(yǎng)組后，Jurkat細(xì)胞的凋亡率也有升高，但ASNS mRNA表達(dá)水平明顯降低，這提示共培養(yǎng)組中MSCs可通過(guò)減少Jurkat細(xì)胞株的凋亡從而影響L-asp治療的敏感性，其ASNS mRNA的表達(dá)降低，可能是因共培養(yǎng)模型中的MSCs高表達(dá)ASNS mRNA，從而減少Jurkat細(xì)胞株ASNS mRNA的表達(dá)。

在評(píng)估MSCs對(duì)Jurkat的影響時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)組中Jurkat凋亡率較單獨(dú)培養(yǎng)組低，其ASNS mRNA表達(dá)水平明顯降低；L-asp處理的共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組相比，Jurkat細(xì)胞株的凋亡率也降低，ASNS mRNA的表達(dá)水平卻無(wú)明顯變化。說(shuō)明骨髓MSCs雖然可以增強(qiáng)Jurkat細(xì)胞株的抗凋亡能力，但在共培養(yǎng)模型中L-asp仍可起部分作用，MSCs高表達(dá)ASNS mRNA并抑制Jurkat中ASNS mRNA的表達(dá)，L-asp可使Jurkat中ASNS mRNA的表達(dá)升高，在MSCs與L-asp兩者的共同作用下，共培養(yǎng)組中Jurkat細(xì)胞株的ASNS mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化。

現(xiàn)今兒童ALL常用化療方案中均采用長(zhǎng)春新堿(VCR)和L-asp序貫治療，這種序貫治療的原則是，VCR可能有助于抑制對(duì)L-asp的過(guò)敏性反應(yīng)[6]。同時(shí)，Li等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs對(duì)抗微管藥物敏感，如VCR。Fung等[14]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)VCR預(yù)處理共培養(yǎng)系統(tǒng)中的MSCs，可抑制部分MSCs對(duì)ALL保護(hù)作用。在本實(shí)驗(yàn)中用VCR預(yù)處理MSCs后，共培養(yǎng)組中Jurkat細(xì)胞株的凋亡率升高，證實(shí)了這理論。假設(shè)VCR可通過(guò)抑制MSCs ASNS mRNA的表達(dá)，減少天冬酰胺的分泌來(lái)抑制對(duì)ALL的保護(hù)作用，那么經(jīng)VCR預(yù)處理的共培養(yǎng)組中Jurkat細(xì)胞株經(jīng)L-asp誘導(dǎo)后其內(nèi)源性ASNS mRNA的表達(dá)水平會(huì)升高。而本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)卻顯示內(nèi)源性ANSN mRNA的表示水平只是稍有升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

究其原因，可能為VCR預(yù)處理MSCs后，只是部分抑制了MSCs的作用，而MSCs高表達(dá)ASNS mRNA，仍可部分或少量表達(dá)ASNSmRNA，分泌一些門(mén)冬酰胺來(lái)補(bǔ)償L-asp引起的消耗，因而共培養(yǎng)組中Jurkat細(xì)胞株不受L-asp的細(xì)胞毒性而致ASNS mRNA表達(dá)升高，比較L-asp處理的單獨(dú)培養(yǎng)組的凋亡率比共培養(yǎng)組高，與這一假設(shè)吻合。另一可能原因是VCR預(yù)處理MSCs 3d后，洗掉殘留的VCR，再用此MSCs共建培養(yǎng)組培養(yǎng)2d，此時(shí)MSCs細(xì)胞的已部分得到恢復(fù)，可部分表達(dá)ASNSmRNA。Li等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)，予臨床用藥濃度VCR(0.1μmol/L),處理MSCs 3d后，可使MSCs的早期及晚期凋亡率達(dá)57.7%，然而撤藥后MSCs的凋亡率可得到部分恢復(fù)。

關(guān)于MSCs對(duì)白血病細(xì)胞的保護(hù)作用眾多復(fù)雜，如，有研究發(fā)現(xiàn)在酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療慢性髓性白血病期間，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)在MSCs中的表達(dá)增加，并保護(hù)白血病細(xì)胞[15]。Park等[16]的研究表明基質(zhì)細(xì)胞中蛋白激酶C-β(PKC-β)的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的植入和正常B1細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要，抑制基質(zhì)細(xì)胞中的PKC-β可減輕環(huán)境介導(dǎo)的耐藥性。因此，不排除其他凋亡機(jī)制引起的共培養(yǎng)模型中Jurkat細(xì)胞株的凋亡率改變。

綜上所述，本文再次闡明ALL兒童骨髓MSCs影響白血病細(xì)胞對(duì)治療的敏感性及可能作用機(jī)制，下一步應(yīng)該更深化相關(guān)機(jī)制及其與臨床治療反應(yīng)、預(yù)后關(guān)系的研究，靶向MSCs或其分泌的因子可能是克服耐藥問(wèn)題的有效策略。