miR-128在種植體周圍炎中對破骨細胞增殖及分化作用的研究

吳 慧，符起亞， 張旭鳳 ，董 明，羅 文

(1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 口腔科，海南 海口 570102；2.大連醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院，遼寧 大連 116044)

口腔種植已經(jīng)被廣泛應用于牙齒缺失的修復治療中，成功的骨整合和種植體在口腔中的長期穩(wěn)定性對于種植修復的成功是十分重要的[1]。但是，種植體周圍炎是一種造成種植體修復失敗的常見疾病，進而造成了種植體的脫落[2]。Tsarev等[3]指出種植體周圍骨穩(wěn)態(tài)取決于牙槽骨與種植體的骨結(jié)合。宿主細胞防御細菌攻擊是造成種植體周圍組織損傷的主要原因。淋巴細胞、巨噬細胞以及中性粒細胞被免疫系統(tǒng)募集和激活，并誘導局部炎癥反應在骨組織中產(chǎn)生細胞因子和趨化因子[4]?？寡准毎蜃雍挖吇蜃邮欠N植體周圍炎發(fā)病過程中炎癥和免疫的重要介質(zhì)[5]。因此，必須深入探索種植體周圍炎的潛在分子機制，優(yōu)化骨再生療法。

MicroRNA(miRNA)包括一類小的非編碼，屬于內(nèi)源性RNA分子。它們長約22個核苷酸。miRNA可以抑制靶向基因的轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)控靶基因的表達[6]。研究表明，miR-214可以調(diào)節(jié)成骨細胞分化和骨形成。miR-182可能通過抑制破骨細胞分化，進而改善骨質(zhì)疏松癥發(fā)生[7]。miR-21和miR-133可以促進小鼠骨骼成肌細胞增殖[8]。上述研究均表明miRNA在骨平衡代謝中扮演了重要的角色[9]。miRNAs介導成骨細胞以及破骨細胞的增殖、衰老和分化，使miRNAs成為骨病的新治療靶點[10]。

miR-128在細胞的增殖、分化及凋亡中起到了重要的作用，早期研究表明miR-128主要位于大腦中，在癲癇病、抑郁癥和阿爾茨海默氏病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起到了重要的作用[11]。另外miR-128與肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌和甲狀腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[12]。最近的研究報道指出miR-128參與了骨代謝疾病，包括質(zhì)疏松癥，類風濕病關節(jié)炎和骨關節(jié)炎的發(fā)生[13]。但是關于miR-128在種植體周圍炎中的作用尚無報道指出。本課題組在之前的實驗中,對種植體周圍炎臨床樣本進行miRNA測序，發(fā)現(xiàn)miR-128表達差異明顯，本實驗通過檢測miR-128在種植體周圍炎組織中的表達情況，通過加入miR-128 inhibitor(抑制物)及mimics(模擬物)，檢測miR-128對于成骨細胞的增殖及分化的影響，在分子水平為種植體周圍炎的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 RAW264.7細胞(中科院上海細胞庫)；RANKL(sigma公司)Lipofectamine RNAi MAX Reagent (13778-075,Invitrogen)；miR-128 inhibitor(抑制物)及mimics(模擬物)(AM11746,Ambion)；DMEM培養(yǎng)基(HyClone);TransStart? Tip Green qPCR SuperMix(TransGen Biotech)；TRAP染色(sigma公司)；CCK8(日本同仁化學)

1.2 方法

1.2.1 臨床樣本收集 收集2018年7月至2019年11月期間于海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院口腔科就診的種植體周圍炎患者(10例種植體周圍炎組織)和正畸拔牙患者(10例健康牙齦組織)組織，所有患者均簽署知情同意書。項目實施得到海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(倫：2018002)。

納入和排除標準：本次課題選取種植體周圍炎患者均為微生物引起的種植體周圍炎，排除因器械等原因引起的種植體周圍炎，按照歐洲牙周病聯(lián)合會與美國牙周病學會定義的《種植體周圍炎診斷標準》[14]進行病例篩選，具體納入標準如表1所示。排除標準：非生物并發(fā)癥引起的種植體周圍炎。

表1 種植體周圍炎納入標準

1.2.2 Real-time PCR 采用離心柱法提取樣本總RNA，研磨棒研磨至勻漿狀，室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，加200 μL氯仿EP 管中，劇烈震蕩30 s，放置3 min，吸取200 μL上層水相至另一EP 管，加入100 μL無水乙醇，混勻，離心2 min，10 000 r/min 離心30 s。按照SYBR ? Premix ExTaqMⅡ配制Real-Time PCR反應液，加入樣本cDNA，按照95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s進行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法來計算目的基因表達相對量。miR-128-3p(F1:GGTCACAGTGAACCGGTC,F2:GTGCAGGGTCCGAGGT); U6(F1:CTCGCTTCGGCAGCACATATACT,F2:ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC)；TRAP (F1:AGCGCCTTCGGTCCAGTTGC,F2:TGCCAGTGCCTCTTTGCTGCT))；GAPDH (F1:GATTCCACCCATGGCAAATTCC,F2:CACGTTGGCAGTGGGGAC)。

1.2.3 RAW264.7細胞誘導為破骨細胞及破骨細胞鑒定 復蘇RAW264.7細胞后，采用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。加入100 ng RNAKL。誘導細胞5 d后，進行鑒定。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染 參考Lipofectamine RNAi MAX Reagent，取對數(shù)期破骨細胞(1×104/mL)，待細胞貼壁后，加入轉(zhuǎn)染試劑和40 nM miR-128 inhibitor及mimics。轉(zhuǎn)染試劑按配制兩個EP管，分別為Tube 1(RNA)及Tube 2 (Transfection Polymer)。其中Tube 1包括5 μL siRNA和95 μL Xfect 反應緩沖液，Tube 2包括10 μL Xfect siRNA Polymer和90 μL Xfect 反應緩沖液。漩渦混勻各管混合物，速度漩渦10 s，室溫孵育10 min，將200 μL復合物逐滴加入細胞培養(yǎng)基中，8 h后換液，48 h后Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染效率；

1.2.5 CCK8細胞增殖實驗 將轉(zhuǎn)染miR-128 inhibitor及mimics的破骨細胞(3 000個/孔)及對照組加入10 μL CCK8試劑，待24、48 h后采用酶標儀檢測細胞增殖情況。按照CCK8說明書進行操作，酶標儀測定450 nm的吸光光度值。

1.2.6 Western blot 細胞蛋白質(zhì)提取，靜置1 h；配制反應液。將轉(zhuǎn)染miR-128 inhibitor及mimics的破骨細胞加入蛋白裂解液，靜置后4℃ 6 000 r/min 15 min。采用BCA法蛋白質(zhì)定量，計算蛋白濃度。在樣品中加入1/5體積的5X蛋白上樣緩沖液，混勻后95 ℃煮8 min，按20 μg每孔加入樣品，通電后進行電泳，轉(zhuǎn)膜后加入一抗TRAP(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育1 h，采用HRP-ECL發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況分析 種植體周圍炎組與對照組在年齡及性別無統(tǒng)計學差異，說明本實驗納入病例范圍沒有差異，如表2所示。

表2 患者情況分析

2.2 miR-128及TRAP在種植體周圍炎樣本中的表達 Real-time PCR檢測結(jié)果顯示， miR-128以及TRAP在種植體周圍炎患者炎性組織中表達均高于對照組(P<0.05)，如圖1所示。相關性分析結(jié)果顯示，miR-128與TRAP在種植體周圍炎患者炎性組織中存在中度相關性(r=0.527，P<0.05)，提示miR-128與骨破壞標志因子TRAP有一定的相關性,如圖2所示。

*：與對照組比較，P <0.05。 圖1 miR-128及TRAP在種植體周圍炎患者組織和對照組組織中的表達

圖2 miR-128及TRAP在種植體周圍炎組織中的相關性分析

2.3 誘導RAW264.7細胞為破骨細胞鑒定 形態(tài)學鑒定TRAP結(jié)果顯示，相對于未誘導的RAW264.7細胞的細胞形態(tài)由圓形或類圓形變?yōu)槎嗪思毎?，且細胞核?，結(jié)果如圖3A所示。Real-time PCR結(jié)果顯示，與未誘導(0 d)相比，誘導5 d后，TRAP的基因表達相對量高于對照組(P<0.05)，結(jié)果如圖3B所示,上述實驗表明破骨細胞誘導成功。

A:TRAP染色結(jié)果顯示破骨細胞誘導成功(×200)；B:Real-time PCR檢測誘導細胞5 d后，TRAP基因表達結(jié)果；* ：P <0.05。 圖3 誘導RAW264.7細胞為破骨細胞鑒定

2.4 miR-128inhibitor及miR-128mimics轉(zhuǎn)染破骨細胞的轉(zhuǎn)染效率 Real-time PCR 檢測轉(zhuǎn)染效率結(jié)果顯示，miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染破骨細胞后，miR-128的表達相對量低于Mock組及inhibitor NC組(P<0.05)，Mock組及inhibitor NC組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，如圖4A所示。miR-128 mimics轉(zhuǎn)染破骨細胞后，miR-128的表達相對量高于Mock組及Negative control組，(P<0.05)，Mock組及Negative control組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，如圖4B所示。

A： miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染破骨細胞的轉(zhuǎn)染效率；B： miR-128 mimics轉(zhuǎn)染破骨細胞的轉(zhuǎn)染效率；*： P <0.05。圖4 miR-128 inhibitor及miR-128 mimics轉(zhuǎn)染破骨細胞的轉(zhuǎn)染效率

2.5 miR-128 促進破骨細胞的增殖能力 CCK8結(jié)果顯示，miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染破骨細胞24、48、72 h后，破骨細胞增殖能力隨時間推移而降低，miR-128 inhibitor組細胞增殖能力低于Mock組及inhibitor NC組，Mock組及Inhibitor NC組之間破骨細胞的增殖能力在72 h之內(nèi)無顯著變化(P>0.05)，結(jié)果如圖5A所示。miR-128 mimics轉(zhuǎn)染破骨細胞24、48、72 h后，破骨細胞增殖能力隨時間推移而升高，miR-128 mimics組細胞增殖能力高于Mock組及Negative control組(P<0.05)，Mock組及Negative control組之間破骨細胞的增殖能力在72 h之內(nèi)無顯著變化(P>0.05)，結(jié)果如圖5B所示。

A:CCK8結(jié)果顯示miR-128 inhibitor抑制破骨細胞增殖；B:miR-128 mimics促進破骨細胞增殖；*：與miR-128 inhibitor組比較，P <0.05；與miR-128 mimics組比較，P <0.05。圖5 miR-128促進破骨細胞的增殖能力

2.6 miR-128 促進破骨細胞的分化能力 miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染破骨細胞后，miR-128 inhibitor組TRAP的基因表達低于Mock組及inhibitor NC組(P<0.05)，Mock組及inhibitor NC組之間無顯著變化(P<0.05)。miR-128 mimics組TRAP的基因表達高于Mock組及Negative control組(P<0.05)，Mock組及Negative control組之間無顯著變化，結(jié)果如圖6A所示。miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染破骨細胞后，miR-128 inhibitor組的TRAP的蛋白相對于Mock組及inhibitor NC組表達降低，結(jié)果有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。miR-128 mimics轉(zhuǎn)染破骨細胞后，miR-128 mimics組的TRAP的蛋白相對于Mock組及Negative control組表達增高，結(jié)果有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，結(jié)果如6B、C所示。

A：Realtime PCR檢測miR-128 inhibitor及miR-128 mimics后TRAP的基因表達情況；B和C：Western blot檢測miR-128 inhibitor及miR-128 mimics后TRAP的蛋白表達情況；*：與miR-128 inhibitor組比較，P<0.05；與miR-128 mimics組比較，P<0.05。圖6 miR-128 inhibitor及miR-128 mimics后各組破骨細胞TRAP基因及蛋白的表達

3 討論

種植體周圍炎是種植體修復失敗的主要原因之一。研究表明，28%～56%的患者和12%～40%的部位在種植術后會發(fā)展成種植體周圍炎[15-16]。種植體周圍炎的發(fā)生率隨著時間的推移逐漸增加。在種植體周圍炎的早期，巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞被募集到植體周圍并被激活，這些細胞分泌促炎因子和趨化因子[2]。在種植體周圍炎的中晚期，破骨細胞被激活。局部出現(xiàn)炎癥微環(huán)境，導致種植體牙槽骨出現(xiàn)吸收并導致種植體的修復失敗[17]。最近的研究表明，一些miRNA可以通過多種信號通路參與種植體周圍炎的炎癥調(diào)節(jié)和骨骼重塑[18]。

本實驗對miR-128在種植體周圍炎炎性樣本中的表達進行檢測，結(jié)果顯示同其他炎性骨破壞疾病一樣，miR-128在種植體周圍炎炎性樣本中表達增高，同時也檢測了骨破壞標志因子TRAP的表達情況，并將miR-128與TRAP的表達進行了相關性分析，發(fā)現(xiàn)miR-128與TRAP的表達有相關性，提示miR-128與種植體周圍炎的骨破壞有關，miR-128也有可能作為預防和治療種植體周圍炎的有效靶點。本實驗中，通過加入miR-128的抑制劑，檢測破骨細胞的增殖情況，結(jié)果表明miR-128可以促進破骨細胞的增殖，同時檢測了TRAP基因及蛋白的表達情況，結(jié)果表明，抑制miR-128可以抑制TRAP的表達，說明miR-128可以促進破骨細胞的分化?？咕剖崴嵝粤姿崦?Tartrate-resistant acid phosphase，TRAP) 是破骨細胞的特異性標志酶。在骨代謝生化指標臨床應用專家共識( 2020)中被認為是骨吸收標志物[19]。TRAP是破骨細胞分化的重要指標，研究表明TRAP表達越多，破骨細胞分化能力越強[20]。本實驗將miR-128 inhibitor及miR-128 mimics轉(zhuǎn)染破骨后，以TRAP作為檢測破骨細胞分化的指標。

miR-128參與巨噬細胞引起的炎癥和氧化應激作用進而促進破骨細胞的分化，在小鼠類風濕性關節(jié)炎模型中，miR-128的抑制顯著抑制了通過抑制NF-κB的活性[21]。此外，在大鼠骨關節(jié)炎模型中，miR-128通過破壞Atg12導致自噬和加劇膝關節(jié)骨關節(jié)炎[22]。此外，學者發(fā)現(xiàn)miR-128在骨關節(jié)炎中顯著上調(diào)[23]?？傮w而言，miR-128可能在促進關節(jié)炎。抑制miR-128可能是一種有效的方法預防和治療小鼠類風濕性關節(jié)炎和骨關節(jié)炎的發(fā)生[23]。而種植體周圍炎也是一種細菌引起的骨組織破壞疾病，研究表明miR-128在炎癥誘導的破骨細胞分化中起到了重要的作用。最近的報道指出miR-128的過表達加劇TNF-α誘導的骨髓基質(zhì)細胞的表達，也有報道指出miR-128通過靶向SIRT1 / NF -κB信號傳導途徑促進小鼠破骨細胞分化，也有報道指出抑制miR-128對骨質(zhì)流式有保護作用。這部分結(jié)果與我們的實驗結(jié)果一致。

通過上述的結(jié)果證明了miR-128在種植體周圍炎中起到了促進破骨細胞增殖與分化的作用，但是它具體通過何種機制，是以后需要進行研究的問題。