基于PI3K/Akt通路對參芪扶正注射液防治阿霉素所致心臟毒性的作用機制研究

何 靖，余 瑩，羅 曼，藍 海，吳 偉，黃曉華，古學奎*

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣州 510405；2.深圳大學附屬華南醫(yī)院，廣東 深圳 518111；3.廣州中醫(yī)藥大學附屬順德醫(yī)院，廣東 順德 528300）

阿霉素（DOX）作為蒽環(huán)類化療藥物的代表藥，由于其抗瘤譜廣，在臨床作為白血病、淋巴瘤、乳腺癌、軟組織肉瘤等諸多腫瘤化療方案的重要成分，被廣泛使用，其累計劑量達550 mg·m-2時[1]，約7%患者會出現(xiàn)心力衰竭。且隨著藥物劑量的增加，其對心臟的累積毒性作用也越來越大，繼而出現(xiàn)心悸、呼吸困難、胸悶、胸痛、心肌酶學改變，甚則心衰等系列臨床表現(xiàn)[2-3]。因此，臨床用藥過程中，防治DOX所致的急性心力衰竭（簡稱急性心衰）至關重要。

參芪扶正注射液（SFI）由補氣佳藥之黨參和黃芪組成，是臨床益氣扶正、固本祛邪的常用中成藥制劑，尤其在抗腫瘤的輔助治療中，可以改善因正氣虧虛或耗損而出現(xiàn)的神疲乏力，少氣懶言、心悸氣短等諸癥，對于DOX所致的急性心衰出現(xiàn)的心氣虛癥狀效果尤佳[4-6]。然而，盡管其在臨床應用廣泛，但關于參芪扶正注射液對DOX急性心衰療效的作用機制尚不明確。磷酸肌醇3激酶/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B signaling pathway，PI3K/Akt）信號通路在心臟信號傳導、心肌細胞生長增殖與凋亡、維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用，且參與調控細胞的損傷與修復、存活與凋亡[7-8]。課題組前期構建網(wǎng)絡藥理學，通過KEGG通路富集分析表明，PI3K-Akt信號通路是參芪扶正注射液防治蒽環(huán)類藥物引起的心臟毒性的主要作用途徑為之一[9]，因此，本研究繼續(xù)課題組思路，試通過構建大鼠的阿霉素急性心衰模型，從PI3K-Akt信號通路相關的生物學指標進一步探究參芪扶正注射液對其的作用機理。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SD大鼠，雄性12只，180～220 g，廠家：湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 實驗試劑與儀器

1.2.1 實驗試劑 麗珠集團利民制藥廠的參扶正注射液（批號：190419）；深圳萬樂藥業(yè)有限公司的鹽酸阿霉素（批號：1812E1）；江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司的DZR（批號：E1905052）；上海展云化工有限公司的水和氯醛（批號：171110）；Solarbio公司的伊紅染色液（G1100）；碧云天生物試劑TUNEL檢測試劑盒（C1090）；北京普利萊基因技術有限公司的RIPA細胞裂解液（C1053）；北京康為世紀生物科技有限公司的BCA蛋白定量試劑盒（BCAProteinAssayKit）（CW0014S）；其余試劑與儀器尚有：內參一抗：Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（TA-08，中杉金橋，1/2000）；二抗：辣根酶標記山羊抗鼠IgG（H+L）（ZB-2305，中杉金橋，1/2000）；目的一抗：Rabbit Anti-Akt（ab8805，Abcam，1/500）；目的一抗：Rabbit Anti-P-akt（bs-2720R，Bioss，1/500）；二抗：辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（ZB-2301，中杉金橋，1/2000）；蘇木素染液（ZLI-9610，中衫金橋）；大鼠腦鈉素：腦鈉尿肽（BNP）試劑盒（MM-0067R1，酶免）；大鼠心肌肌鈣蛋白I（cTn-I）試劑盒（MM-61550R1，酶免）。

1.2.2 實驗儀器 高分辨率小動物系統(tǒng)（廠家：加拿大多倫多，VEVO）；顯微鏡（CX41OLYMPUS）；切片機（2235，Leica）；電熱鼓風干燥箱（DHG-9070A，恒科學儀器有限公司）；熒光顯微鏡（CKX53，OLYMPUS）；紫外分光光度儀（NP80，NanoPhotometer）；蛋白垂直電泳儀（DYY-6C，北京市六一儀器廠）；超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDocTMXRS+，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品上海有限公司）；全自動酶標儀（北京六一儀器廠，WD-2102B）。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

1）空白對照組（Control組）；2）阿霉素組（Model組）；3）阿霉素+參芪扶正注射液組（SFI組）；4）阿霉素+右丙亞胺組（DZR組）。

2.2 大鼠心衰模型的建立

1）造模：用生理鹽水配制DOX（0.625 mg·mL-1）后進行腹腔注射，每周1次，共6周。除空白對照組外均尾靜脈注射配制好的DOX藥液（2.5 mg·kg-1），模型+參扶正注射液組注射DOX前30 min尾靜脈注射參扶正注射液（每只4 mL），模型+DZR組注射DOX前30 min尾靜脈注射DZR（50 mg·kg-1）。取血：先以腹腔注射10%水合氯醛溶液（300 mg·kg-1）進行全身麻醉；再進行取血，用毛細玻璃管平端先沿著鼻側眼角慢慢滑動至眼球正下方的眼皮內，左手微微順時針旋轉，使大鼠頭部相對位置微向右下偏轉，使得玻璃管刺入時對著大鼠口腔方向，找準位置后，右手及毛細管保持不動，將毛細玻璃管刺入后快速擰搓毛細管，進一步破壞內眥靜脈叢，加快出血速度，最后接住流出血液。2）取樣：各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg·kg-1）麻醉后腹主動脈取血處死。3）取材：打開大鼠胸腔取出心臟組織置于福爾馬林中固定保存，后石蠟切片后進行HE染色，剩余心肌組織冰凍保存用于WB檢測。

2.3 HE染色

取出大鼠心肌組織以流水沖洗數(shù)小時后以不同濃度梯度（70%、80%、90%）乙醇溶液脫水；后置于純酒精、二甲苯等量混合液中至透明為止（二甲苯Ⅰ15 min、Ⅱ15 min）；再放入二甲苯和石蠟各半的混合液15 min、放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50～60 min后進行石蠟包埋、切片、烤片，然后脫蠟及水化；將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，用流水稍洗后置于返藍液中返藍15s，流水沖洗后以伊紅染色3 min，流水沖洗后進行脫水、透明、封片、鏡檢，則完成此步驟。

2.4 TUNEL檢測

依次進行以下實驗步驟：將組織切片入放入65℃烤箱中烤2 h進行烤片；將切片在二甲苯放置10 min，更換二甲苯再放置10 min以脫蠟；將切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和純化水中各5 min進行水化；將切片移入濕盒中，每個樣本上滴加50 ug·mL-1ProteinaseK工作液，37℃反應30 min以修復；DPBS充分洗滌3次，每次5 min，把蛋白酶K洗滌干凈后進行TUNEL檢測：用吸水紙吸掉組織周圍的PBS，每張玻片滴加足夠量的TUNEL檢測液，45℃避光孵育2 h（濕盒內保持濕潤，以盡量減少TUNEL檢測的揮發(fā)）；再以PBS洗滌3次，每次5 min；最后用吸水紙吸干玻片上的液體，用抗熒光淬滅封片后熒光顯微鏡下觀察。呈現(xiàn)結果：細胞核為藍色熒光，凋亡細胞為紅色熒光。

2.5 Western blot檢測

取各組大鼠心肌組織細胞加入裂解液，放冰上裂解30 min后，4℃，以10 000 rpm/min離心10 min，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉膜30～50 min。一抗溶液孵育，4℃過夜；二抗溶液中室溫孵育1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantityone”軟件分析各抗體條帶灰度值。

2.6 ELISA檢測

取各組大鼠血清樣本，試劑和樣本都先恢復到室溫，設置標準品孔、樣本孔、空白孔，按照ELISA試劑盒說明書中所述方法操作，分別檢測樣本血清中BNP、肌鈣蛋白I（cTnI）的表達情況。

2.7 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，經(jīng)t檢驗判定顯著性差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 HE染色結果

如圖1所示，Control組心肌細胞形態(tài)、胞質、間質均正常，肌纖維排列整齊，胞質豐富均勻。與Control組比較，Model組心肌細胞水腫，輕微纖維化，嵴斷裂溶解伴有出血及炎性細胞浸潤，肌質網(wǎng)擴張；對比于Model組，SFI組及DZR組肌纖維排列均整齊，出血量減少；SFI組與DZR組相比，DZR組肌質網(wǎng)收縮，治療后情況較好。

圖1 大鼠心肌組織HE染色結果

3.2 TUNEL檢測結果

如圖2所示，與Control組比較，Model組的心肌組織凋亡細胞明顯增多；與Model組比較，SFI組及DZR組心肌組織凋亡細胞均明顯減少。

圖2 大鼠心肌組織Tunel檢測結果

3.3 ELISA檢測結果

如圖3所示，與Control組比較，在6、9周Model組c-Tnl、BNP表達增加；與Model組對比，SFI組及DZR組6、9周給藥后的c-Tnl、BNP均明顯降低（P＜0.05），其中c-Tnl在給藥6周下降更明顯，BNP在給藥9周后下降更明顯；6、9周給藥后SFI組與DZR組間c-Tnl、BNP含量無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 大鼠血清中c-Tnl、BNP的表達結果

3.4 Western blot檢測

如圖4所示，1）Akt、P-akt：與Control組比較，Model組的心肌組織Akt、P-akt的蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與Model組比較，SFI組心肌組織Akt、P-akt的蛋白表達水平升高（P＜0.05），DZR組AKT蛋白表達水平升高、P-akt蛋白表達水平下降（P＜0.05）；DZR組的AKT、P-AKT蛋白表達水平均較SFI組低（P＜0.05）。2）Bcl-2：與Control組比較，Model組的心肌組織Bcl-2的蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與Model組比較，SFI組心肌組織Bcl-2的蛋白表達水平升高（P＜0.05），DZR組的Bcl-2顯著上調（P＜0.05）；與SFI組相比，DZR組下降（P＜0.05）；3）Bax：與Control組比較，Model組的心肌組織Bax的蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與Model組比較，SFI組心肌組織Bax蛋白表達水平升高（P＜0.05），DZR組的Bax蛋白表達水平下降（P＜0.05），與SFI組相比，DZR組的Bax顯著下降（P＜0.05）；4）GSK3β、p-GSK3β：與 Control組比較，Model組的心肌組織GSK3β、p-GSK3β的蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與Model比較，SFI組心肌組織GSK3β、p-GSK3β的蛋白表達水平增高（P＜0.05）；DZR組的GSK3β、p-GSK3β的蛋白表達水平增高，無明顯差異；與SFI組比較，DZR組的GSK3β、p-GSK3β的蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05）。

圖4 大鼠心肌組織中Akt，P-akt, GSK3β、p-GSK3β、Bcl-2、Bax的蛋白表達結果

4 討論

阿霉素等蒽環(huán)類化療藥物引起心臟毒性甚則出現(xiàn)急、慢性心衰，已被眾多臨床研究報道[10]，盡管DZR是目前臨床上用于減輕蒽環(huán)類抗生素化療引起的心肌毒性的一種常見輔助用藥，但其存在骨髓抑制、增大繼發(fā)性腫瘤發(fā)生等風險且費用高[11]。因此，作為扶正祛邪的代表藥物，參芪扶正注射液在腫瘤性疾病如白血病、肺癌、乳腺癌等治療中，凸顯出其在防治蒽環(huán)類化療藥物所致心臟毒性上的優(yōu)勢[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素（DOX）誘導SD大鼠發(fā)生心臟毒性改變，具體表現(xiàn)為心肌細胞水腫，輕微纖維化，嵴斷裂溶解伴有出血及炎性細胞浸潤，肌質網(wǎng)擴張等急性心衰的病理變化，而接受參芪扶正注射液（SFI）及右丙亞胺（DZR）治療后，急性心衰模型大鼠心肌病理改變均有不同程度好轉，心肌組織凋亡細胞明顯減少。研究表明，c-Tnl、BNP是心衰診斷和預后相關的血液生物標志物[14]，其中c-Tnl是患者心臟死亡率的獨立預測因子[15]，BNP是一種具有多種生理特性的血管活性肽[16]，對心臟結構、血流動力學的影響廣泛[17]。因此，治療前后檢測c-Tnl、BNP對于評估心肌損傷、心衰程度具有重要意義，本研究對比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SFI治療6周、9周后c-Tnl、BNP均較治療前降低，且與DZR比較無明顯差異，但鑒于樣本量有限，尚不能說明二者療效相似。

進一步從參與心肌細胞凋亡關系密切的因子入手，對其作用機理進行探究。發(fā)現(xiàn)SFI及DZR組AKT蛋白表達水平均升高，SFI組更明顯，且SFI組心肌組織GSK3β、p-GSK3β的蛋白表達水平較Model組及DZR組均增高。究其原因，與PI3K/Akt信號通路關系密切。PI3K/Akt信號通路激活導致的細胞凋亡、炎癥和自噬的誘導是阿霉素等蒽環(huán)類藥物引起的心臟損傷的原因之一[18]，課題組前期發(fā)現(xiàn)，參芪扶正注射液防治蒽環(huán)類藥物引起的心臟毒性的具體生物學功能表現(xiàn)在對RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調控、DNA轉錄、細胞外間隙及細胞連接的調控、類固醇激素受體活性的調節(jié)等多個方面[9]。Akt（蛋白激酶B）作為PI3K/Akt通路中重要的信息傳遞分子，正常情況下位于細胞漿內，當其被活化的磷酸肌醇依賴的蛋白激酶（PDK）激活后，由細胞漿轉移至細胞膜內側，被磷酸化為p-Akt，p-Akt進入細胞核，發(fā)揮對下游靶蛋白的調控。糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β），GSK3β是位于其下游的重要靶點蛋白，其是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于各種真核生物細胞中，能作用于多種底物，GSK3β在缺血性心臟病和缺血再灌注病理中具有潛在重要性[19]。PI3K/Akt 信號通路中的 p-Akt使得 GSK3β Ser9 位點磷酸化，形成p-GSK3β，則GSK3β喪失生物學活性。GSK-3β在細胞內可廣泛參與對各種細胞功能的調節(jié)，包括控制細胞增長周期及凋亡、增加線粒體膜通透性、維持細胞骨架完整性等，還可通過參與Wnt信號通路，與β連環(huán)蛋白（β-catenin）協(xié)同調控心肌肥厚相關基因的表達[20]，達到抑制心衰心室重構的作用。當PI3K/Akt 信號通路被激活，下游靶蛋白GSK3β喪失對心肌細胞的正向調節(jié)作用，出現(xiàn)心肌細胞肥大及數(shù)量減少、心肌細胞骨架結構破壞、心肌纖維化等病理改變[21]，繼而影響心臟功能的正常發(fā)揮，出現(xiàn)心力衰竭癥狀。SFI組方為黃芪、人參二味中藥，藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪中主要成分黃芪多糖可激活PI3K/Akt信號通路，促進骨髓干細胞的增殖分化，上調PI3K、AKT mRNA的表達，并增加pPI3K和p-AKT的蛋白含量[22]；人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2，Rh2）是人參的主要成分之一，Rh2通過調控PI3K/Akt信號通路促進骨髓間充質干細胞增殖，增加PI3K、p-Akt表達[23]，與本研究中部分結論一致，SFI可通過對PI3K/Akt信號通路的調控，上調Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β水平，發(fā)揮抗心衰作用。

此外，本研究中參芪扶正注射液治療后可改善模型大鼠心肌細胞的出血、水腫、炎細胞浸潤，可降低心肌細胞凋亡率。繼而從抗凋亡B淋巴瘤-2（Bcl-2）、促凋亡Bcl-2相關X蛋白（Bax）這一對凋亡相關蛋白探究其作用機理。Bcl-2與Bax作為線粒體外膜通透的效應者，被稱為細胞凋亡的門戶，在凋亡刺激下，它們在線粒體外膜(MOM)被激活并寡聚，介導其通透性，這被認為是細胞凋亡的關鍵步驟，二者共同調控細胞的“生死”[24]。Bcl-2還可通過阻止Bax釋放細胞色素C，從而抑制其對細胞的誘導凋亡作用[25]。本研究中，SFI組心肌組織Bcl-2的蛋白表達水平較Model組及DZR組升高，從而發(fā)揮抗細胞凋亡的作用，然而，其Bax蛋白表達水平亦升高，推測原因，細胞凋亡或存活，并非單純由Bcl-2或Bax決定，而是由二者共同決定，主要依賴于Bcl-2和Bax的數(shù)量比值，Bcl-2可與Bax形成二聚蛋白復合體，調控細胞存亡。當Bcl-2過剩時，Bax/Bcl-2二聚體形成，Bax無法發(fā)揮其促凋亡作用，故細胞受保護而存活；當Bax過剩時，Bax二聚體形成，細胞啟動程序性凋亡機制，同時過多的Bax可通過加速電壓依賴性離子通道促進細胞色素C從線粒體釋放，細胞色素C亦發(fā)揮誘導細胞凋亡作用，引起細胞的死亡[26]，SFI通過加速Bax/Bcl-2二聚體的形成，發(fā)揮對心肌細胞的保護作用。

從中醫(yī)角度觀之，阿霉素是臨床常用的化療藥物，具有“雙刃劍”作用。在治療中發(fā)揮攻邪療效的同時，亦對正氣造成了一定程度的損傷，因此，阿霉素等化療藥物的臨床應用中，如何保障其在祛除邪毒的同時降低其對正氣的損傷是值得探究的課題。在本研究中，重點關注的是阿霉素對心臟的影響，其攻伐正氣，尤損于心。中醫(yī)臟腑理論中，心乃君主之官，心氣受損，心陽不振，則出現(xiàn)氣虛、心悸、乏力等證，日久氣血陰陽俱虛，損及其它臟腑，出現(xiàn)一派虛證。參芪扶正注射液，顧名思義，以扶正為主要功效，恰彌補了化療藥物祛邪傷正的不足，宏觀表現(xiàn)在改善阿霉素用藥后出現(xiàn)心氣虛為主的臨床癥狀上，微觀則體現(xiàn)在作用于PI3K-Akt信號通路相關的某個或數(shù)個靶點上。

綜上所述，本研究通過從病理、蛋白等不同角度探索參芪扶正注射液對大鼠阿霉素急性心衰模型的影響，通過與Model組、DZR組對比，得出參芪扶正注射液在改善SD大鼠急性心衰上效果較佳，但樣本量有限可能對結果造成一定影響，課題組后期將擴大樣本量，進一步驗證。SFI發(fā)揮療效的作用機制可能是通過調控PI3K-Akt信號通路，上調Akt、P-akt、GSK3β及 p-GSK3β蛋白的表達，并作用于Bcl-2、Bax，發(fā)揮抗細胞凋亡作用，從而改善心肌損傷及延緩心衰，為進一步揭示參芪扶正注射液對急性心衰的影響，本研究后期將不斷完善，宏觀層面可從前后心臟射血、心輸出量、心功能等指標上比較，微觀層面可從PI3K-Akt及與之相關的其它信號通路進行深入挖掘。