更換飼料對(duì)家蠶幼蟲腸道細(xì)菌組成的影響及關(guān)鍵物種與產(chǎn)繭性能的相關(guān)性

張雨麗, 曾 珠, 劉艷偉, 陸俁伽, 韋 偉,魯 成, 崔為正, 閉立輝, 王平陽, 張桂征,*

(1. 廣西蠶業(yè)科學(xué)研究院, 南寧 530007; 2. 西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院, 重慶 400715;3. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 山東泰安 250100)

人工飼料飼養(yǎng)家蠶Bombyxmori具有高效、有利于防病、可標(biāo)準(zhǔn)化等諸多優(yōu)勢(shì)(何金濤等, 2020)，是蠶絲產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的重要途徑。人工飼料飼養(yǎng)家蠶與桑葉飼養(yǎng)在代謝方面有諸多不同(Dongetal., 2017)，人工飼料飼養(yǎng)家蠶產(chǎn)絲量少、絲蛋白合成效率低等問題一直阻礙人工飼料養(yǎng)蠶技術(shù)的應(yīng)用。目前養(yǎng)蠶業(yè)生產(chǎn)上主要推行使用人工飼料飼養(yǎng)小蠶、大蠶更換為桑葉的一種省力化模式(崔為正等, 2016; 金勤生等, 2019)。

前人研究表明，飼料的轉(zhuǎn)換會(huì)導(dǎo)致家蠶腸道微生物發(fā)生變化。相輝等(2007)探討了家蠶食性與其腸道微生物群落可能的關(guān)系，用含桑葉粉的飼料與不含桑葉粉飼料飼養(yǎng)家蠶，優(yōu)勢(shì)菌腸球菌屬Enterococcus的組成在家蠶品系和不同食料喂養(yǎng)條件下有著一定的變化，無桑飼料喂養(yǎng)條件下家蠶品系中腸內(nèi)還出現(xiàn)了新的次優(yōu)勢(shì)菌葡萄球菌屬Staphylococcus。向蕓慶等(2010)利用不同的?？浦参镨先~與桑葉分別飼養(yǎng)家蠶, 發(fā)現(xiàn)家蠶腸道微生態(tài)細(xì)菌種群組成發(fā)生變化，柘葉飼養(yǎng)不如桑葉飼養(yǎng)家蠶的腸道菌群豐富，推測(cè)這種改變可能與柘葉飼養(yǎng)的家蠶生長發(fā)育不良、容易患病具有相關(guān)性。Liang等(2014)比較了飼喂生菜與飼喂桑葉的家蠶腸道微生物變化，發(fā)現(xiàn)飼喂生菜的家蠶腸道菌群多樣性明顯低于飼喂桑葉的，優(yōu)勢(shì)菌也不同，推測(cè)腸道菌群的變化是導(dǎo)致飼喂生菜的家蠶生理活性下降的原因之一。飼喂家蠶的食物中添加了病毒(孫振麗, 2016)、氟化物(Lietal., 2016)、亞精胺(Rajanetal., 2020)等物質(zhì)后家蠶腸道微生物也受到很大影響。Dong等(2018)分析了全齡桑葉育和人工飼料育5 齡幼蟲的腸道微生物群差異，表明與桑葉育家蠶相比，人工飼料育家蠶的腸道微生物菌群多樣性和優(yōu)勢(shì)菌發(fā)生了很大變化，并可能與人工飼料育家蠶出現(xiàn)的發(fā)育、代謝和疾病抵抗性等多種問題相關(guān)。郝長富等(2019)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)桑葉飼育的廣食性家蠶腸道微生物多樣性較高于經(jīng)全齡人工飼料飼育的廣食性家蠶。

從研究報(bào)道可以看出，全齡人工飼料育與桑葉育的家蠶腸道微生物多樣性有很大差異，并可能與家蠶的抗病性等性狀相關(guān)，但目前沒有關(guān)于家蠶從食用人工飼料途中又轉(zhuǎn)為食用桑葉后其腸道微生物的變化情況及與生產(chǎn)性能相關(guān)性的研究報(bào)道。桂蠶5號(hào)為通過廣西農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定的人工飼料適應(yīng)性家蠶品種(張雨麗等, 2020)，對(duì)人工飼料攝食性優(yōu)，是可在生產(chǎn)上應(yīng)用人工飼料飼養(yǎng)的實(shí)用性家蠶新品種。本研究旨在以桂蠶5號(hào)為材料，利用16S rDNA測(cè)序與分析技術(shù)，了解同一品種家蠶不同齡期食用人工飼料后轉(zhuǎn)為食用桑葉，其腸道菌群的變化情況及與蛹重、繭層量的相關(guān)性，為人工飼料小蠶共育及全齡人工飼料工廠化飼養(yǎng)生產(chǎn)蠶繭中的蠶病防治、益生菌開發(fā)等提供指導(dǎo)，并為食物影響鱗翅目昆蟲腸道微生物，進(jìn)而影響相關(guān)生物學(xué)性狀的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源及飼育處理

1.1.1試蟲來源：家蠶品種為桂蠶5號(hào)，四元雜交型生產(chǎn)用種(張雨麗等, 2020)，二化含多化血統(tǒng)，4眠。在廣西蠶業(yè)科學(xué)研究院養(yǎng)蠶室進(jìn)行飼養(yǎng)，蠶期全齡平均溫度28.03℃，全齡平均相對(duì)濕度89.01%，光周期12L∶12D。

1.1.2飼育處理:人工飼料育使用的飼料為重慶正佳飼料有限公司生產(chǎn)的粉體家蠶人工飼料，飼料與水按1∶1.8(m/v)(1-3齡幼蟲)和1∶1.6(m/v)(4-5齡幼蟲)混合，攪拌均勻后，裝入保鮮袋內(nèi)，每袋厚度約3 cm，采用蒸煮設(shè)備100℃隔水蒸煮40 min后取出，自然冷卻后切片或切條飼喂。桑葉育使用的桑葉為廣西蠶業(yè)科學(xué)研究院種植的桑樹，新鮮采摘飼喂。設(shè)置5組試驗(yàn)： 全齡桑葉育(Mul1-5)， 1-2齡人工飼料育+3-5齡桑葉育(Art1-2)，1-3齡人工飼料育+4-5齡桑葉育(Art1-3)， 1-4齡人工飼料育+5齡桑葉育(Art1-4)和 全齡人工飼料育(Art1-5)。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)300頭蠶。桑葉育采用常規(guī)一日三回育的飼育方法進(jìn)行，1-3齡小蠶切葉飼喂，4-5齡蠶葉片育。人工飼料育時(shí)，1和2齡各給餌1次，3和4齡各給餌2次，5齡給餌3次。

1.2 家蠶腸道細(xì)菌多樣性分析

于5齡第3天幼蟲，每組重復(fù)隨機(jī)取蠶30頭，饑餓處理24 h，75%乙醇體表消毒，無菌條件下取腸道內(nèi)容物，30頭蠶的腸道內(nèi)容物進(jìn)行混合均質(zhì)，提取基因組DNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2000測(cè)定DNA 濃度和純度。

16S rDNA V3-V4區(qū)的高通量測(cè)序分析：使用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 對(duì)16S rDNA 基因V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)各樣本進(jìn)行細(xì)菌多樣性測(cè)序分析。使用Fastp軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用Flash軟件進(jìn)行拼接。使用Usearch 軟件，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行可分類操作單位(operational taxonomic units, OTUs)聚類并剔除嵌合體。利用RDP Classifier對(duì)每條序列與Silva 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%，得到物種分類注釋結(jié)果。隨后對(duì)各樣本進(jìn)行Alpha多樣性分析、物種組成分析、物種比較分析、物種差異分析及相關(guān)性分析。通過Alpha多樣性指數(shù)Chao 1, Shannon和Simpson指數(shù)對(duì)各樣本的細(xì)菌豐度和多樣性進(jìn)行評(píng)估。Chao 1指數(shù)用于反映樣本中物種的豐富度，也就是指群落中包含物種的數(shù)目(OTU數(shù)目)，數(shù)值越大，表明物種越豐富；Shannon指數(shù)用于反映樣本群落的多樣性，指數(shù)越大，表明樣本群落多樣性越高；Simpson指數(shù)則同時(shí)兼顧豐富度和均勻度，它反映的是在同一個(gè)樣本中隨機(jī)抽取2個(gè)個(gè)體，這兩個(gè)個(gè)體來自不同種類的概率，Simpson指數(shù)越大則多樣性越高。通過LEfSe(LDA effect size)分析不同飼育模式下家蠶腸道菌群在豐度上有顯著性差異的物種(biomarker)。利用Spearman相關(guān)性熱圖對(duì)LEfSe’結(jié)果所得到的屬水平上的顯著性差異物種與蛹重和繭層量的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.3 全繭量、繭層量及蛹重測(cè)定

蠶上蔟六足天時(shí)，銷開繭殼，每個(gè)重復(fù)選取雌雄繭各25粒，稱取全繭量和繭層量，計(jì)算各試驗(yàn)組平均全繭量、繭層量及蛹重。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果由平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS20軟件分析數(shù)據(jù)，多組比較采用One-Way ANOVA中Duncan氏多重檢驗(yàn)來分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人工飼料與桑葉不同搭配飼育模式對(duì)家蠶繭質(zhì)的影響

由表1可知，人工飼料與桑葉不同搭配的飼育模式對(duì)家蠶繭質(zhì)有顯著的影響。從全繭量來看，Mul1-5組和Art1-5組的全繭量最高，二者無顯著性差異(P>0.05)；其次是Art1-2組(比Mul1-5組低3.86%)；Art1-3和Art1-4組的全繭量最低，二者差異不顯著(P>0.05)。 從繭層量來看，Mul1-5組繭層量最高，其次是Art1-2組(比Mul1-5組低7.2%)；然后是Art1-3和Art1-4組，二者差異不顯著(P>0.05)；Art1-5組繭層量最低，比Mul1-5組低22%。從蛹重來看，隨著人工飼料飼養(yǎng)時(shí)間的延長，蛹重有降低的趨勢(shì)，但是全齡人工飼料育(Art1-5組)的蛹重卻達(dá)到最高。

表1 不同飼育模式下的家蠶全繭量、繭層量和蛹重Table 1 The whole cocoon, cocoon layer and pupal weights of Bombyx mori under different rearing patterns

2.2 家蠶幼蟲腸道細(xì)菌16S rDNA序列組裝與拼接

5組不同的飼育模式下共收集家蠶幼蟲腸道樣品15個(gè)(每組重復(fù)3次)，通過細(xì)菌16S rDNA測(cè)序共得到1 074 926條有效的序列，其中樣本最大序列數(shù)為76 462條，最小序列數(shù)為65 238條，樣本Mul1-5的平均有效序列數(shù)為73 074條，Art1-2的為70 460條，Art1-3的為68 492條，Art1-4的為72 667條，Art1-5的為73 616條，樣本測(cè)序數(shù)目較大，能夠充分保證數(shù)據(jù)的可靠性。樣本序列長度為200～500 bp不等，有98.2% reads序列長度在400～500 bp。

對(duì)OTU聚類分析發(fā)現(xiàn)，Art1-2組家蠶腸道細(xì)菌OTU數(shù)目最多，為484; Art1-3組的OTU數(shù)目最少，為284;其他3組的OTU數(shù)目幾乎相同。通過Venn圖比較5組家蠶共有和獨(dú)特的OTU數(shù)目(圖1)，5組家蠶腸道細(xì)菌共有96種OTUs，表明5組家蠶腸道細(xì)菌具有較多的相同物種。另外，有73種腸道細(xì)菌是Mul1-5組獨(dú)有的，有286種是Art1-2組獨(dú)有的，有81種是Art1-3組獨(dú)有的，有132種是Art1-4組獨(dú)有的，有125種是Art1-5組獨(dú)有的，表明人工飼料飼育不同齡期再更換為桑葉育后家蠶腸道細(xì)菌某些種類發(fā)生了變化。

圖1 不同飼育模式下家蠶幼蟲腸道細(xì)菌OTU分布Venn圖Fig. 1 Venn diagram of OTUs of intestinal bacteria inBombyx mori larvae under different rearing patterns

2.3 家蠶幼蟲腸道細(xì)菌Alpha和Beta多樣性

與Mul1-5組相比，其他4組的Chao 1指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，但是Art1-2組Chao 1指數(shù)顯著高于Art1-3組(P<0.05)，表明Art1-2含有的細(xì)菌物種數(shù)量顯著高于Art1-3組。5組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，表明更換飼料對(duì)家蠶腸道細(xì)菌物種多樣性無顯著影響(圖2)。

圖2 不同飼育模式下家蠶幼蟲腸道細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Fig. 2 The alpha diversity indices of intestinal bacteria of Bombyx mori larvae under different rearing patternsA: Chao 1指數(shù)Chao 1 index; B: Shannon指數(shù)Shannon index; C: Simpson 指數(shù)Simpson index.

進(jìn)一步通過腸道細(xì)菌Beta多樣性(PCoA)分析不同飼育模式下家蠶幼蟲腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)變化。通過PCoA分析可以觀察組內(nèi)樣品或組間樣品的差異，不同樣本間的距離代表其物種組成的差異情況，樣品距離越近，說明樣品之間的細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)越相似，差異性越小。由圖3所示，PCoA1和PCoA2的樣品差異性貢獻(xiàn)率分別為82.15%和6.36%，是差異的主要來源。 與Art1-2組相比，Art1-3, Art1-4和Art1-5組與之的凝聚距離較大，說明家蠶腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯的不同。 而Art1-3, Art1-4和Art1-5 3組之間的距離較近，說明家蠶腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似。

圖3 不同飼育模式下家蠶腸幼蟲道細(xì)菌的Beta多樣性分析——基于Bray-Curtis距離的主成分分析Fig. 3 Beta diversity analysis of intestinal bacteria ofBombyx mori larvae under different rearing patternsbased on the Bray-Curtis distance: Principalcoordinate analysis (PCoA)

2.4 家蠶幼蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)

為了研究不同飼育模式對(duì)家蠶腸道細(xì)菌分類組成的影響，我們分別在門和屬水平上進(jìn)行了分類分析。在門水平上，5組家蠶腸道中含量最豐富的菌群均是變形菌門(Proteobacteria)，其次是厚壁菌門(Firmicutes)(圖4)，但在Mul1-5組中，兩種菌群分別占總菌群的73.9%和23.5%，比值約為3.1∶1，在Art1-2組中分別占總菌群的54.3%和42.8%，比值約為1.3∶1。而在Art1-3, Art1-4和Art1-5組中，它們分別占總菌群的89.2%/8.7%, 91.8%/5.8%和96.1%/1.0%，比值分別為10.2∶1, 15.9∶1和96.1∶1。

圖4 不同飼養(yǎng)模式下家蠶幼蟲腸道細(xì)菌在門水平的相對(duì)豐度Fig. 4 Relative abundance of intestinal bacteria at the phylum level in Bombyx mori larvae under different rearing patterns

在屬水平上，5組家蠶腸道主要含有假單胞菌屬Pseudomonas、腸球菌屬Enterococcus、鞘脂單胞菌科未分類菌屬Sphingomonadaceae unclassified及羅爾斯通菌屬Ralstonia(圖5)。各組家蠶菌屬豐度差異較大的是假單胞菌屬和腸球菌屬。對(duì)于假單胞菌屬，Mul1-5組和Art1-2組豐度無明顯差異，但顯著低于Art1-3, Art1-4和Art1-5組。對(duì)于腸球菌屬，Art1-2組豐度最高占40.9%，其次是Mul1-5組占22.7%，在Art1-3, Art1-4和Art1-5中豐度逐漸降低，分別占8.1%, 4.6%和0.02%。

圖5 不同飼育模式下家蠶幼蟲腸道細(xì)菌在屬水平的相對(duì)豐度(A)及具有顯著性差異的假單胞菌屬(B)和腸球菌屬(C)的相對(duì)豐度Fig. 5 Relative abundance of intestinal bacteria at the genera level in Bombyx mori larvae under different rearingpatterns (A) and the relative abundance of Pseudomonas (B) and Enterococcus (C) with significant difference

2.5 家蠶幼蟲腸道顯著性差異的細(xì)菌物種

如圖6所示，Mul1-5組中選擇性地富集了15種細(xì)菌，包括柄桿菌科(Caulobacteraceae)、柄桿菌目(Caulobacterales)、未被培養(yǎng)的柄桿菌種(unculturedCaulobactersp.)、柄桿菌屬Caulobacter以及沙壤土桿菌屬Ramlibacter等。 Art1-2組中富集了腸球菌屬、腸球菌科(Enterococcaceae)、糞腸球菌Enterococcusfaecium、乳酸桿菌目(Lactobacillales)、乳酸桿菌屬Lactobacillus、桿菌綱(Bacilli)和厚壁菌門等。 Art1-3組中只富集了鶉雞腸球菌Enterococcusgallinarum。Art1-5組中則富集了變形菌門、γ變形菌綱(Gammaproteobacteria)、柯克斯體科(Coxiellaceae)、α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、柯克斯體屬Coxiella、短波單胞菌屬Brevundimonas、柄桿菌Caulobactersp. NW-2013-Rh15、綠彎菌門(Chloroflexi)、綠彎菌綱(Chloroflexia)、熱微菌目(Thermomicrobiales)、生絲微菌Hyphomicrobiumdenitrificans等。

圖6 采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)分析在0.05的顯著性水平上具有顯著性差異的不同飼育模式下家蠶幼蟲腸道細(xì)菌物種Fig. 6 The significant differential intestinal bacteria in Bombyx mori larvae under different rearing patternsusing the nonparametric factorial Kruskal-Wallis rank sum test at a significance level of 0.05LDA得分高于2分表示相應(yīng)組別的細(xì)菌相對(duì)豐度高于其他4組的。An LDA score higher than 2 suggests higher relative abundance of bacteria in the corresponding group than in the other four groups.

2.6 家蠶幼蟲腸道關(guān)鍵細(xì)菌與蛹重和繭層量的相關(guān)性

如圖7所示，LEfSe分析結(jié)果表明家蠶幼蟲腸道中的某些細(xì)菌與蛹重以及繭層量均存在顯著相關(guān)性。柯克斯體屬與蛹重呈顯著正相關(guān)，與繭層量呈顯著負(fù)相關(guān)；葡萄球菌屬與蛹重呈顯著負(fù)相關(guān)；腸球菌屬與繭層量呈顯著正相關(guān)。

圖7 不同飼育模式下家蠶幼蟲腸道關(guān)鍵細(xì)菌物種與蛹重和繭層量的Spearman相關(guān)性熱圖Fig. 7 Spearman correlation heatmap of the correlationbetween the key intestinal bacteria in Bombyx morilarvae under different rearing patterns and thepupal weight and cocoon layer weight顏色范圍從藍(lán)色(負(fù)相關(guān))到紅色(正相關(guān))，**P<0.01為顯著相關(guān)。The colors range from blue (negative correlation) to red (positive correlation), and significant correlations are shown by **P<0.01.

3 討論

目前，蠶業(yè)生產(chǎn)上常用的家蠶品種多為4眠性品種，這些品種的家蠶幼蟲要經(jīng)歷4次蛻皮、5個(gè)幼蟲齡期才能結(jié)繭。與桑葉育相比，人工飼料飼育的家蠶產(chǎn)絲量少、絲蛋白合成效率低的問題一直未得到解決。研究者試圖通過對(duì)比分析全齡人工飼料育與桑葉育家蠶的蛋白質(zhì)組學(xué)(Zhouetal., 2008)、代謝組學(xué)(Dongetal., 2017)及腸道微生物差異(Dongetal., 2018)來分析其潛在的機(jī)理。但以上相關(guān)研究均采用的全齡人工飼料與桑葉育進(jìn)行對(duì)比，本研究使用人工飼料與桑葉相結(jié)合飼喂家蠶不同齡期幼蟲，即全齡桑葉育(Mul1-5)、1-2齡人工飼料育+ 3-5齡桑葉育(Art1-2)、1-3齡人工飼料育+ 4-5齡桑葉育(Art1-3)、1-4齡人工飼料育+5齡桑葉育(Art1-4)和全齡人工飼料育(Art1-5)5種飼養(yǎng)模式，更加全面地分析了家蠶在更換了飼料以后幼蟲腸道細(xì)菌的變化情況及與基本生產(chǎn)性狀——蛹重、繭層量的相關(guān)性，對(duì)人工飼料+桑葉相結(jié)合飼喂家蠶的飼養(yǎng)模式更有指導(dǎo)意義。

從全繭量來看，隨著人工飼料飼育時(shí)間的延長，全繭量逐漸降低，但值得關(guān)注的是全齡人工飼料育的全繭量并沒有最低，反而達(dá)到最高(表1)，與全齡桑葉育的無顯著差異(P>0.05)，蛹重的變化趨勢(shì)與全繭量的變化趨勢(shì)保持一致。從繭層量來看，隨著人工飼料飼育時(shí)間的延長，繭層量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，全齡人工飼料育的繭層量最低。Dong等(2017)研究發(fā)現(xiàn)全齡人工飼料育的家蠶繭層量顯著低于全齡桑葉育，本研究結(jié)果(表1)與其保持一致。全齡人工飼料育的家蠶全繭量在5種飼育模式中最高而繭層量最低，推測(cè)該飼育模式最有利于蠶蛹的生長發(fā)育，但產(chǎn)絲量最低。綜合全繭量和繭層量兩項(xiàng)指標(biāo)來看，1-2齡人工飼料育+ 3-5齡桑葉育(Art1-2)這種飼育模式最接近于全齡桑葉育，可為生產(chǎn)上人工飼料小蠶共育提供參考。

腸道微生物群對(duì)宿主營養(yǎng)、病原體抗性和代謝等功能至關(guān)重要(Nicholsonetal., 2012)，并受到宿主食物的巨大影響(De Filippoetal., 2010)。本研究分析了人工飼料與桑葉不同搭配飼育模式下家蠶腸道菌群的變化，并分析了腸道菌群與家蠶繭質(zhì)的相關(guān)性。從Alpha多樣性分析結(jié)果來看，與全齡桑葉育(Mul1-5組)相比，添加人工飼料的其他4組的Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)(圖2)，表明更換飼料對(duì)家蠶腸道細(xì)菌豐富度及多樣性無顯著影響。但值得注意的是，Art1-2組Chao 1指數(shù)顯著高于Art1-3組(P<0.05)，表明1-2齡人工飼料育+3-5齡桑葉育家蠶腸道細(xì)菌所含有的物種數(shù)量顯著高于1-3齡人工飼料育+4-5齡桑葉育的，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。從Beta多樣性分析結(jié)果來看，Art1-3, Art1-4和Art1-5 3組之間的細(xì)菌物種多樣性較相似，但是與Art1-2組相比腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯的不同(圖3)。具體的細(xì)菌分類組成方面，在門水平上，Art1-2組和Mul1-5的細(xì)菌組成最相近，優(yōu)勢(shì)菌主要是變形菌門(分別為54.3%和73.9%)和厚壁菌門(分別為42.8%和23.5%)；而Art1-3, Art1-4和Art1-5三組的細(xì)菌組成最相近，變形菌門隨著飼料養(yǎng)蠶時(shí)間的增加逐漸增加，在Art1-5組中占比為96.1%，厚壁菌門則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，在Art1-5組中降低至1.0% (圖4)。在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)家蠶腸道優(yōu)勢(shì)菌屬有假單胞菌屬、腸球菌屬、鞘脂單胞菌科未分類菌屬及羅爾斯通菌屬等。Chen等(2018)對(duì)大造品系家蠶腸道細(xì)菌進(jìn)行宏基因組測(cè)序，共鑒定了包括腸球菌、芽孢桿菌屬Bacillus、腸桿菌屬Enterobacter、葡萄球菌屬、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter等在內(nèi)的663種細(xì)菌，并分析了家蠶不同發(fā)育階段的腸道微生物情況，發(fā)現(xiàn)早齡期和晚齡期腸道菌群結(jié)構(gòu)具有明顯變化。Hou等(2018)通過高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)5齡幼蟲腸道主要的菌屬包括假單胞菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬、節(jié)細(xì)菌屬Arthrobacter和乳桿菌屬Lactobacillus。Yeruva等(2020)通過宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)家蠶優(yōu)勢(shì)菌屬主要包括乳桿菌屬、芽孢桿菌屬和腸球菌屬?？梢姡c球菌屬是家蠶最常見的優(yōu)勢(shì)菌屬，在較多研究中都有報(bào)道，而其他的一些菌屬在不同的研究中存在差異，其原因可能是因?yàn)榧倚Q品系、人工飼料組成及收集腸道微生物的齡期等因素。本研究中，人工飼料與桑葉不同搭配的5種飼育模式中，家蠶腸道菌屬豐度差異最大的是腸球菌屬(圖5: C)。Art1-2組中腸球菌屬豐度最高(40.9%)，隨著人工飼料養(yǎng)蠶時(shí)間的延長，豐度逐漸降低，在全齡人工飼料飼育模式中僅為0.02%。相輝等(2007)報(bào)道，腸球菌的多樣性隨著家蠶的品種、喂養(yǎng)條件及生理狀況等呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的趨勢(shì)。腸球菌是家蠶腸道中的高頻微生物，在家蠶消化桑葉中起重要作用。也有研究發(fā)現(xiàn)家蠶腸球菌的豐度與增強(qiáng)免疫力有關(guān)(Sunetal., 2016)，腸球菌可通過激活Toll和IMD免疫通路發(fā)揮促免疫的作用(Kumaretal., 2019)。因此，推測(cè)腸球菌在人工飼料養(yǎng)蠶中豐度的降低可能與飼料養(yǎng)蠶體質(zhì)弱有關(guān)。在本研究中另一個(gè)變化較顯著的菌種是假單胞菌屬，其在Mul1-5組和Art1-2組的豐度顯著低于其他3組(圖5: B)，表明隨著添加人工飼料時(shí)間的延長可能會(huì)增加假單胞菌在腸道中的比例。假單胞菌是一種常見的條件致病菌，通常在昆蟲體內(nèi)或體外少量存在，正常情況下不會(huì)引起疾病，但在昆蟲受到一定的脅迫和/或當(dāng)昆蟲的免疫系統(tǒng)減弱時(shí)，它們可能會(huì)致病(Maciel-Vergaraetal., 2018)，因此推測(cè)假單胞菌可能是引起全齡人工飼料養(yǎng)蠶體弱多病的另一因素。

通過LEfSe分析不同飼養(yǎng)模式下家蠶腸道菌群顯著性差異，發(fā)現(xiàn)各組均有差異顯著性物種，且部分關(guān)鍵物種與繭質(zhì)呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。例如腸球菌屬與繭層量呈顯著正相關(guān)；柯克斯體屬與蛹重呈顯著正相關(guān)，與繭層量呈顯著負(fù)相關(guān)；葡萄球菌屬與蛹重呈顯著負(fù)相關(guān)(圖7)。腸球菌屬屬于革蘭氏陽性、不產(chǎn)孢子的兼性厭氧菌，屬于乳酸菌的一類，迄今為止，腸球菌屬已知包括的種達(dá)到36個(gè)，其通常存在于人類和動(dòng)物的腸道、乳制品以及環(huán)境中。腸球菌屬里的某些種如糞腸球菌Enterococcusfaecium和E.faecalis是研究得較多的菌種，可以促進(jìn)人的系統(tǒng)性免疫，也被證實(shí)能夠促進(jìn)動(dòng)物的生產(chǎn)性能(Nueno-Palop and Narbad, 2011; Liuetal., 2017)。腸球菌也是家蠶腸道中的高頻微生物，在家蠶中被報(bào)道具有提高免疫力(Sunetal., 2016)和抑制微孢子蟲孢子發(fā)芽的作用(魯興萌和汪方煒, 2002)。本研究中發(fā)現(xiàn)腸球菌屬與繭層量呈顯著正相關(guān)，表明其可能在促進(jìn)產(chǎn)絲量方面具有重要作用，這在家蠶中屬于新的發(fā)現(xiàn)。家蠶對(duì)食物中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用是影響家蠶生長發(fā)育及蠶繭產(chǎn)量和質(zhì)量的最主要因素。向桑葉中補(bǔ)充不同的營養(yǎng)物質(zhì)如碳水化合物、氨基酸和蛋白質(zhì)等是提高繭絲經(jīng)濟(jì)指標(biāo)的重要策略(Konalaetal., 2013)。目前已有各方面的證據(jù)表明腸道微生物也能夠?yàn)樗拗魈峁┥L所需的營養(yǎng)物質(zhì)，如微生物可以產(chǎn)生必需氨基酸及分解食物中宿主難以消化的化合物(Douglas, 2017; Ceja-Navarroetal., 2019)。因此推測(cè)腸球菌可能通過促進(jìn)家蠶的營養(yǎng)代謝從而提高產(chǎn)絲量，但是還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。柯克斯體屬屬于γ變形菌綱，在家蠶腸道微生物中鮮有報(bào)道，但是屬于大多數(shù)蜱蟲的特征性營養(yǎng)共生菌，具有多種B族維生素的生成途徑，可為宿主提供營養(yǎng)素(Nardietal., 2020)，本研究中柯克斯體屬屬于Art1-5組中富集的關(guān)鍵物種(圖6)，其與蛹重呈顯著正相關(guān)、與繭層量呈顯著負(fù)相關(guān)，我們推測(cè)柯克斯體屬可能主要通過參與B族維生素的生成促進(jìn)蛹的生長發(fā)育。葡萄球菌屬是已知報(bào)道的家蠶腸道中較常見的一類微生物，屬于革蘭氏陽性菌，多數(shù)為非致病菌，其對(duì)家蠶的功能作用目前還鮮有報(bào)道，本文中通過微生物基因功能預(yù)測(cè)的葡萄球菌屬與蛹重呈顯著負(fù)相關(guān)的關(guān)系，其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

人工飼料養(yǎng)蠶具有集約化、自動(dòng)化、節(jié)省土地、有利于防病等諸多優(yōu)勢(shì)，因此，未來對(duì)人工飼料養(yǎng)蠶技術(shù)的推廣及應(yīng)用是蠶桑產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的必然選擇。本研究分析了人工飼料與桑葉不同搭配模式飼養(yǎng)家蠶的腸道微生物變化情況及家蠶的生產(chǎn)性能差異，發(fā)現(xiàn)1-2齡人工飼料育+3-5齡桑葉育(Art1-2)這種飼育模式最接近于全齡桑葉育(Mul1-5)，可為生產(chǎn)上人工飼料小蠶共育提供參考；另外，通過本研究找出可能與產(chǎn)絲量有關(guān)的關(guān)鍵細(xì)菌，可為下一步通過調(diào)控關(guān)鍵微生物提高全齡人工飼料養(yǎng)蠶的產(chǎn)絲量提供重要理論依據(jù)。