結(jié)直腸癌（CRC）中錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 及P53 的表達(dá)及其臨床意義

朱建雯，楊建梅，鄧慧，劉翔，吳凱逸，荀鵬

江蘇省揚(yáng)州市洪泉醫(yī)院病理科，江蘇揚(yáng)州 225200

結(jié)直腸癌（CRC）是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，發(fā)病率因胃腸鏡的使用逐年遞增， 發(fā)病年齡亦趨于年輕化[1]。 相關(guān)報(bào)道指出，CRC 的發(fā)病率高居惡性腫瘤第三，病死率高居第二[2-3]。因?yàn)楫?dāng)下飲食結(jié)構(gòu)攝取精細(xì)食物較多，營養(yǎng)過剩，加之運(yùn)動量減少，CRC 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高； 整個(gè)病情的進(jìn)展涉及不同種類基因蛋白組突變、多種途徑或通路。 CRC 的發(fā)病主要分為染色體不穩(wěn)定和微衛(wèi)星不穩(wěn)定兩種途徑。 微衛(wèi)星不穩(wěn)定主要是因DNA 錯(cuò)配修復(fù)缺陷導(dǎo)致。與微衛(wèi)星不穩(wěn)定相關(guān)的CRC 發(fā)病率約為15%[4]。 錯(cuò)配修復(fù)蛋白不表達(dá)、過度表達(dá)或表達(dá)缺失會引起基因突變，或DNA復(fù)制過程中甲基化失活，錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)功能異常，缺陷發(fā)生后造成微衛(wèi)星不穩(wěn)定的發(fā)生。 錯(cuò)配修復(fù)蛋白的正常表達(dá)可修復(fù)DNA 復(fù)制過程中錯(cuò)配的堿基對，從而防止基因突變的發(fā)生， 以達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生目的。國內(nèi)外研究均指出多種類型、不同發(fā)病部位的腫瘤的發(fā)病均與錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)異常相關(guān)[5-6]。 隨著分子檢測技術(shù)的精進(jìn)， 實(shí)驗(yàn)室對惡性腫瘤的病理診斷準(zhǔn)確性不斷提高。該研究隨機(jī)抽出該院2019 年12 月—2021 年5 月61 例結(jié)直腸癌（CRC）病例作研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)抽出61 例結(jié)直腸癌（CRC）病例作研究，61例CRC 患者均接受手術(shù)根治性切除且完成組織病理活檢。 其中男29 例，女32 例；年齡41~93 歲，60 歲 及 以 下 者38 例，60 歲 以 上 者23 例， 平 均（61.74±12.57）歲；腫瘤最大徑2~7 cm，平均（4.69±1.25）cm；左半結(jié)腸23 例、右半結(jié)腸30 例、直腸8例；TNM 分期：Ⅰ期10 例、Ⅱ期15 例、Ⅲ期20 例、Ⅳ期16 例。 患者均為自愿參與該研究，簽署相關(guān)知情同意書； 研究經(jīng)該院醫(yī)學(xué)倫理協(xié)會審核修訂后批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)： ①全部調(diào)研對象均經(jīng)病理組織活檢診斷為CRC；②均為初診患者，未接受手術(shù)療法之外的其他治療； ③可按標(biāo)準(zhǔn)完成整個(gè)研究。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性CRC；②非初診患者；③非手術(shù)治療者；④結(jié)直腸良性腫瘤等患者。

1.3 方法

免疫組化檢測：手術(shù)中切下病灶標(biāo)本，將組織標(biāo)本放入中性液體中進(jìn)行固定，常規(guī)脫除標(biāo)本水分，進(jìn)行石蠟包埋。 標(biāo)本切片至4 μm，下一步按照EnVision 說明書分兩步進(jìn)行HE 染色和免疫組化染色，最后一步完成檢測。 抗體試劑分別為MLH1 和MSH6 鼠抗人單克隆抗體，MSH2 和PMS2 兔抗人單克隆抗體，均購于中國生物技術(shù)股份有限公司。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察腫瘤細(xì)胞核著色情況：無論著色深淺、著色范圍，明確著色即為（+）。 無著色評定為（-），4 種蛋白其中任一發(fā)生缺失則為不穩(wěn)定； 而4 種蛋白均未缺失，正常表達(dá)即為穩(wěn)定。P53 蛋白著色為（+），結(jié)果為（+）患者均觀察10 個(gè)×400 視野，計(jì)算陽性比，陽性比在30%及以上則為表達(dá)（+），反之則為（-）。 所有結(jié)果的判定均由3 位工作年資10 年以上的病理科醫(yī)師盲法獨(dú)立完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)， 計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；完成Spearman 相關(guān)性分析。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 錯(cuò)配修復(fù)蛋白及P53 蛋白表達(dá)結(jié)果

4 種蛋白均在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，61 例CRC 患者表達(dá)缺失占比約18.03%（11 例）；MLH1 表達(dá)缺失7 例（11.48%）、MSH2 表達(dá)缺失4 例（6.56%）、PMS2 表達(dá)缺失7 例（11.48%）、MSH6 表達(dá)缺失3 例（4.92%）；MLH1、PMS2 共同表達(dá)缺失5 例（8.20%），MSH2、MSH6 共同表達(dá)缺失2 例（3.28%）。 P53 蛋白表達(dá)陽性率29 例（47.54%）。

2.2 錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)與CRC 關(guān)系

錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)與組織分型、TNM 分期有關(guān)（P＜0.05）。與其他臨床病理因素?zé)o關(guān)（P＞0.05）。見表1。

2.3 P53 蛋白表達(dá)與CRC 關(guān)系

P53 蛋白陽性表達(dá)與組織分型、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。與其他臨床病理因素?zé)o關(guān)（P＞0.05）。 見表2。

表2 P53 蛋白表達(dá)與CRC 關(guān)系[n（%）]

2.4 微衛(wèi)星不穩(wěn)定與P53 蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

將研究設(shè)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)錄入系統(tǒng)，經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析得，P53 蛋白表達(dá)陽性與微衛(wèi)星不穩(wěn)定呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān)（r=-0.136，P＜0.05）。

3 討論

CRC 的發(fā)病最典型的臨床癥狀就是無癥狀，腸道惡性腫瘤的發(fā)病癥狀多與息肉、痔瘡等疾病類似，極易被忽略；CRC 患者病情進(jìn)展至晚期均無典型臨床癥狀，確診患者多預(yù)后不良，且病死率高。目前，胃腸鏡作為體檢項(xiàng)目的開展， 能讓部分患者在發(fā)病早期確診，可接受手術(shù)、放化療等治療，但病情進(jìn)展快，預(yù)后不理想，對治療不利。 以往的研究指出，CRC 發(fā)病主要是因上皮細(xì)胞發(fā)生瘤變，再癌變[7]。 但深入的基因研究發(fā)現(xiàn)，DNA 錯(cuò)配修復(fù)缺陷以及引起的微衛(wèi)星不穩(wěn)定通路是重要通路[8]。 正常機(jī)體內(nèi)，DNA 錯(cuò)配修復(fù)是維持基因穩(wěn)定、正常遺傳信息的重要保障，錯(cuò)配修復(fù)蛋白能在DNA 復(fù)制時(shí)識別錯(cuò)配的堿基對，并加以修復(fù)，確?；蚩煞€(wěn)定遺傳。若在這個(gè)過程中因錯(cuò)配基因突變型失活或修復(fù)基因甲基化失活， 造成微衛(wèi)星不穩(wěn)定，就會引起相關(guān)蛋白異常表達(dá)；若該過程中某些抑癌基因和癌基因表達(dá)異常， 即會引起腫瘤的發(fā)生[9-10]。

錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)缺失是CRC 患者微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)最直觀的反饋，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 為4 種主要蛋白， 錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)異常會直接導(dǎo)致一種或多種蛋白異常表達(dá)， 因此通過檢測錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)缺失情況， 即可監(jiān)測CRC 疾病狀態(tài)。 通過免疫組化檢測錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)缺失情況可以預(yù)測CRC 微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)。錯(cuò)配修復(fù)過程中MLH1、MSH2 兩種蛋白通過結(jié)合同源蛋白生成二聚體調(diào)控錯(cuò)配修復(fù)作用， 而PMS2 是MLH1 的配對蛋白，MSH6 是MSH2 的配對蛋白， 主導(dǎo)蛋白MLH1和MSH6 突變后會引起對應(yīng)二聚體降解， 引起主蛋白與配對蛋白共同缺失的發(fā)生。 因此，PMS2 蛋白會隨著MLH1 蛋白的缺失而缺失，MSH6 蛋白亦會隨著MSH2 蛋白的缺失而缺失， 多表現(xiàn)為2 種蛋白共同缺失。 該研究結(jié)果顯示：61 例CRC 患者錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失約占18.03%，單種蛋白表達(dá)缺失占比最低為4.92%，最高11.48%，MLH1、PMS2 共同表達(dá)缺失為8.20%明顯高于MSH2、MSH6 共同表達(dá)缺失3.28%，MSH2、MSH6 表現(xiàn)為共同缺失， 且兩種蛋白共同缺失也符合上述內(nèi)容。 該研究結(jié)果顯示，P53 蛋白表達(dá)陽性率47.54%，其中4 種錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失與組織分型、TNM 分期相關(guān)，P53 蛋白陽性表達(dá)與組織分型、TNM 分期、 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；P53 蛋白表達(dá)陽性與微衛(wèi)星不穩(wěn)定呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān)。 有研究指出，結(jié)直腸癌患者P53 蛋白表達(dá)陽性率為44.9%，其表達(dá)與MSI 表現(xiàn)為負(fù)性相關(guān) （r=-0.169，P＜0.05）[11]，該研究結(jié)果與其具有一致性， 提示微衛(wèi)星不穩(wěn)定與P53 蛋白突變可能CRC 發(fā)病的兩種不同機(jī)制，分別在疾病不同階段發(fā)揮作用。 P53 蛋白構(gòu)成重要的抑癌基因，參與DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生命周期阻滯等過程[12]。 腫瘤病情的進(jìn)展與P53 蛋白突變關(guān)系密切， 約50%的惡性腫瘤患者均存在P53 突變[13-14]。 有研究指出，CRC 患者P53 蛋白突變耐藥性更高，說明P53 蛋白突變與預(yù)后不良關(guān)系密切[15-16]。但P53 蛋白有不同類型，野生型和突變型蛋白缺失誘發(fā)的癌變機(jī)制也不同，野生型P53 蛋白缺失與侵襲程度相關(guān)，突變型P53 蛋白則具有功能獲得活性[17-18]。不同類型CRC 在發(fā)病機(jī)制和通路上存在差異，因此P53 蛋白的研究有利于明確CRC 發(fā)病機(jī)制，對臨床診斷、靶向治療、預(yù)后監(jiān)測等有里程碑意義。

微衛(wèi)星穩(wěn)定性的檢測可預(yù)測CRC 的預(yù)后，可作為預(yù)后標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，早期CRC 患者術(shù)后輔助治療方案可借鑒檢測結(jié)果。4 中錯(cuò)配修復(fù)蛋白與P53蛋白的表達(dá)均與TNM 分期相關(guān)，因此微衛(wèi)星穩(wěn)定性的檢測對TNM 分期患者預(yù)后有一定的預(yù)測價(jià)值，但該研究尚無法闡明微衛(wèi)星狀態(tài)預(yù)測預(yù)后的相關(guān)機(jī)制，可能與腫瘤細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的活性反應(yīng)強(qiáng)烈，突變后引起一系列免疫反應(yīng)相關(guān)。

綜上所述，CRC 的臨床診斷和治療中， 建議進(jìn)行微衛(wèi)星穩(wěn)定性相關(guān)的錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)檢測，以指導(dǎo)患者的診療方案的制訂， 同時(shí)還可應(yīng)用于預(yù)后的監(jiān)測。