抗球蟲藥氫溴酸常山酮研究進展

馮俊吾，溫 芳，張 松，趙晶晶，李宏全

（1.山西省畜牧產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗監(jiān)測中心，山西太原 030001；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；3.山西省分析科學研究院，山西 太原 030006；4.山西農(nóng)業(yè)大學，山西 太原 030031）

球蟲（Coccidia）是一種單細胞寄生孢子蟲，群 體呈卵形或圓棒形，一般寄生在脊椎動物和無脊椎動物體內(nèi)，主要在腸細胞中，可引發(fā)球蟲?。–occidiosis）。在獸醫(yī)學上最重要的球蟲均屬于艾美爾球蟲科，禽、兔、牛、羊、狗、貓等均可作為艾美爾球蟲的宿主，分布于世界各地[1]。除了斯氏艾美爾球蟲（Eimeria stiedai）寄生在家兔肝臟內(nèi)[2]，截形艾美爾球蟲（Eimeria truncata）寄生在鵝腎臟[3]等少數(shù)例外，球蟲大多寄生在宿主的腸道上皮細胞，可導致腸組織損傷，降低采食量和飼料養(yǎng)分吸收率，引起脫水和貧血等癥狀[1]。

造成國內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)損失最為嚴重的是雞和兔的球蟲感染。雞球蟲病發(fā)病率高，若不采取有效措施，死亡率可達到80%。兔球蟲病感染率也相當高，1~3月齡的兔最易感且死亡率高；成年兔癥狀輕微，多為帶蟲者，是重要的傳染源[2,4]。雞感染蟲種主要有9種，常見的有7種，感染強度依次為柔嫩、早熟、堆型、巨型、和緩、毒害、布氏艾美耳球蟲，致病性最強的為柔嫩艾美爾球蟲。我國東北、華北地區(qū)主要感染蟲種為柔嫩、巨型和堆型艾美耳球蟲；華中地區(qū)主要感染蟲種為柔嫩、毒害、堆型和巨型艾美耳球蟲；華東地區(qū)主要感染蟲種為柔嫩、毒害、堆型、巨型與和緩艾美耳球蟲；華南、西南和西北地區(qū)7種球蟲均可見[5]。兔感染蟲種主要有16種，常見的有8種，最常見且致病性最強的是斯氏艾美爾球蟲，可導致兔體肝臟損傷，代謝、消化功能紊亂，體內(nèi)毒素聚積并出現(xiàn)生長遲緩、消瘦腹瀉甚至死亡現(xiàn)象，全國各地出現(xiàn)頻率達100%，平均感染率約24%[2,4]。

目前，我國對球蟲病以藥物防治[5-6]為主，20世紀40年代磺胺喹惡啉面世，用于雞球蟲病的預防與治療，此后全球相繼上市了40余種抗球蟲藥物，包括聚醚類離子載體抗生素（Polyether ionophoric antibiotics），化學合成藥及天然產(chǎn)物藥。其中，聚醚類離子載體抗生素[7-8]在我國使用最多，包括莫能菌素、甲基鹽霉素、拉沙洛菌素、馬杜霉素等，但大多數(shù)毒性較強，逐漸被限制使用?；瘜W合成藥主要有氯羥吡啶、二硝托胺、尼卡巴嗪、磺胺類、地克珠利、妥曲珠利等，但也存在很多問題，包括易產(chǎn)生耐藥性，半衰期短，代謝物易造成環(huán)境污染，畜產(chǎn)品殘留[9]等。近年來，也出現(xiàn)不少中草藥制劑深受養(yǎng)殖戶青睞，該類制劑或自身表現(xiàn)出較優(yōu)的抗球蟲效果[10-12]，或可與其他抗球蟲藥配伍使用增強藥效[13-14]及動物機體免疫力[12-13,15]，在養(yǎng)殖業(yè)中應用日漸廣泛。焦宇洲等[16]最新研究表明，益生菌可競爭性抑制病原菌定植以阻止繼發(fā)感染，刺激宿主分泌抗菌肽；黏蛋白和緊密連接蛋白等阻止球蟲入侵，還可激活免疫反應以增強機體對球蟲的抵抗力。這些藥物的廣泛應用，使得球蟲抗藥性問題日益突出，用藥成本越來越高。因此，我國乃至世界迫切需要成本低、能在臨床上大規(guī)模使用、作用機理獨特的抗球蟲藥。

氫溴酸常山酮（Halofuginone hydrobromide）為化學合成的喹唑啉酮類抗球蟲藥，化學名為DL-反式-7-溴-6-氯-3-[3-(3-羥基-2-哌啶基)-2-氧代丙基]-4(3H)-喹唑啉酮氫溴酸鹽，分子式為C16H17BrClN3O3·HBr，其結構如圖1所示。氫溴酸常山酮主要優(yōu)點是毒副作用小，安全范圍大，肉品和內(nèi)臟中幾乎沒有藥物殘留[17]。

由于氫溴酸常山酮抗球蟲效果好、廣譜、停藥后極少復發(fā)，因此，在美國的抗球蟲藥物市場上銷售量位居前列，約占市場份額的5%~10%。氫溴酸常山酮還能夠特異性地抑制纖維細胞合成Ⅰ型膠原纖維，是一種新型的Ⅰ型膠原合成抑制劑[18]，可預防組織纖維化，對傷口愈合和瘢痕形成也有抑制作用[19-20]。最近研究還發(fā)現(xiàn)，氫溴酸常山酮在抗腫瘤臨床研究中表現(xiàn)尤為突出，對肝癌、肉瘤、腦癌、膀胱癌、乳腺癌和前列腺癌等癌癥具有顯著的抑制作用[21-24]。然而，由于其合成工藝復雜、產(chǎn)率低、成本高、三廢處理難度大，國內(nèi)很多年來沒有實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，且進口藥物價格高，使其應用受到一定限制[25]。

1 合成工藝研究現(xiàn)狀

氫溴酸常山酮從結構上看可分為4(3H)-喹唑啉酮環(huán)與哌啶環(huán)2個部分，因此，其合成關鍵在于這2個中間體（圖2）的合成，國內(nèi)外報道的合成方法中二者對接方法基本一致，因此，本文就這2個中間體的合成進行簡要匯總。

4（3H）-喹唑啉酮環(huán)（中間體1）的合成較為簡單，主要可分為2條工藝路線：第1條是以間溴苯胺為起始原料，依次發(fā)生Sandmeyer反應、縮合、分離純化、氯化、氧化、縮合等而得，路線如圖3所示，這也是4（3H）-喹唑啉酮環(huán)最經(jīng)典的合成方法[26]；第2條是以間氯甲苯為原料，經(jīng)過溴化、氧化、氨解、環(huán)合等而得，路線如圖4所示[27-28]。還有其他很多學者報道了不同的路線，但大多是對這2條合成路線進行了反應條件的調(diào)整或是從更初級的原料開始做起。

哌啶環(huán)（中間體2）的合成方法較為復雜。早期均選擇吡啶類化合物為起始原料，代表方法有2種：第1種是以乙酰呋喃為起始原料，與氨水在高溫高壓下反應生成2-甲基-3-羥基吡啶，再經(jīng)甲基化、加成、還原和氧化而得（圖5）[26]；第2種是以3-羥基吡啶為原料，依次經(jīng)Mannich反應、甲基化、還原、氧化、Cope消除、氧化、縮合、還原等反應而得（圖6）[29]。還有一些其他合成方法的報道，但大多是對這2條合成路線進行了反應條件的調(diào)整，這些路線均涉及到吡啶環(huán)的還原，反應條件都比較苛刻，后處理工序繁瑣，環(huán)保壓力較大。

后來發(fā)現(xiàn)了多種2-丙酮基-3-甲氧基哌啶或類似物的不對稱合成方法，主要有：KOBAYASHI等[30]以D-谷氨酸為原料經(jīng)多步反應制得5-羥甲基-2-四氫呋喃酮，再經(jīng)多次保護基取代、還原、Swerm氧化、Mannich反應、脫保護、環(huán)合等反應而得（圖7）；LIU等[31]以L-谷氨酸-5-芐酯為原料在酸性亞硝酸鈉水溶液中脫除氨基后，依次經(jīng)酯化、TBS保護、脫芐、還原脫芐、磺?；?、疊氮化、氫化還原、環(huán)合、仲氮保護、硼氫化、氧化、酯化及取代等反應制得（圖8）；ASHOORZADEH等[32]以手性酸內(nèi)酯為原料，經(jīng)過酯交換開環(huán)、芐基保護、還原得到2-芐氧基戊二醇，再經(jīng)過二苯磺酰化保護、環(huán)合、氧化、加成，開環(huán)、氧化及脫保護等反應而得（圖9）；EMMANUVEL等[33]以l，5-己二烯-3-醇為原料，經(jīng)JohnsoN-Claisen重排、氧化、酯交換、磺?；B氮基取代、還原得3-羥基-2-烯丙基哌啶，再經(jīng)保護基取代、溴代、脫保護基等制得（圖10）；SUKEMOTO等[34]通過共軛加成的方法獲得了哌啶環(huán)骨架，以四氫吡啶為原料，經(jīng)仲氮保護和不對稱雙羥化，制得N-Cbz保護的2,3-二羥基哌啶，再經(jīng)Pinacol重排和Wittig反應制得哌啶環(huán)的開環(huán)類似物，再在三氟化硼-乙醚的催化下，經(jīng)共軛加成制得反式的哌啶環(huán)中間體（圖11）。

2017年，王亮[35]優(yōu)化了傳統(tǒng)方法的反應條件，以3-羥基吡啶為原料，通過成鹽、烯丙基化醚化、還原、重排、MTO環(huán)氧化等反應生成關鍵的哌啶環(huán)中間體，然后經(jīng)過與喹唑啉酮的縮合接片、氧化、脫保護、異構化生成目標產(chǎn)物常山酮（圖12），取得較好收率，但仍無法解決反應條件苛刻、成本昂貴、污染大等問題。

2015年，我國在氫溴酸常山酮的合成工藝研究上取得突破，這一方法更具有成本優(yōu)勢，并且推動了氫溴酸常山酮產(chǎn)業(yè)化的腳步。張軍忍等[25,36]首先優(yōu)化經(jīng)典方法合成中間體1，此后選擇直線式合成制得最終產(chǎn)品（圖13）。相比會聚式合成方法，可較大程度減少官能團的轉化反應，從而在總體上縮短了反應步驟，所采用的反應條件都較溫和，生產(chǎn)操作安全度較高。

2 抗球蟲藥效及機制研究概述

2012年，張德福[37]對14日齡雛雞人工感染柔嫩艾美耳球蟲，然后采用1.5、3.0、6.0 mg/kg等3種濃度的氫溴酸常山酮進行治療，結果表明，中低劑量下，感染雛雞的體質(zhì)量顯著增加，卵囊排出顯著降低。接著，對人工感染柔嫩艾美耳球蟲后0、1、2、3、4、5、6 d的雛雞用氫溴酸常山酮進行治療，結果表明，感染當天或者感染后2 d之內(nèi)用氫溴酸常山酮治療是完全有效的；感染2 d后再用氫溴酸常山酮治療僅起到部分保護或無保護作用。盲腸組織切片觀察表明，氫溴酸常山酮可以抑制柔嫩艾美耳球蟲子孢子的入侵，氫溴酸常山酮治療組的第2代裂殖體表現(xiàn)出空泡化和降解。因此，氫溴酸常山酮主要作用于球蟲生活史的早期，可阻止其入侵宿主細胞，然后通過抑制裂殖體分裂為裂殖子，使裂殖體空泡化，達到破壞其發(fā)育的作用效果，導致裂殖體和裂殖子的發(fā)育受到抑制，發(fā)育速度減慢，從而被機體的免疫系統(tǒng)清除。此外，還對新鮮未孢子化或部分孢子化的柔嫩艾美耳球蟲卵囊給予氫溴酸常山酮處理后再繼續(xù)進行孢子化孵育，觀察了卵囊外觀形態(tài)和超微結構的變化及球蟲關鍵基因的表達情況，初步研究了氫溴酸常山酮在體外條件下對孢子化的影響以及子孢子經(jīng)體外處理后對細胞感染能力的影響，結果表明，氫溴酸常山酮可以抑制孢子生殖，使卵囊孢子化率降低，并且藥物處理后的卵囊脫孢子囊能力下降，卵囊表面形態(tài)和細胞質(zhì)等超微結構等都發(fā)生了明顯變化，而且子孢子與氫溴酸常山酮體外條件下共孵育后對細胞的感染能力下降。

2000年，美國食品藥品管理局（FDA）通過一系列臨床試驗證明，氫溴酸常山酮對雞的柔嫩、毒害、堆型、巨型和布氏艾美耳球蟲均有一定作用；飼料中添加3 mg/kg的氫溴酸常山酮能有效地降低由球蟲引起的死亡率、腸道病變記分和糞便記分并提高飼料報酬[38]。2003年，歐洲食品安全局（European Food Safety Authority,EFSA）提出，氫溴酸常山酮對第1代裂殖體殺滅作用最強，對柔嫩和巨型2類艾美耳球蟲有良好的殺滅作用，對堆型艾美耳球蟲則有抑制作用[39]。早在1981年，MCQUISTION等[40]就研究了常山酮球蟲感染作用特點，結果顯示，感染后的第1天用藥，殺蟲效果顯著；感染后第3天開始用藥，殺蟲也有顯著效果；感染后第4~7天用藥，則部分有效，這揭示了常山酮對球蟲生活周期的作用范圍較大，因而在藥效上具有絕對優(yōu)勢。1994年，孫浴東等[41]進行了氫溴酸常山酮、氯羥吡啶和氯苯胍3種抗球蟲藥的療效對比試驗，結果表明，氫溴酸常山酮是一種廣譜、高效的抗球蟲藥；從雞的死亡率、糞便鏡檢、平均日增質(zhì)量及料肉比等數(shù)據(jù)來看，防治雞柔嫩艾美耳球蟲氫溴酸常山酮效果最好，氯羥吡啶和氯苯胍次之。2014年，程棟等[42]對磺胺喹惡琳、氨丙啉和氫溴酸常山酮3種藥物進行了治療效果比較，結果表明，氫溴酸常山酮預防球蟲感染性能優(yōu)于磺胺喹惡琳和氨丙啉，且可在一定程度上改善雛雞的生產(chǎn)性能。2000年，張國安等[43]對妥曲珠利、馬杜霉素、二硝托胺、氨丙啉、拉沙菌素和氫溴酸常山酮等幾種藥物進行了敏感性試驗，結果表明，各藥物的抗球蟲指數(shù)（ACI）排序分別為：氫溴酸常山酮>妥曲珠利>馬杜霉素>二硝托胺、氨丙啉>拉沙菌素。2016年，洪芬等[44]進行了常山酮、尼卡巴嗪、氯丙啉、二甲硫銨單服與混服治療球蟲病試驗，結果表明，常山酮單服治愈率為97.28%，高于其他單服；混服治愈率可提高至97.57%~99.07%。綜上所述，目前國內(nèi)外學者對氫溴酸常山酮的抗球蟲作用機理的研究尚處于初步階段，僅能明確該藥物可作用于球蟲繁殖的3個生理階段，即子孢子、第1代裂殖體和第2代裂殖體階段。現(xiàn)階段，全球范圍內(nèi)仍需投入更多精力致力于更深入的抗球蟲機制研究，為控制耐藥和研制新藥提供思路與理論依據(jù)。

3 安全性研究進展

陳玲等[45]在2012年考察了常山酮對肉雞的安全隱患，分別用1.5倍推薦劑量、2倍推薦劑量和3倍推薦劑量（分別為4.5、6.0、9.0 mg/kg）的常山酮對肉雞進行安全性試驗，結果表明，當劑量達到1.5倍推薦劑量時，肉雞增質(zhì)量開始下降；達到2倍推薦劑量時，飼料效率開始下降；達到3倍推薦劑量時，肉雞出現(xiàn)拒食，但未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

2019年，宋昕昊等[46]也考查了氫溴酸常山酮在肉雞上應用的安全性，3倍推薦劑量（9 mg/kg）可顯著降低體質(zhì)量增長和采食量，血液化學指標和血液學指標個別有顯著差異，但在正常參考范圍內(nèi)，剖檢未見各組織器官有明顯異常，組織學檢查也未見有明顯病理變化，推薦劑量下氫溴酸常山酮對肉雞是安全的，但是當飼料中的藥物濃度超過3倍推薦劑量時會嚴重影響肉雞的采食量和日增質(zhì)量。

MULDER等[47]于2005年將常山酮以3 mg/kg的濃度添加在飼料里，連喂14 d，研究常山酮在雞蛋中的殘留情況，結果顯示，給藥期間雞蛋中常山酮的濃度可達450μg/kg，給藥結束后濃度急劇下降，12 d后殘留濃度降至2μg/kg。諸多報道都證明，常山酮在雞體內(nèi)消除速度快，不易殘留。

2020年，歐洲食品安全局（EFSA）關于抗球蟲藥氫溴酸常山酮（速丹）進行了補充評估：遺傳毒性試驗的結果表明，氫溴酸常山酮能對細菌產(chǎn)生誘變作用，在哺乳動物體外細胞試驗中，未觀察到基因突變和和染色體變異等任何遺傳毒性；在體內(nèi)遺傳毒性試驗中，機體骨髓細胞亦沒有任何變異，表明氫溴酸常山酮無明顯的致突變作用[48]。

4 應用前景

目前，國內(nèi)市場上大多數(shù)抗球蟲藥存在耐藥性問題，在使用過程中只能采取被動的輪換或穿梭用藥，對球蟲病的防治效果有限。氫溴酸常山酮化學結構不同于其他抗球蟲藥物，且與現(xiàn)有的抗球蟲藥無交叉耐藥性[17]。近年來，山西美西林藥業(yè)有限公司、山西農(nóng)業(yè)大學和山西省畜牧產(chǎn)品質(zhì)量檢驗監(jiān)測中心的技術人員對氫溴酸常山酮的合成工藝進行了研究，設計出一條適合工業(yè)化生產(chǎn)的路線，具有工藝收率高、副反應少、對環(huán)境污染小、產(chǎn)品純度高、穩(wěn)定性好、質(zhì)量可控的優(yōu)點。2020年11月取得國家二類新獸藥證書，2021年1月順利通過獸藥GMP認證，成為國內(nèi)氫溴酸常山酮獸用原料，未來具有廣闊應用前景。