半疏水基質陰離子交換晶膠對α-酮異己酸的層析吸附特性

曲 興, 樓小玲, 張頌紅, 贠軍賢

半疏水基質陰離子交換晶膠對-酮異己酸的層析吸附特性

曲 興, 樓小玲, 張頌紅, 贠軍賢

(浙江工業(yè)大學 化學工程學院, 綠色化學合成技術國家重點實驗室培育基地, 浙江 杭州 310032)

針對微生物法制備-酮異己酸中目標物分離純化困難的問題，以甲基丙烯酸羥乙酯和甲基丙烯酸丁酯為基質單體，采用冷凍結晶致孔和聚合法，制備半疏水基質晶膠，并接枝-三甲基乙烯基苯甲氯化銨，得到半疏水基質陰離子交換晶膠，用于-酮異己酸的層析分離。結果表明：在流速為1 cm×min-1和上樣質量濃度為2.0 mg×mL-1的條件下，半疏水基質陰離子交換晶膠對牛血清白蛋白和-酮異己酸的吸附容量分別達4.42和17.56 mg×mL-1，其對-酮異己酸的吸附容量隨NaCl濃度的增大而降低，且用濃度高于0.3 mol×L-1的NaCl溶液可實現(xiàn)洗脫。研究結果可為微生物法制備-酮異己酸的分離材料選用提供參考。

-酮異己酸；晶膠；層析；分離

1 引 言

-酮異己酸(-ketoisocaproate，KIC)，即4-甲基-2-氧代戊酸，是一種高值有機酸，存在于人體血液和肌肉中，維持體內氧化還原環(huán)境。在轉氨酶的作用下，KIC可與L-亮氨酸相互轉化，共同調節(jié)和維持人體代謝平衡，同時具有促進骨骼肌合成、調節(jié)體內氮平衡和血糖平衡等作用，在醫(yī)學應用領域有重要價值[1-5]。此外，KIC常作為中間體參與有機合成和生物合成過程，在化工、食品和飼料等其他領域也有廣闊應用前景[6-8]。

KIC合成方法主要有化學法、微生物法和酶法?；瘜W法有?；杌锼夥╗9]、草酸類乙酯水解法[10]和海因法[11]，其不僅反應條件苛刻，而且需要添加氰化物和貴金屬催化劑，反應過程復雜且副產物較多。酶法[12-13]存在酶的穩(wěn)定性不高、成本昂貴和轉化率較低等問題。微生物法主要為谷氨酸棒桿菌工程菌株發(fā)酵合成[14-15]和全細胞轉化合成[16]等方法，具有反應條件溫和、成本低、環(huán)境友好、操作簡單等優(yōu)點，但所得KIC常常存在于含有微生物細胞的復雜發(fā)酵液或轉化液中，分離純化困難。因此，探索KIC的高效分離新方法，具有重要意義。

近年來，晶膠作為一種具有超大孔隙的新型層析材料，在生化分離領域受到廣泛關注。晶膠主要通過單體經(jīng)冷凍結晶致孔和聚合反應制備得到，其內部為尺寸在數(shù)微米到數(shù)百微米的相互連通的發(fā)達孔隙，具有生物相容性好、傳質阻力小和分離迅速等優(yōu)點，在生化分離領域具有良好應用前景。但是，晶膠用于層析分離時，其本身吸附能力較弱，通常需要結合目標物分子的特性，如親疏水性、電荷特征、功能基團等，通過接枝修飾或引入配基以提高其選擇性吸附能力[17-19]。本課題組將聚甲基丙烯酸羥乙酯晶膠接枝-三甲基乙烯基苯甲氯化銨((vinylbenzyl)trimethylammonium chloride，VBTAC)，得到具有陰離子交換功能的晶膠介質，實現(xiàn)了一步法從澄清轉化液中分離苯乳酸，苯乳酸質量分數(shù)達96.7%～98.6%[20]。

然而，目前國內外報道的晶膠介質主要是親水基質的分離介質。最近，本課題組將疏水單體和親水單體經(jīng)結晶致孔和共聚，得到一種新型晶膠介質，即半疏水基質晶膠。這種晶膠具有部分疏水、部分親水的基質骨架，有利于具有部分疏水的生物分子物質的吸附和分離，在生物分離領域具有重要的應用前景。苯乳酸和-酮異己酸等生物有機酸的分子結構中有疏水鏈和親水基團，其在半疏水基質晶膠中的吸附和分離與親水基質晶膠中有所不同。半疏水基質晶膠有望在-酮異己酸分離方面表現(xiàn)出獨到的優(yōu)勢。

本研究以親水性甲基丙烯酸羥乙酯(2-hydroxyethy methacrylate，HEMA)和疏水性甲基丙烯酸丁酯(butyl methacrylate，BMA)作為混合單體，通過冷凍結晶致孔和聚合，制備半疏水基質晶膠；然后通過接枝VBTAC進行化學修飾，得到具有陰離子交換功能的半疏水基質陰離子交換晶膠，簡稱陰離子交換晶膠。測定了其滲透率、軸向擴散和蛋白吸附能力等基礎性能，并探究其對KIC的吸附和分離性能，為下一步從復雜料液中分離KIC奠定基礎。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

-酮異己酸(KIC，99%)，上海阿拉丁；甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA，97%)、聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate，PEGDA，相對分子質量的n=250)、四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，TEMED，99%)，Sigma-Aldrich；甲基丙烯酸丁酯(BMA，99%)、十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate，SDS，98%)、過硫酸銨(ammonium persulfate，APS，98%)、,,-三甲基乙烯基苯甲氯化銨(VBTAC，99%)及其他試劑均為國產分析純。百分數(shù)均為質量分數(shù)。

2.1.2 儀器

高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)，Shimadzu LC-16/16P，日本島津；紫外-可見光分光光度計，Ultrospec 3300 pro，GE Healthcare；超純水系統(tǒng)，Milli-Q Synthesis，美國Millipore公司；低溫恒溫槽(THD-3030)、數(shù)控超級恒溫槽(SC-15)，寧波天恒儀器廠。

2.2 實驗方法

2.2.1 陰離子交換晶膠的制備

將單體HEMA、BMA和PEGDA溶于質量分數(shù)為10% 的SDS溶液中，配制單體質量分數(shù)為10% 的混合液，其中HEMA、BMA和PEGDA分別占溶液總質量的3.5%、3.5% 和3%。以APS為引發(fā)劑，TEMED為加速劑，其質量分別占單體(HEMA、BMA和PEGDA)總質量的1.5% 和3%。采用冷凍結晶致孔和聚合反應法制備p(HEMA-BMA)晶膠介質，整個晶膠介質的制備過程包括配液、預冷、混合、灌注、解凍和除雜6個步驟[21]。

采用孔內原位接枝法，以二過碘酸合銅鉀(K5[Cu(HIO6)2])為催化劑[22]，在p(HEMA-BMA)晶膠柱上接枝單體VBTAC，得到具有陰離子交換功能的晶膠介質p(HEMA-BMA)-VBTAC[20]。

2.2.2 陰離子交換晶膠基礎性能測試

陰離子交換晶膠柱長42 mm，直徑10 mm，柱體積3.28 mL。對晶膠柱的基礎性能進行測試，主要包括微觀結構特征SEM測試[23]、停留時間分布(RTD)測試[19]、軸向擴散[24]、滲透率[25]以及孔隙率[23]。前人常用牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)作為模型蛋白，對不同陰離子交換晶膠的吸附性能進行評價。為了便于對比，本研究以BSA為模型蛋白，對所得陰離子交換晶膠的基礎吸附性能進行測定和評價[26]。

2.2.3 陰離子交換晶膠對KIC的吸附特性

采用文獻[20]中方法，探究氯化鈉濃度對KIC在p(HEMA-BMA)-VBTAC陰離子交換晶膠中吸附性能的影響：配制濃度為0、0.001、0.01、0.1和0.3 mol×L-1的氯化鈉水溶液，將KIC分別溶解于相應氯化鈉溶液中，配制成質量濃度為1、5、10、15和20 mg×mL-1的KIC溶液，體積為20 mL。以不同濃度的氯化鈉溶液作為緩沖溶液，平衡晶膠層析柱；將含有KIC的氯化鈉溶液循環(huán)上樣，流速為1.0 cm×min-1，整個過程采用紫外檢測器同步檢測，波長為220 nm。待KIC溶液在晶膠中吸附平衡，用緩沖液沖洗，除去未吸附的KIC，用1 mol×L-1的氯化鈉溶液進行洗脫，將循環(huán)上樣的KIC溶液和洗脫液進行HPLC檢測，計算陰離子交換晶膠中KIC的吸附量。

根據(jù)物料衡算，通過吸附前后KIC濃度計算單位體積晶膠介質對KIC的吸附容量，如式(1)[21]：

采用Langmuir吸附平衡方程對吸附等溫線進行擬合，如式(2)[21]：

式中：m為飽和吸附容量(mg×mL-1)，d為解離常數(shù)(mg×mL-1)。

2.2.4 陰離子交換晶膠對KIC的層析分離特性

以不同濃度的氯化鈉溶液為溶劑，分別配制質量濃度為2.0 mg×mL-1的KIC溶液，探究KIC在p(HEMA-BMA)-VBTAC晶膠柱中的層析情況。用超純水作為緩沖液，平衡晶膠層析柱，將配好的KIC溶液上樣，直到紫外信號值上升至最大且穩(wěn)定，用緩沖液進行沖洗，用1 mol×L-1的氯化鈉溶液進行洗脫，流速為1.0 cm×min-1。收集上樣與沖洗過程床柱流出液，進行HPLC檢測，計算不同氯化鈉濃度下KIC在陰離子交換晶膠中的層析過程動態(tài)和吸附容量。

3 結果與討論

3.1 陰離子交換晶膠微觀結構

圖1為p(HEMA-BMA)-VBTAC陰離子交換晶膠介質在掃描電鏡不同放大倍數(shù)下的微觀結構。由圖1可見，晶膠介質微觀結構清晰，內部存在分布均勻的超大孔隙，且孔隙相互連通，其尺寸為10～100mm。該晶膠介質的超大孔隙結構不僅能夠滿足流體在其內部低阻力流動，也可滿足生物大分子和細胞通過，有利于從含細胞微生物發(fā)酵液進行KIC的層析分離。實驗測得晶膠介質有效孔隙率和絕干孔隙率分別為73.53%和82.43%。

圖1 陰離子交換晶膠掃描電鏡圖

3.2 陰離子交換晶膠基礎性能

實驗所得陰離子交換晶膠p(HEMA-BMA)-VBTAC的基礎性能如圖2所示。圖中，為停留時間分布函數(shù)(s-1)，q為流量(mL×min-1)，L為流速(cm×min-1)，load為層析收集體積(mL)，Dw為壓降(Pa)。

圖2 陰離子交換晶膠基礎性能

圖2(a)為不同流速下的RTD曲線，在測試過程中，晶膠層析柱在流速1～5 cm×min-1內操作均無明顯壓縮，說明該晶膠介質可以適應較大流速范圍的層析分離，與親水基質的pAAM-AMPSA[27]和pHEMA-VBTAC[20]晶膠相似。晶膠床柱RTD峰形對稱性良好，無明顯拖尾現(xiàn)象，流體在晶膠介質內分布均勻，流體返混和壁流現(xiàn)象明顯較弱，對流傳質過程較強。

圖2(b)是不同流速下的等板高度HETP，隨著流速的增大，陰離子交換晶膠的等板高度HETP沒有明顯變化，說明床層穩(wěn)定性良好，HETP維持在0.061～0.079 cm，明顯小于Guan等[20]所得晶膠介質pHEMA-VBTAC的HETP 0.16～0.18 cm，說明p(HEMA-BMA)-VBTAC引入BMA單體后晶膠介質柱內床層結構更好，孔隙度更為均勻，理論塔板數(shù)大，層析分離能力高。

圖3 不同氯化鈉質量濃度下KIC的Langmuir等溫吸附曲線

表1 不同氯化鈉濃度下KIC的飽和吸附容量Qm和解離常數(shù)Kd

圖2(c)是以體積分數(shù)為50% 的乙醇溶液測定的床層壓降Dw與流量q關系曲線，由圖可見，壓降與流量之間線性關系良好，計算得到的晶膠柱滲透率w為6.29′10-13m2，與親水基質pHEMA-VBTAC晶膠[20]相比，有所減小。

圖2(d)為不同流速條件下BSA的層析動態(tài)曲線，由圖可見，在流速分別為1.0、3.0、5.0 cm×min-1條件下，BSA層析曲線接近。通過檢測和計算可得BSA的吸附容量分別為4.58、4.62和4.42 mg×mL-1，表明該晶膠介質對BSA吸附能力較強，在高流速下依然可以保持高吸附容量，有助于進一步在高流速下對KIC進行層析分離。與親水基質pHEMA-VBTAC晶膠[20]相比，吸附容量顯著提高，表明疏水單體BMA的加入，使得晶膠介質兼具疏水和離子交換作用，提高了高值有機物在晶膠介質中的吸附容量。

3.3 α-酮異己酸在陰離子交換晶膠中的吸附與分離性能

3.3.1-酮異己酸在陰離子交換晶膠中的吸附性能

在-酮異己酸的實際生物合成過程中，發(fā)酵液或轉化液中通常含有不同種類的離子、殘?zhí)?、代謝產物等雜質，對晶膠吸附有重要影響。而在其分離過程中，如何方便地將-酮異己酸從陰離子交換晶膠中洗脫，是需要首先解決的問題。鹽是影響晶膠層析和洗脫的重要因素，研究鹽濃度對吸附能力的影響具有重要意義。為了探索鹽度對-酮異己酸在陰離子交換晶膠中的吸附性能和分離規(guī)律，本研究在濃度為0～0.3 mol×L-1的氯化鈉溶液中，按2.2.3節(jié)所述實驗方法測定陰離子交換晶膠對KIC的吸附量，并將得到KIC的Langmuir等溫吸附數(shù)據(jù)進行擬合，結果如圖3所示?？梢钥闯觯}濃度對陰離子交換晶膠吸附KIC有顯著影響。通過吸附等溫式得到不同鹽濃度下KIC的飽和吸附容量m和解離常數(shù)d等吸附平衡參數(shù)，如表1所示。

當氯化鈉濃度為0 mol×L-1時，晶膠層析柱對KIC吸附容量最大，高達39.0 mg×mL-1，解離常數(shù)為3.56 mg×mL-1，表明陰離子交換晶膠對KIC具有較高吸附容量。隨著鹽濃度的增大，吸附容量呈現(xiàn)下降趨勢，尤其是鹽濃度由0.001升至0.01 mol×L-1時，KIC的吸附容量由36.69下降至12.65 mg×mL-1；鹽濃度由0.1提升至0.3 mol×L-1時，KIC的吸附容量由8.89下降至6.01 mg×mL-1，解離常數(shù)整體呈現(xiàn)上升的趨勢。表明在層析過程中用濃度高于0.3 mol×L-1的氯化鈉溶液，即可實現(xiàn)洗脫。

3.3.2-酮異己酸在陰離子交換晶膠中的層析分離性能

實驗進一步探究了氯化鈉濃度對KIC在陰離子交換晶膠層析柱中吸附性能的影響，層析過程中KIC在晶膠中的濃度變化及吸附容量如圖4所示。在層析過程中，當KIC溶液流經(jīng)晶膠介質時，KIC會與晶膠中的陰離子交換官能團以離子交換作用和靜電引力作用相結合；但隨著上樣體積的增加，晶膠介質對KIC的吸附能力減弱，越來越多的KIC穿過晶膠介質被收集，直至吸附飽和。圖4(a)中上樣階段呈現(xiàn)出KIC濃度逐漸上升且最終趨向平緩的趨勢。而氯化鈉具有的屏蔽效應和可以占據(jù)晶膠介質中吸附位點的特性，會對KIC溶液在晶膠層析柱中流動與吸附性能產生顯著影響，隨著氯化鈉濃度增大，KIC濃度上升坡度越大，達到最大濃度越快，說明高濃度鹽會加快KIC穿透晶膠介質，降低晶膠介質對KIC的吸附能力。用超純水作為緩沖液，將未被吸附的KIC沖洗下來后，用1 mol×L-1NaCl作為洗脫液，將吸附在晶膠層析柱中的KIC進行洗脫，從圖4(a)可見，洗脫峰的峰形對稱，且氯化鈉濃度越低，洗脫峰越高。

圖4 不同鹽濃度下α-酮異己酸的層析過程及吸附容量

通過計算得到不同氯化鈉濃度下KIC層析過程的吸附容量，如圖4(b)所示?？梢姡琄IC的吸附容量隨著氯化鈉濃度的增大呈現(xiàn)下降的趨勢，與吸附實驗結果類似。層析過程溶液中上樣液中KIC質量濃度僅為2 mg×mL-1，尚沒有達到飽和吸附的濃度。當無氯化鈉時，KIC吸附容量最大，達17.56 mg×mL-1；當氯化鈉濃度為0.3 mol×L-1時，KIC吸附容量最小，僅為1.06 mg×mL-1，說明提高鹽濃度可以方便地洗脫。表明陰離子交換晶膠層析柱對KIC的吸附容量大，洗脫方便，可用于下一步從復雜料液中層析分離KIC。但是，由于真實KIC發(fā)酵液中往往存在細胞、培養(yǎng)基和亮氨酸等其他代謝產物，在一定程度上會影響KIC的競爭吸附，因此，需要對層析條件做更深入的實驗研究。

4 結 論

以甲基丙烯酸羥乙酯和甲基丙烯酸丁酯作為復合單體材料，經(jīng)過冷凍結晶聚合和原位接枝，制備得到具有陰離子交換功能的p(HEMA-BMA)-VBTAC陰離子交換晶膠層析介質。該層析介質具有良好的軸向擴散性能和孔隙結構，有效孔隙率為73.53%，絕干孔隙率為82.43%，在流速為1.0、3.0、5.0 cm×min-1下，BSA蛋白吸附容量分別為4.58、4.62和4.42 mg×mL-1，吸附能力穩(wěn)定。-酮異己酸在該晶膠層析介質中循環(huán)上樣吸附過程中，呈現(xiàn)出較強的鹽敏感性，當無氯化鈉時，陰離子交換晶膠對KIC的最大吸附容量為39.00 mg×mL-1；當鹽濃度超過0.3 mol×L-1時，KIC吸附容量迅速降低。因此，可以通過提高鹽濃度實現(xiàn)洗脫，方便-酮異己酸的高效分離。

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Chromatographic and adsorption characteristics of-ketoisocaproate in semi-hydrophobic anion exchange croygel

QU Xing, LOU Xiao-ling, ZHANG Song-hong, YUN Jun-xian

(State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology,College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China)

Semi-hydrophobic anion exchange cryogel was prepared by cryo-polymerization using 2-hydroxyethy methacrylate and butyl methacrylate as the key monomers via graft polymerization with monomer (vinylbenzyl)trimethylammonium chlorid, which was used for the separation of-ketoisocaproate prepared by biological methods. The results show that the binding capacity of the semi-hydrophobic cryogel for bovine serum albumin and-ketoisocaproate were 4.42 and 17.56 mg×mL-1, respectively, when the loading concentration is 2.0 mg×mL-1at the flow velocity of 1 cm×min-1. The adsorption capacity for-ketoisocaproate decreased with the increase of NaCl concentration and the elution was achieved by increasing NaCl concentration over 0.3 mol×L-1.The results of this work are helpful for the selection of materials for-ketoisocaproate acid separation from biological preparation.

-ketoisocaproate; croygel; chromatography; separation

TQ028

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2022.01.006

1003-9015(2022)01-0046-07

2021-07-20；

2021-10-10。

國家自然科學基金(22078296，21576240)；浙江省自然科學基金(LD21B060001)。

曲興(1993-)，男，山東青島人，浙江工業(yè)大學碩士生。

張頌紅，E-mail：zhangsh@zjut.edu.cn

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