丹參酮ⅡA干預(yù)間充質(zhì)干細胞對LPS誘導(dǎo)N9小膠質(zhì)細胞激活的抑制作用

黃南渠，屠 琳，王啟兵，吳競婧，羅 勇，馮 飛

(遵義市第一人民醫(yī)院，遵義醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，1.藥物臨床試驗機構(gòu)辦公室；2.法醫(yī)司法鑒定所；3.神經(jīng)內(nèi)科；貴州 遵義 563000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征是進行性認知功能障礙和行為障礙[1]。積極探索AD的發(fā)病機制和治療方法具有極其重要的價值和意義。近年來，大量研究表明間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSC)在治療AD方面具有巨大潛力。MSC治療AD的可能機制有很多，主要與MSC對神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)有關(guān)：炎癥較弱時，MSC促進免疫反應(yīng)；當炎癥過強時，MSC會抑制免疫反應(yīng)，并且MSC具有向受傷組織遷移的能力[2]。正是基于這些作用，MSC在抗AD神經(jīng)炎癥方面具有良好的應(yīng)用前景。我們課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)MSC能有效提高AD模型大鼠的學習記憶能力，顯著減少神經(jīng)元凋亡，減少神經(jīng)炎癥相關(guān)細胞因子白細胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素6(Interleukin-6,IL-6)IL-6、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達[3]。然而，MSC的應(yīng)用仍然面臨著問題和挑戰(zhàn)。

MSC在體外擴增后容易老化，其分化為特定成熟細胞和調(diào)節(jié)炎癥的能力會根據(jù)環(huán)境而減弱[4-5]。為了解決這個問題，我們課題組最初采用從中藥丹參中分離的生物活性成分丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,TⅡA)進行MSC移植前干預(yù)。我們發(fā)現(xiàn)TⅡA可以增加MSC對神經(jīng)炎癥的抑制，具有更好的神經(jīng)保護作用[3]。但具體機制尚不清楚，相關(guān)研究表明，髓樣細胞觸發(fā)受體-2(Triggering receptors expressed on myeloid cells-2,TREM2)在神經(jīng)炎癥中具有重要的負調(diào)控作用，TREM2修飾的MSC具有更好的神經(jīng)保護作用[6]。因此，我們推測TⅡA-MSC對抗神經(jīng)炎癥的優(yōu)勢也可能是基于TREM2的調(diào)節(jié)，使用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)和TREM2 siRNA來進一步探索TⅡA-MSC對神經(jīng)炎癥優(yōu)越性的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 N9細胞購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。TⅡA(HPLC>99.37%)從MedChemExpress購買。LPS(L4391,Sigma)、RPMI 1640(61870036,Gibco)、間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基(Mubmx-03011-440,cyagen)、DMEM(10566016,Gibco)、胰蛋白酶-EDTA(T1300,PBS1GB5000)、FBS(E600001-0500、BBI Life Sciences)、青霉素-鏈霉素液體(P1400、Solarbio)、OPTI-MEM?(31985-062、Gibco)、LipofectamineTM3000(L3000015、Invitrogen RNATM干擾載體)、TREM2和陰性對照siRNA載體(Generalbiol)、CD45 Percp (103129,Biolegend)、CD29 PE(102207,Biolegend)、NovoCyteTM流式細胞儀(NovoCyte 2060R,ACEA BIO)、自動酶標儀(WD-2102B，北京六一生物科技有限公司)、RIPA(C1053,Applygen technologies)、BCA蛋白檢測試劑盒(CW0014S，Cwbiotech)、Marker(#26617，Thermo scientific)、脫脂奶粉(P1622,Applygen technologies)、Mouse monoclonal anti-GAPDH(1/2000,TA-08,Zsbio)、Rabbit anti TREM2 (1/1000,DF12529,Affinity)、Rabbit anti IL-1β(1/1000,bs-0812R,Bioss)、兔抗TNF-α(1/500,AF7014,Affinity)、山羊抗小鼠IgG H&L(1/2000,ZB-2305,Zsbio)、山羊抗兔 IgG H&L(1/2000,ZB-2301,Zsbio)。

1.2 方法

1.2.1 MSC的制備與鑒定 C57BL/6小鼠購自中國江西ZHBYBiotech [等級：無特定病原體，SCXK 2019-0004]，并在22～23 °C下飼養(yǎng)，12 h光/暗循環(huán)。頸椎脫臼處死小鼠，用75%乙醇浸泡5 min。在無菌條件下取出小鼠的脛骨和肱骨。解剖骨膜和肌肉組織，用含1%青霉素-鏈霉素的DPBS反復(fù)沖洗脛骨和肱骨。接下來，切開髓腔并用DMEM完全培養(yǎng)基徹底清洗。離心(1 200 r/min，5 min，4 °C)后棄去上清液，將沉淀物重新懸浮在DMEM完全培養(yǎng)基中。將骨髓細胞均勻鋪在平板上，在37 °C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本實驗經(jīng)遵義醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會批準[NO:(2019)2-231]。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及給藥 N9細胞在含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當細胞達到80%～90%匯合時進行傳代培養(yǎng)。我們按照細胞數(shù)量1∶1在帶有Transwell過濾器的間接共培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)N9細胞和MSC。在本研究中，MSC接種到上室，N9細胞接種到下室。實驗分為對照組、LPS(1 μg/mL)組、LPS+MSC(1 μg/mL LPS + MSC)組、LPS+TⅡA-MSC(1 μg/mL LPS + TⅡA-MSC)組、LPS+TⅡA-MSC+TREM2 siRNA(1 μg/mL LPS + TⅡA-MSC + TREM2 siRNA)組。使用1 μg/mL LPS干擾N9細胞24 h誘導(dǎo)炎癥。使用10 μM TⅡA干擾MSC 48 h制備TⅡA-MSC(本研究使用TⅡA修飾的MSC，而不是TⅡA和MSC的混合物，因此TⅡA處理后TⅡA被丟棄，見圖1)。并且MSC的TREM2基因(siRNA處理48 h后丟棄siRNA)被TREM2 siRNA沉默。

圖1 TⅡA干預(yù)后MSC(TⅡA-MSC)的簡要制備過程

1.2.3 Western blot N9細胞與裂解緩沖液在4°C下孵育30 min，通過在4°C下以12 000 r/min離心10 min去除不溶性物質(zhì)。小心吸取上清液以獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。各樣品取等量十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)分離2 h，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜80 min。將印跡用TBST中的脫脂牛奶溶液在室溫下封閉1 h。印跡用TBST洗滌3次，并與一抗在4°C下孵育過夜。印跡用TBST洗滌3次，每次5分鐘，然后與相應(yīng)的二抗溶液在室溫下孵育2 h。然后，PVDF膜用TBST洗滌3次，并使用ECL曝光溶液進行觀察。用Quantity One軟件4.6.1版軟件分析各抗體條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的改變 TⅡA-MSC與MSC相比，TⅡA-MSC的Exo含量顯著比MSC高(P=0.038)，且TⅡA-MSC的Exo粒徑更大(見圖2)。

2.2 IL-1β,IL-6和TNF-α的變化 結(jié)果如圖3所示。與對照組相比，LPS顯著增加了N9細胞IL-1β(P=0.001)、IL-6(P=0.014)和TNF-α(P=0.001)的蛋白表達水平，表明LPS確實刺激了N9細胞的炎癥反應(yīng)；與LPS組相比，LPS+MSC組IL-6(P=0.014)和TNF-α(P=0.044)表達下調(diào)；LPS+TⅡA-MSC組IL-1β(P=0.002)、IL-6(P<0.001)和TNF-α(P=0.003)表達下調(diào)，而TⅡA-MSC對炎癥因子的下調(diào)作用更顯著。與LPS+MSC組相比，LPS+TⅡA-MSC組IL-6顯著降低(P<0.001)。而使用TREM2 siRNA沉默MSC的TREM2基因后，TⅡA-MSC降低N9細胞炎癥因子的能力減弱，與LPS+TⅡA-MSC組相比，TREM2 siRNA可顯著減弱IL-6(P=0.005)和TNF-α(P=0.033)的降低，但這種作用在IL-1β(P=0.884)表達的調(diào)節(jié)上無顯著差異。

A: Exo電鏡代表性圖片(1 μm)；B: Exo粒徑分布。圖2 TⅡA-MSC與MSC分泌的Exo比較

A: 代表性條帶；B: IL-6；C: IL-1β；D: TNF-α；a：與對照組相比，P <0.05；b：與LPS組相比，P <0.05；c：與LPS+MSC組相比,P<0.05；d：與LPS+TⅡA-MSC組相比，P 圖3 主要炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白的表達

3 討論

中醫(yī)藥是中華民族數(shù)千年積累的智慧結(jié)晶。隨著對中醫(yī)藥研究的不斷深入，許多潛在的療效與功能被進一步挖掘。研究發(fā)現(xiàn)，部分中藥能夠促進MSC增殖和分化，在治療中產(chǎn)生中西結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)[7]。丹參(Salvia miltiorrhiza Bge)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，味苦、性微寒，歸心、肝二經(jīng)。具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰、清心除煩等功效；現(xiàn)代研究表明丹參及其有效成分具有廣泛的生物活性和藥理作用[8]。自20世紀80年代初丹參被引入貴州后被大面積推廣種植，2015年納入《貴州省中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃(2016-2030年)》?，F(xiàn)貴州省丹參年產(chǎn)量超2000噸，已成為全國丹參的主要產(chǎn)區(qū)之一[9]。

TⅡA是丹參主要的特征性和活性成分。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TⅡA預(yù)處理可改善氧糖剝奪(Oxygen glucose deprivation,OGD)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷[10]，OGD類似于MSC體外擴增和移植過程中的環(huán)境改變刺激。因此，結(jié)合丹參活血生血，精血互生的中醫(yī)藥理論，課題組選擇TⅡA預(yù)處理MSC，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后的MSC具有更強的神經(jīng)炎癥抑制作用[3](已獲得發(fā)明專利：CN201810094528.8)。因此研究TⅡA預(yù)處理MSC后更好抗炎作用的原因是一個值得探討的科學問題。

MSC起作用的方式主要通過直接的介導(dǎo)作用和間接的釋放可溶性因子[11]，而這些可溶性因子被兩種不同直徑的囊泡結(jié)構(gòu)所包裹，其中具有更小直徑的外泌體(Exosome,Exo)是一種直徑約為30～120 nm的膜囊泡，含有來自其親代細胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和miRNA[12]。研究表明，Exo在促進細胞表型轉(zhuǎn)化中具有重要作用，Exo引導(dǎo)的細胞重編程技術(shù)能將M1表型巨噬細胞直接轉(zhuǎn)化為M2表型巨噬細胞以進行有效的表型轉(zhuǎn)化控制，從而調(diào)節(jié)促炎癥與抗炎癥之間的平衡，發(fā)揮保護作用[13]。源自MSC的外泌體(MSC-Exo)在各種自身免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[14]，并且可以減輕組織損傷并促進組織修復(fù)[15]，這與其調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞(Microglia,MG)表型轉(zhuǎn)化，使抗炎作用的M2型MG增加，減少促炎作用的M1型MG有關(guān)[16-17]。并且MSC-Exo中攜帶的miRNA(miR-223等)，可調(diào)控MG表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵蛋白TREM2從而發(fā)揮抗AD作用[18-19]。因此，根據(jù)相關(guān)研究和本實驗發(fā)現(xiàn)的Exo結(jié)果表明，這種Exo的差別是TⅡA-MSC與MSC存在的重要區(qū)別之一。

而TREM2是高表達于MG上的一類免疫球蛋白樣受體，不僅在炎癥過程中發(fā)揮“負性調(diào)節(jié)”作用[6]，還在調(diào)控MG表型M1向M2轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。TREM2過表達可通過降低iNOS及促炎細胞因子從而顯著抑制M1，同時還通過增加精氨酸酶1(Arginase-1，Arg-1)和抗炎細胞因子的表達水平來增強M2極化[20]。上調(diào)TREM2的表達后，凋亡的神經(jīng)元數(shù)目減少，部分抑炎因子表達升高；而下調(diào)TREM2表達后，凋亡的神經(jīng)元數(shù)目增多，促炎因子表達升高[21]。因此，MSC-Exo調(diào)控的TREM2信號通路在介導(dǎo)MG表型由M1向M2轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究發(fā)現(xiàn)TⅡA干預(yù)后的MSC(TⅡA-MSC)的Exo含量高于MSC，TREM2 siRNA可減弱TⅡA-MSC對神經(jīng)炎癥的抑制作用。表明TⅡA干預(yù)后效果更佳的初步機制與促進Exo分泌，調(diào)控TREM2有關(guān)，但具體機制仍有不明確的地方。因此課題組將進一步探索TⅡA-MSC抗AD神經(jīng)炎癥的優(yōu)效性原因及作用機制。這將為TⅡA應(yīng)用于MSC的前處理提供實驗依據(jù)，也為應(yīng)用中西醫(yī)結(jié)合技術(shù)開發(fā)MSC治療AD提供新思路。