高效液相色譜法同步測(cè)定甜葉菊提取物中7 種綠原酸

賈 錚， 徐思遠(yuǎn)， 楊建中， 池 磊， 李亞靜，李 蘭， 崔 婕， 肖志明， 李 陽(yáng)， 樊 霞*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081；2.新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊 830063；3.諸城市浩天藥業(yè)有限公司，山東諸城 262218）

隨著2020 年全面禁止在飼料中添加抗生素，藥食同源的植物提取物作為新型飼料添加劑將成為替抗領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn) （曾建國(guó)，2020； 王平，2018）。甜葉菊中綠原酸類物質(zhì)含量豐富，主要含有綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C 等， 含量可達(dá)1.7%～7.2%（徐美利等，2021）。因具有促生長(zhǎng)、抗氧化、改善腸道菌群等功效，綠原酸已被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)為新飼料添加劑（王智勇等，2021）。 目前甜葉菊主要為生產(chǎn)甜菊糖苷的原料， 在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量廢渣，若其中的活性成分沒(méi)有得到高效、合理的利用，反而會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染（孔智偉等，2017），因此針對(duì)甜葉菊中綠原酸等活性成分開(kāi)發(fā)和利用的研究尤為重要。 張民達(dá)等（2020）建立了以綠原酸為內(nèi)標(biāo)，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定甜葉菊原料中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C 6 種多酚類成分含量的方法，該法相對(duì)校正因子的耐用性良好，15 批甜葉菊原料一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法所得結(jié)果無(wú)顯著差異。李華麗等（2017）建立了測(cè)定甜葉菊葉中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C 6 種酚酸類成分的高效液相色譜法。 9 批樣品中6 個(gè)酚酸之和為1.18%～6.67%，回收率、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均符合有關(guān)規(guī)定。 Zhao 等（2019）對(duì)甜葉菊提取物中的酚類化合物進(jìn)行了鑒定，研究顯示，其含有豐富的綠原酸類、咖啡酸類、槲皮苷、槲皮素等8種活性成分，且具有良好的自由基清除能力和抗炎作用。Yu 等（2017）對(duì)甜葉菊莖提取物中香草酸、原兒茶酸、咖啡酸、綠原酸和隱綠原酸5 種酚類化合物進(jìn)行了鑒定， 并研究了其對(duì)魚油的抗氧化能力。本文旨在建立甜葉菊提取物中7 種綠原酸類成分的高效液相色譜分析方法，為甜葉菊提取物的質(zhì)量控制和有效利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 UFLC-20A 液相色譜儀（日本Shimadzu 公司），配有2 個(gè)單獨(dú)的超高壓輸液泵（LC-20ADXR）、自動(dòng)進(jìn)樣器（SIL-20AXR）、柱溫箱（CTO-20A）、 二極管陣列檢測(cè)器 （SPD-M20A）；SK3300LHC 超聲器 （上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；BP310/310g 型分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

綠原酸及其類似物標(biāo)準(zhǔn)品：綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C（上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Fisher 公司）；其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Mili-Q 純化的超純水（＞18.2 MΩ）。 實(shí)驗(yàn)樣品由諸城市浩天藥業(yè)有限公司提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取7 種綠原酸及其類似物標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg， 加入甲醇溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中保存。分別移取一定體積上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水稀釋，配制成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse XDBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液（流動(dòng)相A）-乙腈（流動(dòng)相B）；流速：1.0 mL/min，梯度淋洗（梯度淋洗程序見(jiàn)表1）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；進(jìn)樣量：10 μL；λ＝327 nm；外標(biāo)法定量。

表1 梯度淋洗表

1.4 樣品制備 稱取0.05 g 甜葉菊提取物樣品，置于100 mL 容量瓶中，加入50%甲醇溶液70 mL，超聲提取30 min， 用50%甲醇溶液定容至刻度，樣品溶液上機(jī)檢測(cè)前過(guò)0.45 μm 濾膜。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法條件優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用二極管陣列檢測(cè)器在200 ～400 nm 波長(zhǎng)掃描得到新綠原酸、 綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 7 種化合物的光譜圖，如圖1 所示。結(jié)果表明，7 種化合物在波長(zhǎng)327 nm 左右均有較大吸收峰，因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。

圖1 7 種綠原酸及其類似物光譜圖

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 通過(guò)檢索文獻(xiàn)， 綠原酸及其類似物的色譜分離主要采用甲酸、磷酸溶液，與有機(jī)流動(dòng)相（甲醇、乙腈）按照一定比例進(jìn)行梯度淋洗， 從而使得各化合物有效分離并檢測(cè)。 本研究對(duì)甲酸溶液-乙腈、甲酸溶液-甲醇、磷酸溶液-乙腈、磷酸溶液-甲醇4 種流動(dòng)相體系，通過(guò)優(yōu)化對(duì)應(yīng)的色譜條件并進(jìn)行比較，最終選擇穩(wěn)定性、重復(fù)性較好的甲酸溶液-乙腈體系作為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min， 并采用梯度淋洗進(jìn)行各化合物分離， 分離后的7 種綠原酸及其類似物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 7 種綠原酸及其類似物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.1.3 色譜柱溫的選擇 分別考察了25、30、35、40、50 ℃時(shí)7 種綠原酸及其類似物的分離情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，隨著色譜柱溫度的升高，各化合物的保留時(shí)間逐漸減少，基線漂移逐漸明顯，色譜柱溫度達(dá)到35 ℃時(shí)， 洋薊素峰型呈現(xiàn)顯著變化，峰形展寬，峰高下降；而色譜柱溫度為40 ℃時(shí)，綠原酸與隱綠原酸、異綠原酸B 與異綠原酸A分離度下降，無(wú)法達(dá)到基線分離。 綜合考慮各組分有效分離的情況，色譜柱溫度確定為30 ℃。

圖3 7 種綠原酸及其類似物在不同柱溫下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.1.4 色譜柱的選擇 從綠原酸及其類似物的結(jié)構(gòu)及物理化學(xué)性質(zhì)分析判斷， 采用反相液相色譜法進(jìn)行分離測(cè)定。 在色譜柱選擇方面，比較了6 種不同品牌和型號(hào)的C18色譜柱對(duì)綠原酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分離情況， 各色譜柱型號(hào)規(guī)格及系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。 通過(guò)各化合物的保留時(shí)間、出峰峰型、分離度等綜合比較分析，選擇ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）作為分析柱。

表2 不同品牌規(guī)格色譜柱色譜系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)試結(jié)果

2.1.5 提取溶劑的選擇 本研究中的7 種綠原酸及其類似物均溶于水、甲醇及丙酮，極微溶于乙酸乙酯，且甜葉菊提取物基質(zhì)較簡(jiǎn)單，蛋白質(zhì)、脂肪等干擾組分含量較小。 為此， 比較了不同溶液作為提取劑的提取效果，結(jié)果見(jiàn)表3。 結(jié)果表明，對(duì)于大部分化合物，水作為提取劑回收率較好，但對(duì)異綠原酸C 的提取效率較低；10%甲醇溶液、50%乙腈溶液、10%乙腈溶液提取均出現(xiàn)個(gè)別化合物提取效率低的情況。綜合比較，50%甲醇溶液作為提取劑的提取效果最高，最終選用50%甲醇溶液作為提取溶劑。

表3 使用不同提取劑的測(cè)定結(jié)果（n=3）%

2.1.6 稱樣量的選擇 分別準(zhǔn)確稱取0.02、0.05、0.10、0.50 g 和1.0 g 樣品， 置于100 mL 容量瓶中， 加入50%甲醇溶液70 mL， 選擇超聲時(shí)間為30 min 進(jìn)行提取并測(cè)定其含量，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，不同稱樣量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在顯著差異，稱取0.02、0.05 g 樣品進(jìn)行提取后的測(cè)定結(jié)果比較接近；當(dāng)稱樣量大于0.10 g 時(shí)，提取效率顯著下降，各綠原酸組分的測(cè)定值與稱樣量0.02、0.05 g 時(shí)相比，測(cè)定含量下降2 至15 倍，表明增加稱樣量時(shí)，提取不完全，提取效率下降。 為保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和重復(fù)性，確定0.05 g 作為樣品的稱樣量。

表4 不同稱樣量的檢測(cè)結(jié)果比較（n=3）%

2.1.7 提取時(shí)間的選擇 準(zhǔn)確稱取0.05 g 樣品于100 mL 容量瓶中，加入70 mL 50%甲醇溶液，選擇超聲時(shí)間為10、20、30、40 min 進(jìn)行提取，測(cè)定其含量。結(jié)果表明，超聲提取20 min 的提取效果稍優(yōu)于10 min， 與30 min 和40 min 的結(jié)果基本一致。 因此，確定30 min 作為方法的超聲提取時(shí)間。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍 配制新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 7 種化合物系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 在優(yōu)化的色譜條件下依次進(jìn)樣，重復(fù)3 次，以峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，7 種綠原酸及其類似物的線性范圍、 線性方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表5。 7 種化合物在線性范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

表5 7 種綠原酸及其類似物的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.2.2 方法檢出限和定量限 在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)， 不斷稀釋提取溶液并上機(jī)測(cè)定，以3 倍信噪比（S/N）作為方法的檢出限，以10 倍信噪比（S/N）作為方法的定量限，各目標(biāo)化合物的檢出限和定量限見(jiàn)表6。

表6 7 種綠原酸及其類似物的檢出限和定量限mg/kg

2.2.3 方法回收率和精密度考察 精密稱取樣品0.05 g，置于100 mL 棕色量瓶中，添加不同含量的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸B、 異綠原酸A、 異綠原酸C 標(biāo)準(zhǔn)溶液制成含0.2%、0.4%、1.0%的樣品，每個(gè)添加濃度進(jìn)行6 次平行測(cè)定，并重復(fù)3 次，計(jì)算回收率、批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表7。 7 種綠原酸及其類似物的平均回收率為95.10% ～102.63%， 批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。 結(jié)果表明，該方法對(duì)甜葉菊提取物中7 種綠原酸及其類似物的含量測(cè)定均有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表7 7 種綠原酸及其類似物的加標(biāo)回收率和精密度%

3 結(jié)論

本研究建立了甜葉菊提取物中綠原酸、 新綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸B、異綠原酸A、 異綠原酸C 7 種綠原酸及其類似物含量的分析方法。以超聲提取法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，以甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相， 采用梯度淋洗進(jìn)行各化合物的分離， 各組分在12 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效分離。本研究建立的方法準(zhǔn)確度和重復(fù)性較好， 可滿足甜葉菊提取物中綠原酸及其類似物定性和定量分析的需求， 為甜葉菊提取物有效成分的質(zhì)量控制提供了一種可靠的分析方法。