基因編輯技術在昆蟲中的研究與應用

邱雨浩, 賈 豫, 倪建泉, 王 冰, 王桂榮

(1. 中國農業(yè)科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193;2. 清華大學醫(yī)學院, 基因表達與調控實驗室, 北京 100084)

隨著測序技術的發(fā)展，多種常見昆蟲的基因組均得到完整的測序與詳細注釋，提供深入了解昆蟲的途徑，而基因編輯技術的發(fā)展和應用則為人類提供改造和利用這些昆蟲的能力?；蚓庉嫾夹g包括誘導突變技術(Muller, 1927; Auerbach and Robson, 1946)，轉座子介導的基因編輯技術(Rubin and Spradling, 1982)，鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)技術(Kimetal., 1996)，類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技術(Lietal., 2011)以及目前炙手可熱的成簇規(guī)律間隔短回文重復序列及其關聯蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) protein 9, CRISPR/Cas9]技術。本文概述了基因編輯技術的原理及其在昆蟲中的發(fā)展和應用，以期對昆蟲基因功能的研究、經濟性昆蟲的改良、害蟲的生物性防治等研究提供借鑒與參考。

1 基因編輯技術的發(fā)展和原理

人們對基因編輯的探索最早可以追溯至20世紀初(Muller, 1927; Auerbach and Robson, 1946)，利用輻射以及化學物質誘導基因突變，但是這一方法只能產生隨機突變，無法進行外源基因的插入以及在特定位點實現特定序列的編輯。早期的基因編輯技術主要是通過轉座子轉出并產生DNA雙鏈斷裂，進而以誘發(fā)DNA同源修復的方式向基因組中插入序列(Rubin and Spradling, 1982)，但是這一方法效率低且實用性不高。除此之外，還有通過轉座子轉入介導的基因插入，例如P轉座子、Hermes轉座子、minos轉座子、hobo轉座子、mariner轉座子和piggyBac(最初也被稱為IFP2) 轉座子。其中piggyBac轉座子應用范圍最廣，適用性最強，其原理是依靠自身編碼的轉座酶，從TTAA位點切出或者轉入，這一過程中允許轉座子攜帶其他基因，也因此被廣泛應用于生物基因編輯(Elicketal., 1996)。但是轉座子插入位點的隨機性較大，并且后續(xù)篩選步驟較為繁瑣。

與同源重組技術相比，特異性的基因編輯技術可以更好地彌補轉座子的不足。第一代ZFN技術應運而生，該技術將來自黃桿菌屬細菌Flavobacteriumokeanokoites中的FokⅠ蛋白核酸切割域與來自真核生物轉錄因子的鋅指DNA識別位點進行融合，使其可以識別不同基因序列，進行DNA切割并產生雙鏈斷裂。其中的Cys2-His2鋅指蛋白域是真核生物中最常見的DNA結合元件，每一個鋅指結構都包含約30個氨基酸，存在于α-螺旋上的部分氨基酸則可以通過DNA的大溝與3個堿基結合，并識別DNA序列(Gajetal., 2013)。借助于一段序列保守的連接蛋白，Gaj等(2013)成功構建了由多個鋅指組成的DNA結合蛋白，最高可以識別并結合18個堿基長度的DNA，但是該技術設計過程復雜，實驗操作成本較高。

隨后發(fā)展出的第二代人工核酸內切酶——TALEN技術對作用位點的特異性結合作用更高，大大降低了錯配率的發(fā)生。該技術原理與ZFN技術相似，只是其DNA識別結構域來自植物致病菌的轉錄因子的DNA識別域。TALE蛋白的DNA結合域由多個3～35個氨基酸的重復序列構成，其特異性取決于兩個非保守的氨基酸(Gajetal., 2013)。與鋅指蛋白相比，TALE蛋白不需要額外插入DNA識別域之間的連接蛋白，因此可以大大簡化蛋白構建流程，但是仍然需要繁瑣的基因合成工作。

第三代基于CRISPR/Cas9技術的基因組編輯系統(tǒng)起初是細菌用來抵御病毒入侵以及切割基因組中的插入病毒序列的防御系統(tǒng)，僅需通過一段100 bp堿基長度的引導RNA (small guide RNA, sgRNA)進行定位引導，其中有20 bp可以特異性識別并結合基因組的靶位點，使Cas9蛋白結合在基因組的特定位置并進行切割，產生核苷酸雙鏈斷裂(double-strand break, DSB) (Jineketal., 2012)。在DNA斷裂位點，細胞可以通過同源介導的修復(homology-directed repair, HDR)或者非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)的方式進行DNA修復。NHEJ是在相關DSB識別蛋白、DNA連接蛋白的作用下，兩段斷裂的DNA被連接到一起，形成完整的DNA鏈。而HDR的方式可以利用同源染色體或者是攜帶同源序列的外源基因序列作為修復模板進行修復(Iliakisetal., 2004)。通過HDR的修復方式，人們也可以在基因組的特定位置插入所需的基因序列，使用NHEJ的方式可能會造成斷裂位置堿基的插入或缺失，從而影響基因功能。2013年，張鋒團隊使用CRISPR/Cas9技術實現了在哺乳動物細胞中的基因編輯(Congetal., 2013)。第三代基因組編輯技術方便快捷且成本低廉，因此迅速被世界各地的實驗室廣泛應用，并衍生出一系列基因編輯工具。目前，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在雙翅目(Gratzetal., 2013; Kistleretal., 2015)、膜翅目(Kohnoetal., 2016)、半翅目(Heuetal., 2020)、鱗翅目(Wangetal., 2013; Bietal., 2016; Changetal., 2017)和直翅目(Lietal., 2016)昆蟲的基因功能研究中均有報道，實現了對基因功能的驗證以及分子機制的解析。

2 基因編輯技術在模式昆蟲果蠅中的研究與應用

為了更方便地對各種昆蟲的基因功能進行研究，研究者將CRISPR/Cas9系統(tǒng)引入到模式昆蟲中，開發(fā)并優(yōu)化該系統(tǒng)的使用方法(表1)。

果蠅作為一種模式生物，研究歷史悠久，具有生長周期短，易于飼養(yǎng)，遺傳操作背景強，研究手段豐富等優(yōu)點。20世紀80年代開展了果蠅體內有關基因編輯的研究。1983年，Engles在果蠅體內發(fā)現P轉座子(Engels, 1983)，隨后這一轉座子被用于果蠅的轉基因編輯，至今仍發(fā)揮重要的研究作用。Bibicova等(2002)通過ZFN技術誘導果蠅染色體斷裂，并在特定位點產生NHEJ修復帶來的突變。Beumer等(2006)使用ZFN技術實現了對特定核苷酸DSB位點的HDR，從而得到攜帶標記DNA序列的果蠅后代。

隨著第三代基因編輯系統(tǒng)的興起，多個研究團隊相繼報道了CRISPR/Cas9基因編輯技術在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster體內的應用。Gratz等(2013)向果蠅胚胎中注射兩個質粒，分別表達Cas9和sgRNA，以期實現特定位點的突變，然而他們發(fā)現該方法獲得的編輯效率不高，只有5.9%的果蠅發(fā)生了NHEJ突變；當他們將兩個sgRNA以及一小段供體單鏈核苷酸一起注射后，會導致兩段sgRNA中間的基因序列被敲除，并且能夠實現外源序列的插入。Ren等(2013)和Sebo等(2014)分別開發(fā)了一種高效的基因編輯系統(tǒng)，通過直接向生殖細胞特異性表達Cas9蛋白的轉基因果蠅胚胎中注射sgRNA表達載體得到突變后代，避免了體細胞突變。Sebo等(2014)通過sgRNA靶向插入的egfp和mcherry熒光蛋白來檢測這套系統(tǒng)的工作效率。而Ren等(2013)以果蠅本身的white基因為靶點，除了檢測基因突變效率，還對sgRNA脫靶效應進行了分析，并開發(fā)了相應的sgRNA設計程序(www.flyrnai.org/crispr)，評估了不同啟動子驅動sgRNA表達對突變效變效率的作用，發(fā)現全身性、全時間表達的Ⅲ型啟動子U6B的效果最好，有接近100%的突變效率。在此基礎上，Ren等(2014a)通過對Cas9蛋白進行改造，得到了只能切割單鏈的Cas9內切酶，在兩條sgRNA的引導下才可以切割出DSB，大大降低了脫靶效應的副作用；之后他們又針對GC含量、注射濃度等多方面因素進行梯度實驗，優(yōu)化出一套成熟的基因編輯方案，并且通過注射多個sgRNA表達載體，可以一次性誘導多個基因同時突變(Renetal., 2014b)。

使用CRISPR/Cas9技術產生突變的果蠅往往需要通過復雜且大規(guī)模的基因組提取與PCR來進行篩選，因此，開發(fā)出更易于篩選的基因編輯技術也十分重要。Kane等(2017)開發(fā)出一套CRISPR共篩選系統(tǒng)，同時注射表達靶向目的基因的gRNA載體和表達靶向ebony基因的gRNA載體， 當ebony基因失效之后，果蠅體色會變成黑色。研究者發(fā)現，在ebony發(fā)生突變的果蠅中，有高達61%的果蠅發(fā)生了靶向基因突變，說明ebony突變與靶向基因突變之間存在較強的相關性。隨后他們對使用HDR的方法產生突變體果蠅進行測試，也發(fā)現在ebony突變的果蠅中，高達18%的果蠅的目的基因發(fā)生了同源修復。

果蠅基因組中許多基因與人類基因同源，通過對果蠅細胞生物學、發(fā)育生物學和神經生物學等多個領域的研究發(fā)現其表型與人類疾病有許多的相似之處。Sun等(2021)通過CRISPR/Cas9技術在果蠅體內誘導了HP1c突變，用以研究HP1c在果蠅腸道中與腫瘤之間的關系。因此，利用基因編輯技術在果蠅體內開展基因功能研究有助于揭示人類疾病作用的神經通路，尋找調控疾病發(fā)生的關鍵作用靶標，為方便快捷地構建人類疾病模型提供一定的借鑒作用。

3 在醫(yī)學媒介蚊蟲中的研究和應用

蚊分布很廣，種類很多，雌性蚊通常以動物血液為食，在吸食血液的過程中作為媒介傳播多種蚊媒病，如瘧疾、登革熱、寨卡病毒感染等疾病。因此開發(fā)針對蚊子的基因編輯技術有利于研究和改造蚊，為防治多種蚊媒疾病提供合適的工具(表1)。

表1 已報道的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在模式昆蟲果蠅和醫(yī)學媒介蚊蟲中的研究與應用Table 1 Research and application of the CRISPR/Cas9 system reported in model insect Drosophilaand medical vector mosquitoes

對埃及伊蚊基因編輯的研究最早可以追溯至20世紀90年代。Coates和Lobo等的兩項工作，均使用轉座子介導黑腹果蠅D.melanogaster的cinnabar基因插入并導致蚊眼睛顏色的變化(Coatesetal., 1998; Loboetal., 2002)。隨后的3項研究分別使用ZFN技術實現在埃及伊蚊體內對氣味受體共受體(odorant receptor co-receptor, orco)、神經肽Y樣受體1(neuropeptide Y-like receptor 1, npylr1)和味覺受體3(gustatory receptor 3, Gr3)基因的突變和功能喪失(DeGennaroetal., 2013; Lieschetal., 2013; McMenimanetal., 2014)。除此之外，Aryan等(2013)使用TALEN技術實現對埃及伊蚊kmo基因的編輯，獲得白眼的后代。這些進展雖然可以提供在蚊子體內進行基因編輯的手段，但仍然存在一定的局限性，難以方便、快捷且精確地進行基因定點編輯。

Kistler等(2015)通過CRISPR/Cas9技術實現對埃及伊蚊基因組的編輯。通過共同注射濃度為40 ng/μL的sgRNA和Cas9 mRNA或Cas9蛋白，得到帶有目的基因突變的埃及伊蚊后代，其中Cas9蛋白組的突變效率比mRNA組的突變效率高出約4倍左右。該團隊同時注射200 nt左右長度的單鏈脫氧核糖核苷酸，試圖獲得通過HDR產生的目的位點的核苷酸插入，但是最終G1代中只有0.65%發(fā)生同源修復，有18.9%通過NHEJ修復途徑發(fā)生堿基插入或缺失，剩下80.45%則為野生型。另外，有研究顯示利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在埃及伊蚊體內實現了基因編輯，并且同時注射Ku70或者lig4基因的dsRNA序列抑制NHEJ的發(fā)生，提高了HDR效率(Basuetal., 2015; Halletal., 2015)。Itokawa等(2016)在致倦庫蚊Culexquinquefasciatus體內注射Cas9蛋白編碼RNA通過基因編輯誘導CYP9M10基因突變，使致倦庫蚊對擬除蟲菊酯的抗性顯著降低。Li等(2017)在埃及伊蚊生殖細胞中構建穩(wěn)定表達Cas9蛋白的品系，降低了構建突變體的工作量，提升了突變的準確性和效率以及HDR的修復效率，極大地方便了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應用。上述研究也表明該系統(tǒng)的突變效率受到基因靶點、蚊品種以及sgRNA結合位點的影響。

2018年Duverney團隊開發(fā)了受體介導的卵巢分子轉運技術(receptor-mediated ovary transduction of cargo, ReMOT)，在Cas9蛋白上連接一段肽鏈(P2C)，可以介導Cas9蛋白從埃及伊蚊的血淋巴轉移到卵巢中，降低了對蚊的注射難度(Chaverra-Rodriguezetal., 2018)；2020年，該團隊再次將這一技術引入斯氏按蚊，擴充這一技術的應用范圍(Maciasetal., 2020)。該技術成功地解決蚊蟲卵小且需要在較短時間內注射的難題，實現在蚊體內對基因的高效編輯。

Burt(2003)最早提出基因驅動(gene drive)的概念，是一種將特定性狀在種群中快速擴散的系統(tǒng)。該技術可以利用B染色體、轉座子或核酸內切酶法等多種途徑將一種特定的外源基因在種群中傳播(Burt and Crisanti, 2018)。隨著基因編輯技術的興起，CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因驅動技術能夠對蚊基因組進行編輯，在控制蚊蟲種群數量和蚊媒疾病傳播等方面具有重要研究價值。Gantz等(2015)和Hammond等(2016)分別報道了最新的研究進展，通過分別向斯氏按蚊體和岡比亞按蚊內引入一段Cas9和sgRNA表達系統(tǒng)，使其在生殖細胞中同時表達Cas9蛋白與sgRNA，通過切割以及同源修復的方式，這一套系統(tǒng)會被復制到另一條同源染色體的相同位置，從而實現在種群中的快速擴增。該技術可以用于調節(jié)蚊種群的發(fā)生以達到多種目的，例如使種群內的性別比例失衡以降低種群繁殖能力，或是增強蚊蟲抗病能力，減少瘧疾傳播風險。Simoni等(2020)利用基因驅動技術，發(fā)現并設計一個名為“性別扭轉基因驅動”(sex-distorter gene drive, SGDG)的雄蟲驅動系統(tǒng)，使岡比亞按蚊種群通過自然繁衍，在約18代后有95%的個體全部轉變?yōu)樾巯x，為蚊蟲的防治提供了新思路。除了SGDG系統(tǒng)以外，Galizi等(2016)通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雄性岡比亞按蚊減數分裂過程中破壞X染色體結構，在不破壞雄蚊繁殖能力的情況下，使雌蚊數量顯著減少，實現對種群性別比例的調控，從而降低雌性按蚊的數量。

4 在農業(yè)害蟲中的研究進展

基因編輯技術同樣可以應用于農業(yè)昆蟲功能基因組的研究(表2)，基因編輯工具的開發(fā)除了能夠加速對靶標基因的研究效率，還能有針對性地解析農業(yè)昆蟲中重要分子靶標的功能，研究農業(yè)害蟲災變機制等，為害蟲防治提供新思路。

Li等(2016)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對飛蝗氣味受體共受體基因Orco開展了基因編輯研究，結果顯示在飛蝗卵內同時注射Cas9的mRNA與gRNA，G0代突變效率高達71.7%；通過對G1代的檢測結果顯示，突變體G0代中有88.1%的個體都產生了可遺傳突變。在此基礎上，Guo等(2020)又利用這一技術體系敲除蝗蟲氣味受體基因OR35，結果顯示OR35-/-突變體降低4-乙烯基苯甲醚對蝗蟲的觸角的電生理反應和行為吸引，明確信息素4-乙烯基苯甲醚對蝗蟲聚集行為的影響，為飛蝗的防治提供新策略。此外，基因編輯技術在鱗翅目昆蟲研究中也取得了相應的進展。Bi等(2016)的研究發(fā)現，向斜紋夜蛾Spodopteralitura胚胎中注射表達Cas9蛋白的mRNA和調控斜紋夜蛾胚胎發(fā)育Slabd-A基因的sgRNA序列，觀察到幼蟲蟲體分節(jié)異常和表皮色素沉積異位的表型，證明Slabd-A基因的確發(fā)生突變，通過進一步探索實驗發(fā)現在一定范圍內sgRNA濃度越高，胚胎孵化率越低，但是突變效率會隨之升高。2019年，該團隊又利用這項技術敲除斜紋夜蛾ebony基因以研究色素沉積的機制(Bietal., 2019)，發(fā)現色素沉積在鱗翅目昆蟲化蛹過程中具有調控作用，為鱗翅目害蟲基因功能研究提供新的標記基因。Chang等(2017)通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除雄性棉鈴蟲Helicoverpaarmigera感受性信息素次要組分的氣味受體基因HarmOR16，導致其可與未成熟的雌性交配，闡明棉鈴蟲次要性信息素成分作為性信息素拮抗劑參與調控棉鈴蟲的最優(yōu)交配時機。Wang等(2018)利用CRISPR/Cas9技術在棉鈴蟲體內敲除解毒酶基因簇CYP6AE，使用殺蟲劑處理后顯著降低棉鈴蟲的存活率。Liu等(2020)利用CRISPR/Cas9技術同時引入兩個基因的sgRNA進行雙敲除試驗，證實小菜蛾Plutellaxylostella兩個氣味受體蛋白共同作用識別異硫氰酸酯類化合物，解析小菜蛾識別十字花科寄主植物的分子機制。最新的一項研究揭示基因編輯技術在半翅目昆蟲煙粉虱中取得突破性進展，Heu等(2020)利用ReMOT control技術，對Cas9蛋白進行修飾，融合一段卵巢靶向配體肽鏈，與sgRNA混合后直接向雌性煙粉虱體內注射，最終得到基因編輯后的子代，為解決煙粉虱胚胎小、注射難度大等技術難題提供新的方法。

5 在有益昆蟲利用上的研究與應用

鱗翅目家蠶Bombyxmori具有良好的經濟價值，已經有多個研究團隊利用基因編輯技術對家蠶的基因功能進行研究。Wang等(2013)首次在家蠶中成功地應用了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將表達Cas9和sgRNA的mRNA共同注射到家蠶胚胎中，成功突變靶基因BmBLOS2，由于該基因調控家蠶幼蟲表皮中尿酸鹽顆粒的形成，因此突變后導致家蠶幼蟲表皮變?yōu)橥该魃?。通過該方法得到G0代產生嵌合體的突變效率高達90%以上，并且該基因突變品系可以實現穩(wěn)定遺傳，在G1代也可以觀察到全身變透明的轉基因家蠶幼蟲；此外，他們還通過同時注射兩條sgRNA的方法，獲得了大片段敲除的家蠶突變體。Zhu等(2015)發(fā)現在家蠶細胞中敲低NHEJ相關因子Ku70,Ku80,LigIV,XRCC4和XLF可以提高HDR的效率，并成功將EGFP基因序列敲入BmTUDOR-SN基因。Zeng等(2016)進一步優(yōu)化CRISPR/Cas9系統(tǒng)在家蠶中的應用，研究發(fā)現家蠶U6啟動子在體外和體內均能有效表達N20NGG型sgRNAs從而進行基因組編輯。相比于GN19NGG和GGN18NGG型的sgRNA設計位點，N20NGG型靶點在基因組中的匹配范圍更廣。Ma等(2017)在Cas9蛋白啟動子上游添加HR3增強子將敲除效率提高了3.5倍，并且發(fā)現另外兩種Cas9蛋白的同系物，即金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus的SaCas9和氨基酸球菌屬Acidaminococcus的AsCpf1，它們也可以在家蠶細胞中發(fā)揮切割DNA的作用。

表2 基因編輯技術在害蟲防治和益蟲利用上的應用Table 2 Application of gene editing technology in pest insects and beneficial insects

昆蟲性別決定機制復雜多樣，家蠶作為鱗翅目模式昆蟲是研究ZW型染色體昆蟲性別決定較好的材料；此外，雄性家蠶具有更高的經濟價值，因此構建雌性致死的家蠶品系也有助于降低工業(yè)養(yǎng)殖的成本。Tan等(2013)利用轉基因技術構建piggyBac轉座子介導的家蠶雌性致死品系，以獲得生產成本更低的雄性家蠶， 這一技術同樣有望被應用于害蟲的防治工作中。Xu等(2014)結合轉基因技術和TALEN技術構建出雌性不育的家蠶品系，這一表型僅在雌性中發(fā)生，而不影響雄性的正常發(fā)育。隨后，Xu等(2017)利用CRISPR/Cas9技術敲除一系列基因，闡述這些基因對家蠶性別的影響，為后續(xù)家蠶性別篩選工作提供良好的基礎。Zhang等(2018)首先利用TALEN技術構建nanos啟動子驅動的雌性特異表達的Cas9品系，并將其與靶向家蠶胚胎致死基因tra2的轉基因sgRNA表達品系進行雜交，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得雌性致死而雄性存活的家蠶后代。黃勇平和譚安江團隊利用多種基因編輯技術構建家蠶性別調控體系(Tanetal., 2013; Xuetal., 2014, 2017; Zhangetal., 2018)，這些研究為闡明家蠶性別決定的調控機制提供有力的證據。

基因編輯技術也應用在家蠶抗病毒和提高蠶絲質量等方面。Chen等(2017)利用piggyBac質粒，將IE1控制的Cas9蛋白和U6啟動子控制的sgRNA導入家蠶基因組，并以家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinuclear polyhydrosis virus, BmNPV)的early-1(ie1)和me53基因為靶標，成功切割病毒基因組序列，極大地增強家蠶的抗病毒能力，為蠶病防治提供新的手段。Xu等(2018)使用TALEN技術將蠶絲蛋白重鏈基因FibH替換為蛛絲蛋白基因MaSp1。Zhang X等(2019)利用CRISPR/Cas9技術向家蠶中表達蠶絲蛋白基因FibH或FiBL內含子區(qū)域插入蛛絲蛋白基因MaSp1/MiSp1的序列，這些研究使蠶絲纖維的力學性能得到極大的改善，抗張力強度幾乎與天然蜘蛛絲纖維相當，并且轉基因能在后代中穩(wěn)定遺傳。

此外，Zhang ZJ等(2019)利用CRISPR/Cas9技術實現在家蠶體內對味覺受體基因GR66的敲除，得到的家蠶突變體改變其對桑葉的偏好性，可以進食多種食物，如水果或谷物種子。這項研究成果一旦應用于生產中，將助力家蠶養(yǎng)殖行業(yè)的快速發(fā)展。

基因編輯技術在經濟昆蟲蜜蜂中也被成功應用。Kohno等(2016)通過向西方蜜蜂Apismellifera胚胎中注射表達Cas9蛋白的mRNA和sgRNA，突變工蜂的mrjp1基因，在注射了57個胚胎之后得到6頭發(fā)育為蜂后的雌蜂，并有1頭蜂后可以產生雄性突變后代，為進一步研究蜜蜂的社會行為奠定基礎。McAfee等(2019)使用CRISPR/Cas9技術敲除蜜蜂2個關鍵基因feminizer和doublesex使得其性別發(fā)生改變。Liu等(2019)使用CRISPR/Cas9技術對蜜蜂寄生性錐蟲Lotmariapassim進行基因編輯，并通過HDR修復的方式插入目的基因，成功使后代攜帶上熒光標記或是獲得潮霉素抗性。因此，利用CRISPR/Cas9技術研究基因功能也有助于解析蜜蜂與寄生蟲之間的互作機制。

6 小結與展望

昆蟲基因突變最早通過高能射線輻射、化學物質誘變產生隨機突變，但是效率較低且無法控制后果；隨后，研究者也使用過特異性的轉座子介導DNA斷裂從而啟動HDR修復的方式，然而實用性和效率依然不盡人意。隨著人類對蛋白質結構與功能的了解，通過將不同DNA識別域和FokI蛋白進行融合得到有特異性的DNA切割蛋白這一想法成為可能，ZFN和TALEN技術也應運而生，其中TALEN技術更易操作。但是鑒于這兩種技術在蛋白構建上的高成本，因而很快被新發(fā)展起來的CRISPR/Cas9技術逐漸取代。

由于CRISPR/Cas9技術設計簡單，深受廣大科研工作者的青睞，該技術經過加工改造之后衍生出來更多的基因編輯工具，例如dCas9, CRISPRi, xCas9和Cas13a等系統(tǒng)，極大地豐富了調控和改造基因的手段。目前，CRISPR/Cas9基因編輯技術在昆蟲體內的研究主要分成以下幾個方向：(1)對基因編輯系統(tǒng)的優(yōu)化，增加其編輯效率以及降低脫靶效應；(2)基于該系統(tǒng)進行新型基因調控工具的開發(fā)；(3)對工業(yè)生產、農業(yè)生產、害蟲防治等方面的轉基因昆蟲品系構建；(4)重要基因的體內功能研究。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在昆蟲中的應用仍然有較多亟待解決的問題，例如脫靶效應是基因編輯技術中無法繞過的難題。目前，一些研究通過優(yōu)化sgRNA堿基偏好性和序列長度以降低脫靶效應，并且已經取得顯著成效。Ren等(2014b)在模式昆蟲果蠅中對影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性和效率的sgRNA參數進行系統(tǒng)的研究，發(fā)現當sgRNA與基因組DNA有3個及以上的核苷酸不匹配時，不會發(fā)生脫靶效應。此外，該研究團隊還證明，在果蠅中CRISPR/Cas9系統(tǒng)的突變效率與sgRNA中6個前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM) 近端核苷酸的GC含量存在強烈的正相關，對提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)在其他昆蟲中的效率有一定的借鑒作用。除了對sgRNA進行優(yōu)化，也可以針對Cas9蛋白進行優(yōu)化，如通過修飾PAM識別位點，擴充Cas9蛋白的潛在識別位點(Kleinstiveretal., 2015)或是直接使Cas9蛋白變得更具有特異性(Slaymakeretal., 2016)。最近的研究顯示，利用噬菌體輔助的連續(xù)進化(phage-assisted continuous evolution, PACE)方式得到一個SpCas9變體，即xCas9蛋白，可以識別廣泛的PAM序列(包括NG，GAA和GAT)，并且脫靶效應更低(Huetal., 2018)。這些發(fā)現擴大了CRISPR系統(tǒng)的DNA靶向范圍以實現更高效的編輯。

基于dCas9蛋白開發(fā)的一系列遺傳學工具具有各自的特點。dCas9是突變掉Cas9蛋白內切酶活性位點的DNA結合蛋白，不具有切割活性，只能結合DNA。dCas9蛋白結合在DNA上，可以直接影響RNA聚合酶的正常轉錄(Bikardetal., 2013)。對dCas9進一步改造并融合其他效應蛋白后可以實現對特定基因的CRISPR干擾(CRISPR interference, CRISPRi)或CRISPR激活(CRISPR activation, CRISPRa)，以及對特定的染色質區(qū)域進行修飾(Brockenetal., 2017)。目前，這些dCas9相關技術已經在昆蟲中得到應用，例如在果蠅體內開發(fā)了dCas9-VPR轉錄激活系統(tǒng)(Linetal., 2015; Ewen-Campenetal., 2017)，最初需要兩個sgRNA同時表達才能激活目的基因轉錄，增加了操作的復雜性和成本，隨后，Jia等(2018)對其進行優(yōu)化并得到了更為高效便捷的flySAM系統(tǒng)，即利用自剪切肽T2A將dCas9-VP64和MCP-p65-HSF1融合，并將該融合蛋白與sgRNA整合為一個載體，這樣僅需一次遺傳雜交，就可以激活一個甚至同時激活多個基因的表達，并且比VPR系統(tǒng)效率更高。

然而，隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)被研究得越來越透徹，在系統(tǒng)優(yōu)化過程中，邊際效應也逐漸明顯，因此利用各種手段直接尋找新型基因編輯工具也成為一大研究熱點。例如Cas13a蛋白可以通過靶向RNA從而實現RNA編輯(Abudayyehetal., 2016)，避免對生物基因組的破壞，對許多領域的研究具有非常廣闊的應用前景。隨著基因編輯技術研究手段的不斷深入，相信越來越多CRISPR/Cas家族成員的功能將被揭示，這些新技術的發(fā)展對昆蟲的基因功能、病蟲害防治、經濟性昆蟲改良等方面的研究具有舉足輕重的作用。