云木香揮發(fā)油成分的GC-MS分析研究

謝柱添，余冰瑩，楊秋霞，羅枝偉，潘文龍，陳 泳**

(1.廣東省科學(xué)院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省工業(yè)助劑逆向工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070；2.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 511400；3.中國科學(xué)院華南植物園公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510650)

云木香是常見的中藥材之一，又名廣木香，具有多種生物活性，常用于行氣止痛、健脾消食[1-3]。云木香的化學(xué)成分較為復(fù)雜，其中的萜類物質(zhì)含量最高，主要集中在揮發(fā)油部位[4-6]。目前,針對揮發(fā)油的提取手段主要有水蒸氣蒸餾法[7-8]、溶劑提取法(索氏提取法)[9-10]、超臨界CO2萃取法[11-12]、微波萃取法[13-14]和固相微萃取法[15-16]等。針對不同種類木香存在售賣混亂的現(xiàn)象，需加強(qiáng)對木香各方面的研究，建立一種對木香的品質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定分析的標(biāo)準(zhǔn)。

2020版《中國藥典》中采用高效液相色譜法對云木香中的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯進(jìn)行含量測定，而GC-MS技術(shù)更適用于揮發(fā)油成分的檢測。目前有許多科研人員將GC-MS技術(shù)應(yīng)用在揮發(fā)油成分較豐富的中藥材的質(zhì)量控制上，為其在云木香質(zhì)量控制的應(yīng)用起一定的鋪墊和推動(dòng)作用。本文采用GC-MS技術(shù)對通過水蒸氣蒸餾法和索氏提取法提取的不同批次云木香揮發(fā)油，以及經(jīng)過硅烷化處理的云木香揮發(fā)油進(jìn)行成分的分析和對比。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890B/5977B型GC-MS聯(lián)用儀(美國Aglient公司，配有電子轟擊離子源(EI)和GCMSD數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

云木香(批次：181001421(A)和20180517(B)，購于廣東省廣州市)；二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯(AR)；石油醚(AR，30～60 ℃)；吡啶(AR，w≥99.5%，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司)；N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(96%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；三甲基氯硅烷(w>98.0%，上海麥克林生化科技有限公司)。

1.2 樣品處理

將云木香用烘箱 40 ℃ 烘烤 1 h 后，粉碎過三號(hào)篩(粒徑為355±13 μm )。

水蒸氣蒸餾：準(zhǔn)確稱取20.0000 g粉碎后的樣品，加 200 mL 狜純化水常溫浸泡 30 min，提取揮發(fā)油。用氯仿進(jìn)行分配除去水分，收集氯仿層，吹干氯仿層得純揮發(fā)油HA、HB。移取 1.0 μL 揮發(fā)油，用 1 mL 二氯甲烷溶解配制，待進(jìn)樣。

分段索氏提?。簻?zhǔn)確稱取 1.0000 g 粉碎后的樣品，采用索氏提取裝置，石油醚 80 ℃ 回流提取 2 h，濃縮得石油醚提取產(chǎn)物SPB。再使用二氯甲烷進(jìn)行 55 ℃ 回流提取 2 h，濃縮得二氯甲烷提取產(chǎn)物SDB。再使用乙酸乙酯 105 ℃ 回流提取 2 h，濃縮得乙酸乙酯提取產(chǎn)物SEB。進(jìn)樣前移取 1.0 μL 各溶劑提取產(chǎn)物，用 1 mL 二氯甲烷溶解配制，待進(jìn)樣。

硅烷化衍生：移取 20 μL 水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油于 5 mL 的具塞離心管中，加入 300 μL 的吡啶和 200 μL 的硅烷化試劑[V(MSTFA)∶V(TMCS)=99∶1)]，超聲 1 min，渦旋 1 min，85 ℃ 下衍生化 1 h，得揮發(fā)油硅烷化產(chǎn)物。進(jìn)樣前移取 15.0 μL 硅烷化產(chǎn)物，用 1 mL 二氯甲烷溶解配制，待進(jìn)樣。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

GC：HP-5MS (30 m×φ250 μm,0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱；升溫程序：60 ℃ 保持 3 min，以 25 ℃/min 升溫到 145 ℃ 保持 3 min 后，以 0.2 ℃/min 升溫到 147 ℃ 保持 2 min 后，以 0.8 ℃/min 升溫到 160 ℃ 保持 1 min 后，以 35 ℃/min 升溫到 300 ℃ 保持 3 min；汽化室溫度 250 ℃；載氣為高純氦氣(He)；總流量 104.2 mL/min；進(jìn)樣量為 1.0 μL；脈沖不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣脈沖壓力 172.38 kPa(25 psi)，時(shí)間 0.5 min。

MS：EI源；離子源溫度為 230 ℃；四級(jí)桿溫度為 150 ℃；電子能量為 70 eV；質(zhì)譜與氣相色譜連接口溫度 300 ℃；溶劑延遲時(shí)間 3 min；掃面質(zhì)量范圍為50.00～600.00 u。

1.4 GC-MS測定

自動(dòng)進(jìn)樣，用GC-MS技術(shù)分析，得到全成分總離子流圖(TIC)，將采得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，對比標(biāo)準(zhǔn)圖譜鑒定每個(gè)色譜峰的化學(xué)成分，用面積歸一法計(jì)算各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 云木香揮發(fā)油提取率的比較

由表1可知，HB比HA的含量少，推測B[云木香批次181001421(A)，20180517(B)]在炮制過程中受到較高溫度的烘烤，損失了部分的揮發(fā)性物質(zhì)。但作為中藥材，炮制能使藥效成分更容易被利用，所以經(jīng)過炮制的云木香有效活性成分的相對含量應(yīng)比未炮制的高。索氏提取法提油率大于水蒸氣蒸餾法，且隨著溶劑極性的升高，提油率降低，可見索氏提取法能提取極性較小的成分。

表1 云木香揮發(fā)油的提取率

2.2 不同批次的云木香揮發(fā)油成分檢測結(jié)果的比較

HA、HB的GC-MS檢測結(jié)果見圖1。

圖1 兩批次云木香揮發(fā)油GC-MS總離子流圖

圖2 云木香B不同溶劑提取物GC-MS總離子流圖

從中分別鑒定出63、59個(gè)化合物，其峰面積之和占總峰面積的99.06%、99.14%。由表2可知，HA中的主要成分有去氫木香內(nèi)酯(30.05%)、柏木烯醇(11.61%)、木香醇(11.43%)和二氫去氫木香內(nèi)酯(7.24%)等，萜類物質(zhì)占比為91.14%。HB的主要代表成分有去氫木香內(nèi)酯(30.66%)、柏木烯醇(11.85%)、木香醇(10.67%)和(Z,Z,Z)-1,8,11,14-十七烷四烯(8.77%)等，萜類物質(zhì)占比為85.55%。兩批次云木香揮發(fā)油中有38種化合物相同。兩批次含量最多的10種化合物中有9種相同，其中二氫去氫木香內(nèi)酯的含量差異較大，其他化合物的含量區(qū)別不顯著。總體來說，HA和HB的化學(xué)成分相似，所以推斷云木香質(zhì)量上差異有可能是主要成分的含量差異造成的。因此，可將去氫木香內(nèi)酯、柏木烯醇、木香醇、(Z,Z,Z)-1,8,11,14-十七烷四烯和二氫去氫木香內(nèi)酯作為檢測的指標(biāo)化合物對云木香進(jìn)行質(zhì)量評估。

2.3 不同提取方法所得云木香揮發(fā)油成分檢測結(jié)果的比較

索氏提取法得到的提取物的GC-MS總離子流圖見圖2，化學(xué)成分和含量分析見表2。

表2 云木香揮發(fā)油化學(xué)成分和相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表2(續(xù))

表2(續(xù))

從SPB、SDB和SEB中分別鑒定出35、21個(gè)和6個(gè)化合物，已檢出化合物峰面積占比為89.57%、90.22%和87.36%。

隨著提取溶劑極性的增加，提取率、分離組分?jǐn)?shù)和鑒定成分?jǐn)?shù)都降低，而主要成分的占比則升高，可見云木香揮發(fā)油中大部分物質(zhì)極性較低，主要成分極性偏高。從SPB、SDB和SEB中共鑒定出37種化合物，種類以萜醇和萜類內(nèi)酯居多，而HB中化合物種類以萜醇居多。水蒸氣蒸餾法提取化合物數(shù)量和種類較多。所以對質(zhì)量控制而言，云木香揮發(fā)油成分的提取適宜采用常規(guī)的水蒸氣蒸餾法。

2.4 云木香揮發(fā)油直接進(jìn)樣與硅烷化處理后進(jìn)樣檢測結(jié)果的比較

為研究云木香揮發(fā)油中因難汽化而不易被GC-MS檢測到的化學(xué)成分，本文對揮發(fā)油進(jìn)行硅烷化試劑衍生化處理，結(jié)果見圖3。

可明顯看出，硅烷化前后峰形出現(xiàn)的變化，硅烷化后的揮發(fā)油較處理前的出峰豐度高，出峰數(shù)目多。

對有偏移或增加的峰進(jìn)行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)有26個(gè)新出現(xiàn)的峰，通過還原化合物結(jié)構(gòu)式，得出23種未硅烷化前測不到的化合物，其中三甲基甲硅烷基酯-9,12-十八碳二烯酸的相對含量較高，可擬定為檢測指標(biāo)化合物。由于采用的硅烷化試劑是針對羥基和羧基等基團(tuán)上的活潑氫進(jìn)行取代，所以衍生化處理后，測得的化合物主要為萜醇、羧酸和萜烯酸類物質(zhì)，且硅烷化后，出現(xiàn)了甾類、羧酸和萜烯酸類物質(zhì)等處理前檢測不出的化合物，證明硅烷化處理能為檢測指標(biāo)化合物的增加提供可行性。

3 結(jié)論

本文利用GC-MS技術(shù)對提取的云木香揮發(fā)油進(jìn)行分析研究。初步判斷GC-MS技術(shù)可為中藥的鑒定及質(zhì)量評價(jià)提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。可依據(jù)GC-MS技術(shù)建立不同品質(zhì)云木香的鑒定指標(biāo)，完善評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，有利于規(guī)范市場銷售。進(jìn)一步的工作是針對初步選取的指標(biāo)化合物進(jìn)行生物活性的研究，并根據(jù)已選取的提取方法和指標(biāo)化合物，建立一套完整的云木香GC-MS檢測方法。