從小腸炭末推進(jìn)率觀察摩法的補(bǔ)瀉效應(yīng)

李 哲，王繼紅，孫 瑞，賈文瀚

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405）

摩法是推拿中最基礎(chǔ)的手法之一，也是最早應(yīng)用于推拿治療的手法之一，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就記載，《素問(wèn)·病能論篇》：“其中手如針也，摩之切之”[1]。摩法具有理氣活血、消腫退熱、消積導(dǎo)滯、溫中健脾等作用[2]，廣泛應(yīng)用在臨床治療中，特別是其調(diào)理腸胃功能的作用。補(bǔ)瀉是中醫(yī)治療的核心概念之一，《靈樞·經(jīng)脈》曰：“盛則瀉之，虛則補(bǔ)之”、《靈樞·邪氣臟腑病形》曰：“補(bǔ)瀉反則病益篤”，均闡明了中醫(yī)治療應(yīng)遵循“據(jù)病之虛實(shí)以決補(bǔ)瀉之分”的基本原則。摩法在臨床應(yīng)用中也遵循這一補(bǔ)瀉原則，而明·周于蕃曰：“急摩為瀉，緩摩為補(bǔ)”，論述了手法緩急（頻率）與補(bǔ)瀉密切相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)前期研究已表明[4]，不同頻率的摩法存在頻率—效應(yīng)差異，每分鐘100～150次為最佳補(bǔ)益頻率段，而頻率在每分鐘200次以上則起到瀉實(shí)的作用。基于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察脾虛家兔炭末推進(jìn)率來(lái)探析上述兩個(gè)頻率段摩法的效應(yīng)關(guān)系及其實(shí)現(xiàn)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

選用成年新西蘭家兔72只[山東康大生物科技有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（魯）2016 0002]，體質(zhì)量（2.0±0.5） kg，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，兔籠貼標(biāo)簽編為1-72號(hào)，1-36號(hào)為雄兔，37-72號(hào)為雌兔。家兔置于溫度24 ℃，相對(duì)濕度50%～70%的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，從1～36號(hào)、37～72號(hào)中隨機(jī)各抽取6只組成1組，每組12只，共6組，分別為：空白組（K組）、模型組（P組）、摩法低頻組（A組，頻率每分鐘101～150次）、摩法高頻組（B組，頻率每分鐘201～250次）、抑制劑組1（I-1組，A組方法+腹腔注射ML-9）、抑制劑組2（I-2組，B組方法+腹腔注射ML-9）。K組繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)，其余進(jìn)行脾虛造模，其中A組、B組、I-1組、I-2組進(jìn)行手法治療干預(yù)。

1.2 動(dòng)物造模

實(shí)驗(yàn)采用灌飼小承氣湯和饑飽失常法造脾虛家兔模型[5-6]。1）將190 g大黃放入900 mL水中浸泡20 min，大火煎至沸騰后改小火再煎10 min，液體量補(bǔ)至1 140 mL，用紗布過(guò)濾。2）將190 g番瀉葉加入1 140 mL沸水中攪拌浸泡5 min，用紗布過(guò)濾。3）將大黃液和番瀉葉液各1 140 mL混合，加入152 g芒硝溶化，湯液最終濃度為12 mL含大黃4 g、番瀉葉2 g、芒硝0.8 g（大黃5：芒硝1）。連續(xù)灌胃7 d，根據(jù)家兔體質(zhì)量，灌胃量為24 mL·kg-1；同時(shí)喂飼量減半，自由飲水，造模同時(shí)記錄家兔體質(zhì)量、進(jìn)食量變化，觀察臨床表現(xiàn)及大便情況，家兔便溏后改灌胃量為18 mL·kg-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器試劑及手法頻率、壓力值校對(duì)

1）實(shí)驗(yàn)主要儀器：實(shí)驗(yàn)采用上海邑成測(cè)試設(shè)備有限公司生產(chǎn)的調(diào)制器和校對(duì)器、動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)采集器、Tekscan研制的MFF多點(diǎn)薄膜壓力測(cè)試系統(tǒng)壓力傳感器、疆越科技研制730C型人工智能機(jī)械臂。2）實(shí)驗(yàn)主要試劑：ML-9、含5%炭末和2%CMC-Na的炭末混懸液。3）壓力值校對(duì)：本次實(shí)驗(yàn)選取10名測(cè)試者，每名測(cè)試10次，選取10次中手法壓力曲線(xiàn)均值較接近的5組為樣本，根據(jù)以上方法求得平均值，再將10名操作者的平均值作為機(jī)械臂操作的壓力標(biāo)準(zhǔn)操作值。將數(shù)據(jù)采集器連接電腦，調(diào)制器連接采集器，傳感器連接調(diào)制器，將傳感器置于家兔腹部進(jìn)行手法操作，頻率控制在低頻每分鐘150次、高頻每分鐘200次，同等壓力值下操作1 min并觀察電腦壓力曲線(xiàn)變化，建立力—電壓之間的擬合函數(shù)模型y=a+bx，并通過(guò)校對(duì)器得出曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)力量值和頻率值。將本次實(shí)驗(yàn)全部治療組手法壓力均值、實(shí)際頻率及整個(gè)過(guò)程的平均頻率都提前在電腦Dobot Studio系統(tǒng)上設(shè)置，采用智能機(jī)械臂模擬摩法操作，采用MFF多點(diǎn)薄膜壓力傳感器對(duì)手法操作過(guò)程的幅度、壓力和頻率進(jìn)行監(jiān)控，以保證機(jī)械臂模擬摩法的頻率和力度嚴(yán)格控制在標(biāo)準(zhǔn)值上下不超過(guò)5%。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 穴位定位 采用比較解剖學(xué)和模擬人體經(jīng)穴定位法結(jié)合進(jìn)行新西蘭家兔穴位定位[7]。中脘的腹中線(xiàn)上，臍與劍狀軟骨連線(xiàn)中點(diǎn)處；天樞的臍旁開(kāi)3 cm處。

1.4.2 手法操作 家兔仰臥束縛在操作臺(tái)上，2名助手握持住動(dòng)物前后肢，剃除家兔腹部毛發(fā)，充分暴露穴位，并用標(biāo)記筆標(biāo)識(shí)穴位，將傳感器用醫(yī)用膠布固定在穴位上。在電腦上打開(kāi)Dobot Studio軟件輸入機(jī)械臂力值參數(shù)，使機(jī)械臂遠(yuǎn)端人體拇指模型與家兔腹部皮膚表面垂直，于中脘、天樞（雙）上行摩法操作，操作時(shí)觀察電腦顯示的壓力曲線(xiàn)變化以保證手法力量與波形穩(wěn)定。每穴操作5 min，共15 min，每日1次，連續(xù)10 d。K組、P組不進(jìn)行手法干預(yù)，A組、I-1組使用頻率每分鐘150次進(jìn)行手法操作，B組、I-2組使用每分鐘200次進(jìn)行手法操作，I-1組、I-2組每次手法干預(yù)前進(jìn)行腹腔注射ML-9（2 mg·kg-1）。

1.5 取材階段

所有新西蘭家兔炭末灌胃前24 h予禁食不禁水，24 h后用含5%炭末和2%CMC-Na的炭末混懸液2.5 mL灌胃，30 min后將家兔麻醉、采血、處死、解剖，測(cè)量小腸總長(zhǎng)度、炭末前沿長(zhǎng)度，取胃稱(chēng)胃全重，將胃體剪開(kāi)（沿胃大彎），將胃內(nèi)殘留物洗凈，濾紙拭干稱(chēng)胃凈重。

1.6 觀察指標(biāo)

1）脾虛觀察指標(biāo)：記錄所有新西蘭家兔每日的精神狀態(tài)、毛色、體質(zhì)量、飲食、二便等情況。2）小腸推進(jìn)率：在最后1次干預(yù)治療后照前法繼續(xù)飼養(yǎng)，第2天晨起所有家兔禁食不禁水24 h，第3天早晨用含5%炭末和2%CMC-Na的炭末混懸液2.5 mL灌胃，30 min后將家兔麻醉、腹主動(dòng)脈采血法采血，處死家兔，剖開(kāi)腹腔，將幽門(mén)至回盲部的腸管取出并測(cè)量其長(zhǎng)度，此即小腸的總長(zhǎng)度，然后測(cè)出炭末推進(jìn)長(zhǎng)度，即幽門(mén)部到炭末前沿的長(zhǎng)度，計(jì)算小腸推進(jìn)率，計(jì)算公式為：小腸推進(jìn)率（%）= 炭末前沿的長(zhǎng)度（cm）÷小腸總長(zhǎng)度（cm）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，統(tǒng)計(jì)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料選擇Bonferroni法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 脾虛觀察指標(biāo)

造模前各組精神良好，動(dòng)作敏捷，毛發(fā)光滑潤(rùn)澤，飲食正常，大便成形；造模后家兔精神萎靡，反應(yīng)遲鈍甚至膽怯易驚，毛發(fā)枯燥無(wú)光澤，體質(zhì)量減輕，進(jìn)食減少，大便或干硬或稀溏，難以成形；通過(guò)10 d的摩法干預(yù)治療后A組、I-1組、I-2組家兔反應(yīng)較前靈敏，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤，體質(zhì)量、飲食較前好轉(zhuǎn)，大便成形。

2.2 摩法對(duì)脾虛家兔小腸推進(jìn)率的影響

各組小腸總長(zhǎng)度、炭末前沿長(zhǎng)度如表1所示。摩法對(duì)各組小腸推進(jìn)率的影響如表2、圖1所示，其中：1）K組、A組、I-1組、I-2組小腸推進(jìn)率均優(yōu)于P組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2）K組、A組、I-1組、I-2組兩兩之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；3）B組與K組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），與P組、A組、I-1組、I-2組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且B組小腸推進(jìn)率高于P組但低于K組、A組、I-1組、I-2組；4）I-2組與P組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），B組與P組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖1 各組小腸推進(jìn)率組間比較

表1 各組小腸總長(zhǎng)度、炭末前沿長(zhǎng)度 cm

表2 摩法對(duì)各組小腸推進(jìn)率的影響

3 討論

功能性消化不良（Functional Dyspepsia，F(xiàn)D）是指存在上腹痛、餐后飽脹不適、早飽感、食欲不振、噯氣等癥狀的功能性腸胃疾病[8]。FD在中醫(yī)屬“痞滿(mǎn)”“胃脘痛”，其病機(jī)為脾虛氣滯、胃失和降[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)苦寒瀉下饑飽失常法對(duì)成年新西蘭家兔進(jìn)行造模，造模后家兔出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍甚至膽怯易驚，毛發(fā)枯燥無(wú)光澤，體質(zhì)量減輕，進(jìn)食減少，大便或干硬或稀溏，難以成形等癥狀，且K組、A組、I-1組、I-2組小腸推進(jìn)率均優(yōu)于P組，提示造模成功。

近年來(lái)已有相關(guān)研究表明[10-18]，不同頻率的手法臨床效應(yīng)不同，對(duì)于FD家兔最適宜頻率段為每分鐘101～150次，在每分鐘201～250次則治療效果不佳。本實(shí)驗(yàn)上述兩頻率段進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果顯示K組、A組、I-1組兩兩之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；B組與K組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），與P組、A組、I-1組、I-2組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且B組小腸推進(jìn)率高于P組但低于K組、A組、I-1組、I-2組，表明每分鐘101～150次頻率摩法能促進(jìn)脾虛家兔消化功能恢復(fù)；而每分鐘201～250次頻率摩法不能使脾虛家兔恢復(fù)正常水平，且部分呈現(xiàn)損害效應(yīng)。臨床研究表明[19]，較低頻率手法具有補(bǔ)益作用，較高頻率手法具有瀉實(shí)作用，符合“急摩為瀉，緩摩為補(bǔ)”的中醫(yī)理論，本實(shí)驗(yàn)B組使用高頻率摩法對(duì)脾虛家兔進(jìn)行手法干預(yù)，即虛者用了瀉的手法，故家兔治療無(wú)法起效，甚至有惡化效應(yīng)，闡明了“補(bǔ)瀉反則病益篤”的中醫(yī)治療原則。

推拿對(duì)于改善脾虛型FD家兔在臨床和實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)[20]。FD的病理機(jī)制主要是腸胃運(yùn)動(dòng)功能障礙，胃腸動(dòng)力源自胃腸道平滑肌收縮，目前研究證實(shí)肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）通路與控制消化道平滑肌的收縮與舒張密切相關(guān)[21]，其他已知的信號(hào)通路還包括：PKC、c-kit/SCF及PAR-2介導(dǎo)的信號(hào)通路[22-23]、NF-κB炎癥信號(hào)通路等。MLCK通路發(fā)揮作用主要是通過(guò)平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cell，SMC）胞漿中的游離Ca2+與鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）結(jié)合，形成Ca2+-CaM復(fù)合物，Ca2+-CaM激活MLCK催化肌球蛋白（Myosin），肌球蛋白磷酸化激活A(yù)TP酶，該酶水解ATP產(chǎn)生的能量使肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白相互作用，引發(fā)肌肉的收縮，故MLCK信號(hào)通路中包含了Ca2+、CaM、MLCK，以及肌球蛋白、ATP酶等多個(gè)靶點(diǎn)[24]。本實(shí)驗(yàn)基于MLCK信號(hào)通路探討摩法對(duì)脾虛家兔胃腸功能的影響，采用智能機(jī)械臂對(duì)造模家兔進(jìn)行摩法干預(yù)治療，治療后家兔反應(yīng)較前靈敏，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤，體質(zhì)量、飲食較前好轉(zhuǎn)，大便成形。且K組、A組、I-1組、I-2組兩兩之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），表明A組、I-1組、I-2組均起到治療效果，脾虛家兔恢復(fù)至正常水平。ML-9是MLCK的特異性抑制劑，通過(guò)使用ML-9阻斷MLCK信號(hào)通路的表達(dá)后，I-1組、I-2組仍能起到治療作用，摩法仍能明顯影響脾虛家兔的胃腸傳輸功能，表明其產(chǎn)生效應(yīng)的機(jī)制可能是通過(guò)其他通路和靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)證明頻率在每分鐘101～150次的摩法對(duì)脾虛家兔癥狀有改善作用，能促進(jìn)其胃腸蠕動(dòng)功能，而超過(guò)每分鐘200次的摩法對(duì)脾虛家兔治療效果不佳，甚至有損害效應(yīng)；摩法治療的作用效應(yīng)可通過(guò)MLCK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，也可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)靶點(diǎn)、多個(gè)通路發(fā)揮作用，該結(jié)果可為下一步相關(guān)分子蛋白信號(hào)通路研究提供參考。