響應(yīng)面法優(yōu)化大白樁菇液體發(fā)酵工藝

王志偉，郭 尚，侯雷平，李艷婷

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西功能食品研究院，山西 太原 030031）

大白樁菇（Leucopaxillusgiganteus）又名大青蘑、雷蘑、青腿子或竹菇[1]，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌目（Agricales）白蘑科（Tricholomataceae）白樁菇屬（Leucopaxillus）[2]。大白樁菇不僅味道鮮美、營養(yǎng)價(jià)值豐富[3]，還可治小兒麻疹、煩燥不安等[4]。此外，研究大白樁菇多糖、蛋白質(zhì)、杯傘素等生物活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其具有清除過量自由基、提高免疫功能、抗腫瘤活性等生物學(xué)功能[5-6]。

大白樁菇是臺(tái)蘑的代表種類之一[7]，近年來，由于當(dāng)?shù)鼐用竦倪^度采摘，其產(chǎn)量面臨著逐年縮減的威脅；另外，由于大白樁菇生長周期長、馴化難度大，目前尚未實(shí)現(xiàn)人工栽培。王謙等[8]研究發(fā)現(xiàn)，大白樁菇菌絲生長的最適溫度為25~26℃，最佳pH值為5~6，最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為尿素。利用液體發(fā)酵獲得蘑菇菌絲體是一種簡便、快捷的方法，其具有發(fā)酵周期短、方法簡單、易于控制、成本低等特點(diǎn)[9]。王永斌等[10]對(duì)大白樁菇液體發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，大白樁菇最佳深層發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間9 d，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min。有研究表明，液體培養(yǎng)得到的菌絲體和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)得到的蘑菇子實(shí)體（菌核），在化學(xué)組成和生理功能上相似[11]。這些研究為大白樁菇的開發(fā)利用提供了有價(jià)值的參考，但對(duì)其培養(yǎng)過程中不同培養(yǎng)條件下活性物質(zhì)積累的研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)通過對(duì)大白樁菇液體發(fā)酵過程中不同碳源、氮源、碳氮比、p H影響其菌絲體干質(zhì)量及活性物質(zhì)的積累研究，以期為大白樁菇的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大白樁菇菌株由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院提供。

1.2 儀器設(shè)備

SM 830立式壓力蒸汽滅菌器（重慶雅馬拓科技有限公司）；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)（上海茸研儀器有限公司）；GXZ-1000A光照培養(yǎng)箱（寧波樂電儀器制造有限公司）；0.000 1 g電子天平（瑞士梅特勒托利多）；移液槍（德國艾本德公司）；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化與液體菌種的制備 將大白樁菇菌種接種于固體培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，維生素B110 mg/L）在24℃下暗培養(yǎng)20 d。采用打孔器挑取直徑為0.5 cm已培養(yǎng)好的菌種置于液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方：葡萄糖30 g/L，蛋白胨6 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，維生素B110 g/L）中，培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，避光培養(yǎng)15 d，作為菌種備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 利用5種碳源（葡萄糖（C1）、海藻糖（C2）、蔗糖（C3）、麥芽糖（C4）、乳糖（C5））代替液體培養(yǎng)基中的碳源，配制培養(yǎng)基。按5%的接種量接入液體菌種，24℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)10 d，終止培養(yǎng)。用尼龍布（0.10 mm）分離菌絲體和發(fā)酵液，菌絲體通過蒸餾水沖洗3次，60℃烘干至恒質(zhì)量，稱量記錄；發(fā)酵液置于4℃冰箱中保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。以不添加碳源的培養(yǎng)基為空白對(duì)照（C6），每種配方設(shè)3個(gè)重復(fù)。

利用5種氮源（蛋白胨（N1）、牛肉浸膏（N2）、酵母粉（N 3）、硫酸銨（N4）、麩皮（N5））代替液體培養(yǎng)基中的氮源，配制培養(yǎng)基，以不添加氮源的培養(yǎng)基為空白對(duì)照（N6），每種配方設(shè)3個(gè)重復(fù)。

以葡萄糖（含碳量40%）為碳源、蛋白胨（含氮量16%）為氮源，在其他成分不變的條件下，通過調(diào)整蛋白胨的含量使其碳氮比分別為2.5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，每種配方設(shè)3個(gè)重復(fù)。

以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源，在其他成分不變的條件下，通過調(diào)整培養(yǎng)基的pH值，使其pH值分別為4、5、6、7、8、9，每種配方設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 菌絲體提取液的制備 將干燥后的菌絲體研磨至0.25 mm，精確稱質(zhì)量0.5 g，加入20倍體積的水，設(shè)置溫度80℃，在超聲波中提取1 h，5 000 r/min離心10 min，取上清液，即為水提液，重復(fù)提取，合并2次的水提液。沉淀物加入20倍體積的無水乙醇，設(shè)置溫度60℃，在超聲波中提取1 h，5 000 r/min離心10 min，取上清液，即為醇提液，重復(fù)提取，合并2次的醇提液。

1.3.4 成分測定 總糖含量采用苯酚-硫酸法測定；還原糖含量采用DNS法測定[12]；總黃酮含量采用AlCl3-NaNO2法測定[13]；總酚含量采用福林酚法測定[14]。

粗多糖含量=總糖含量－還原糖含量 （1）

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化液體培養(yǎng)試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選取碳源（海藻糖）、氮源（牛肉浸膏）、p H這3個(gè)因素為考察對(duì)象，以菌絲體干質(zhì)量為響應(yīng)值，利用Design-expert 8.0軟件設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 The test design of response sur face

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013軟件和SPSS Statistics 22統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析；采用Design-expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源對(duì)大白樁菇菌絲體干質(zhì)量及活性成分含量的影響 由圖1可知，液體發(fā)酵過程中，不同的碳源對(duì)大白樁菇菌絲體干質(zhì)量及活性成分的含量均有明顯的影響。與對(duì)照相比，5種碳源均能提高大白樁菇的菌絲體干質(zhì)量，其中，海藻糖是菌絲體干質(zhì)量積累的最佳碳源，菌絲體干質(zhì)量為5.17 g/L，其次為葡萄糖和蔗糖。葡萄糖有利于菌絲體多酚物質(zhì)的積累，水提物中多酚含量為8.15 mg/g，醇提物中多酚含量為0.92 mg/g，其次為蔗糖和麥芽糖，這與BARROS等[15]的研究結(jié)果一致；以葡萄糖為碳源的發(fā)酵液中多酚含量最高，為1.10 mg/mL，其次為麥芽糖，二者間無顯著性差異。蔗糖有利于菌絲體黃酮物質(zhì)的積累，水提和醇提物中黃酮總含量為4.76 mg/g，以蔗糖為碳源的發(fā)酵液中黃酮含量最高，為0.83 mg/mL，其次為海藻糖。以蔗糖為碳源的菌絲體中粗多糖的含量最高，為232.24 mg/g，其次是海藻糖，為217.90 mg/g。碳源對(duì)大白樁菇菌絲體的積累及活性成分的含量影響不一，因此綜合各指標(biāo)可推斷，液體培養(yǎng)中海藻糖是菌絲體干質(zhì)量積累的最佳碳源，葡萄糖是菌絲體多酚積累的最佳碳源，蔗糖是菌絲體黃酮和粗多糖積累的最佳碳源。

2.1.2 氮源對(duì)大白樁菇菌絲體干質(zhì)量及活性成分含量的影響 由圖2可知，液體發(fā)酵過程中，不同的氮源對(duì)大白樁菇菌絲體干質(zhì)量及活性成分的含量均有明顯的影響。與對(duì)照相比，5種氮源均能提高大白樁菇的菌絲體干質(zhì)量，其中，牛肉浸膏和硫酸銨能顯著提高大白樁菇菌絲體干質(zhì)量，二者間無顯著性差異，其次為蛋白胨。蛋白胨有利于菌絲體多酚物質(zhì)的積累，水提物中多酚含量為9.24 mg/g，醇提物中多酚含量為2.22 mg/g。以硫酸銨為氮源的發(fā)酵液中多酚含量最高，為1.57 mg/mL，其次為酵母粉，多酚含量為1.47 mg/mL。蛋白胨有利于菌絲體黃酮物質(zhì)的積累，水提和醇提物中黃酮總含量為4.71 mg/g，以酵母粉為氮源的發(fā)酵液中黃酮含量最高，為1.09 mg/mL，其次為硫酸銨，黃酮含量為1.04 mg/mL。以蛋白胨為氮源的菌絲體中粗多糖的含量最高，為173.05 mg/g，其次是硫酸銨，為139.45 mg/g。氮源對(duì)大白樁菇菌絲體的積累及活性成分的含量影響不一，因此綜合各指標(biāo)可推斷，牛肉浸膏是菌絲體干質(zhì)量積累的最佳氮源，蛋白胨是菌絲體活性成分積累的最佳氮源。

2.1.3 碳氮比對(duì)大白樁菇菌絲體干質(zhì)量及活性成分含量的影響 由圖3可知，液體發(fā)酵過程中，不同的碳氮比對(duì)大白樁菇菌絲體的干質(zhì)量及活性成分的含量均有明顯的影響。在碳氮比為10∶1時(shí)，菌絲體干質(zhì)量達(dá)到最大，隨著碳氮比的增大，菌絲體干質(zhì)量總體上呈下降的趨勢，這可能是碳源含量過高，造成了富營養(yǎng)狀態(tài)，抑制了菌絲體的生長。隨著碳氮比的增加，多酚含量總體上呈現(xiàn)上升的趨勢，在碳氮比為20∶1時(shí)，菌絲體多酚物質(zhì)的積累達(dá)到最大，此時(shí)水提物中多酚含量為8.37 mg/g，醇提物中多酚含量為3.35 mg/g。隨著碳氮比的增加，菌絲體黃酮物質(zhì)的積累呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。在碳氮比為20∶1時(shí)，菌絲體醇提物的黃酮含量達(dá)到最大，為3.56 mg/g；在碳氮比為30∶1時(shí)，菌絲體水提物的黃酮含量達(dá)到最大，為0.59 mg/g。在碳氮比為20∶1時(shí)，菌絲體的粗多糖含量達(dá)到最大，為226.49 mg/g，其次是碳氮比為30∶1時(shí)，粗多糖含量為218.61 mg/g。碳氮比對(duì)大白樁菇液體培養(yǎng)中菌絲體的積累及活性成分的含量影響不一，因此綜合各指標(biāo)可推斷，碳氮比為10∶1時(shí)是菌絲體干質(zhì)量積累的最佳碳氮比；碳氮比為20∶1是菌絲體活性物質(zhì)積累的最佳碳氮比。

2.1.4 pH對(duì)大白樁菇菌絲體干質(zhì)量及活性成分含量的影響 由圖4可知，液體發(fā)酵過程中，不同的p H值對(duì)大白樁菇菌絲體的干質(zhì)量及活性成分的含量均有明顯的影響。在pH值為5時(shí)，菌絲體干質(zhì)量達(dá)到最大（4.82 g/L），隨著p H值的增大或減小，菌絲體干質(zhì)量都呈下降趨勢，因此，pH值為5時(shí)最有利于菌絲體干質(zhì)量的積累。pH值為5時(shí)也有利于菌絲體多酚物質(zhì)的積累，水提物中多酚含量為8.62 mg/g，醇提物中多酚含量為0.88 mg/g，其次是pH值為6。pH值為7時(shí)，發(fā)酵液中多酚含量最高，為1.16 mg/mL，其次是pH值為6。pH值為6時(shí)，有利于菌絲體黃酮物質(zhì)、粗多糖的積累，醇提物中黃酮含量為5.29 mg/g，水提物中黃酮含量為0.56 mg/g，菌絲體的粗多糖含量為221.02 mg/g。pH對(duì)大白樁菇菌絲體干質(zhì)量的積累及活性成分的含量影響不一，因此綜合各指標(biāo)可推斷，p H值為5是菌絲體干質(zhì)量、多酚物質(zhì)積累的最佳pH值；pH值為6是菌絲體黃酮、粗多糖積累的最佳p H值。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以菌絲體干質(zhì)量（Y）作為響應(yīng)值，對(duì)海藻糖（A）、牛肉浸膏（B）、pH（C）3個(gè)因素進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。將各因素使用Designexpert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由表3可知，模型P值<0.01，說明該模型有意義且達(dá)到了極顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.123 4（P>0.05），不顯著，表明該方程合理可靠。一次項(xiàng)A、B對(duì)結(jié)果影響顯著（P<0.05），C對(duì)結(jié)果影響不顯著（P>0.05），交互項(xiàng)AB對(duì)結(jié)果影響顯著（P<0.05），AC、BC對(duì)結(jié)果影響不顯著（P>0.05），二次項(xiàng)A2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P<0.01），B2對(duì)結(jié)果影響不顯著（P>0.05），3個(gè)單因素對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響順序?yàn)锽>A>C，即：牛肉浸膏>海藻糖>pH。經(jīng)Designexpert 8.0軟件擬合出回歸方程為：Y=5.35－0.13A－0.16B+0.075C－0.21AB+0.06AC+0.15BC－0.55A2－0.12B2－0.35C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及結(jié)果Tab.2 Factor levels and r esults of response sur face test design

表3 二次回歸方程方差分析Tab.3 Anova of quadratic regression equation

圖5可直觀反映影響菌絲體干質(zhì)量的3個(gè)因素兩兩之間的交互作用，隨著海藻糖、牛肉浸膏、pH的增加，菌絲體干質(zhì)量均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且均出現(xiàn)極值。AB、BC相互作用的曲面比較大，AC相互作用的曲面比較小，說明海藻糖與牛肉浸膏、牛肉浸膏與pH的交互作用明顯，海藻糖與pH的交互作用不明顯。沿牛肉浸膏（B）方向比海藻糖（A）的響應(yīng)面坡度更陡，說明牛肉浸膏對(duì)大白樁菇液體發(fā)酵培養(yǎng)的影響大于海藻糖，與方差分析結(jié)果一致；沿海藻糖（A）方向比pH（C）方向的響應(yīng)面坡度更陡，說明海藻糖對(duì)大白樁菇液體發(fā)酵培養(yǎng)的影響大于pH，與方差分析結(jié)果一致。

由響應(yīng)面法分析得出的最佳培養(yǎng)方案為：海藻糖25.08 g/L、牛肉浸膏6.33 g/L、p H值4.95、磷酸二氫鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.25 g/L、維生素B110 mg/L，在此配方下進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出大白樁菇菌絲體干質(zhì)量為5.26 g/L，與預(yù)測值接近，相對(duì)誤差為2.77%，證明該培養(yǎng)方案是有效可行的。

3 結(jié)論與討論

食用菌屬于異養(yǎng)微生物，主要由培養(yǎng)基來提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，如碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子等[16-17]，此外，液體發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的p H、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、接種量等都會(huì)影響食用菌菌絲體的生長與發(fā)育。碳源是食用菌最重要的營養(yǎng)源之一，為食用菌的生長發(fā)育提供能量[18]，大白樁菇液體發(fā)酵過程中均能利用供試的5種碳源，對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響從大到小排序?yàn)椋汉Ｔ逄?葡萄糖>蔗糖>麥芽糖>乳糖，這與張秋卉[6]的研究結(jié)果相一致。劉小霞等[19]研究表明，海藻糖對(duì)于草菇退化菌種有較好的復(fù)壯效果，有可能是由于大白樁菇菌種在繼代培養(yǎng)過程中出現(xiàn)了菌種退化現(xiàn)象，因此，導(dǎo)致了海藻糖的作用效果較為突出。氮源是菌絲生長過程中必需的營養(yǎng)物質(zhì)[20]，大白樁菇液體發(fā)酵過程中均能利用供試的5種氮源，其影響從大到小排序?yàn)椋号Ｈ饨?硫酸銨>蛋白胨>酵母粉>麩皮（以菌絲體干質(zhì)量為指標(biāo)），這與王謙等[8]的研究結(jié)果不一致，一方面可能是由于試驗(yàn)所設(shè)的氮源較少，未涵蓋所有的氮源，另一方面可能是采用的培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基中的微量元素存在差異。液體發(fā)酵培養(yǎng)基可提供菌絲生長所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，且適宜的營養(yǎng)比例可促進(jìn)菌絲生長及次生代謝產(chǎn)物的積累[21]，大白樁菇在液體發(fā)酵過程中，碳氮比為10∶1時(shí)，菌球干質(zhì)量、菌球密度均能達(dá)到最大。由于在液體發(fā)酵過程中會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)液的p H值發(fā)生一定的變化，試驗(yàn)中的pH值均為滅菌前所調(diào)試的初始pH值，在pH值為5時(shí)菌絲體干質(zhì)量達(dá)到最大，之后隨著p H的增加，菌絲體干質(zhì)量呈下降趨勢，因此，大白樁菇液體發(fā)酵的最適pH值為5。

食用菌在液體發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生多種化合物，主要來自于其胞內(nèi)外浸出液和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，某些活性物質(zhì)的含量可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出子實(shí)體中的含量[22]。多酚類是食用菌代謝產(chǎn)物中最重要的組分之一，具有顯著的抗炎效果[23]；黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗癌、抗過敏、增強(qiáng)免疫功能等諸多功效[24-25]；多糖是食用菌生物活性最顯著、含量最高的物質(zhì)[22]，目前，食用菌多糖的開發(fā)與利用越來越受重視[26]，衛(wèi)銀等[27]研究表明，發(fā)酵液濃縮比例、乙醇濃度、醇沉?xí)r間、發(fā)酵液pH值都會(huì)影響蛹蟲草胞外多糖的提取量。大白樁菇在液體發(fā)酵過程中，獲得最高菌絲體干質(zhì)量的培養(yǎng)基配方并不能積累到最大含量的活性物質(zhì)，表明了同一個(gè)培養(yǎng)基配方不能同時(shí)兼顧發(fā)酵產(chǎn)物中高菌絲體干質(zhì)量與高活性物質(zhì)含量的獲得，這與林群英等[28]的研究結(jié)果相一致。在所設(shè)置的試驗(yàn)方案中研究表明，葡萄糖、硫酸銨、p H值為5有利于菌絲體多酚物質(zhì)的積累；蔗糖、蛋白胨、pH值為6有利于菌絲體黃酮、粗多糖的積累；碳氮比為20∶1均有利于菌絲體3種活性成分的積累。本試驗(yàn)結(jié)果可為大白樁菇液體發(fā)酵過程中活性物質(zhì)的獲得提供一定的參考依據(jù)。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化大白樁菇液體發(fā)酵工藝以獲得其更高干質(zhì)量的菌絲體，其最佳配方為：海藻糖25.08 g/L、牛肉浸膏6.33 g/L、pH值4.95、磷酸二氫鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.25 g/L、維生素B110 mg/L。在試驗(yàn)中尚未對(duì)發(fā)酵周期進(jìn)行研究，許多研究表明，不同發(fā)酵時(shí)長對(duì)菌絲體干質(zhì)量及活性物質(zhì)的積累存在著顯著的影響，今后可在該方面進(jìn)行深入研究，為大白樁菇的開發(fā)利用提供更詳盡的參考依據(jù)。