性別控制技術(shù)在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

謝曉剛，李 丹，薛增迪，張芮琪，史宏昭，薛 嘉，馬乃祥，權(quán)富生

（1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物工程分院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；3.陜西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710000）

預(yù)計(jì)到21世紀(jì)中葉，世界總?cè)丝趯⑦_(dá)到96億，人類對(duì)畜產(chǎn)品的需求將增加70%以上[1]。為了解決全球畜產(chǎn)品需求量增加的問題，利用現(xiàn)代生物技術(shù)促進(jìn)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展顯得至關(guān)重要。哺乳動(dòng)物性別控制（Sex control）技術(shù)是通過對(duì)動(dòng)物正常生殖過程的人為干預(yù)，使雌性動(dòng)物生產(chǎn)出符合人們期望性別后代的技術(shù)手段[2-6]。性別控制技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中有著重要的意義。首先，通過控制后代的性別比例，可以充分發(fā)揮受性別限制的生產(chǎn)性狀（如泌乳、產(chǎn)麝性能等）和受性別影響的生產(chǎn)性狀（如生長(zhǎng)速度、肉質(zhì)等）的最大經(jīng)濟(jì)效益；其次，控制后代的性別比例可增加家畜選種強(qiáng)度，有效加快育種進(jìn)程；此外，通過控制后代的性別還可克服某些家畜中出現(xiàn)的異性孿生不育現(xiàn)象，排除伴性有害基因的危害，以及解決閹割等動(dòng)物福利等問題。自古以來，為了提高家畜的養(yǎng)殖效益，人們一直在試圖對(duì)其后代性別進(jìn)行控制。隨著畜牧業(yè)智能化的快速發(fā)展，人類對(duì)特定性別的家畜需求量顯著增加，因此，家畜性別控制技術(shù)具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。

1 性別控制理論研究

1923年，PAINTER等[7]研究發(fā)現(xiàn)，人類的X染色體和Y染色體，并且指出卵子與X精子結(jié)合時(shí)最終發(fā)育為雌性胎兒，與Y精子結(jié)合時(shí)最終發(fā)育為雄性胎兒。在發(fā)現(xiàn)X、Y精子可以決定動(dòng)物性別之后，1925年，LUSH等[8]根據(jù)X精子和Y精子的密度差異，通過離心的方法將兔子的X精子和Y精子分離，但是并未生產(chǎn)出預(yù)想的后代性別比例，雖然實(shí)驗(yàn)并不成功，但是此研究方法對(duì)現(xiàn)代家畜性別控制帶來了很大的影響，LUSH是通過X精子和Y精子分離進(jìn)行動(dòng)物性別控制的奠基者。目前，在動(dòng)物生產(chǎn)中，通過X、Y精子分離進(jìn)行后代性別控制仍然是主流方法。

1959年，WELSHONS等[9]提出了Y染色體決定雄性的理論。1989年，JOHNSON等[10]建立了早期的用于性別控制的流式細(xì)胞儀模型，并通過這種方法成功分離了兔子的X精子和Y精子，并采用分離后的精子進(jìn)行人工授精產(chǎn)下了預(yù)期性別比例的后代，這標(biāo)志著以分離X精子和Y精子為原理的性別控制技術(shù)取得了重大進(jìn)展。

隨后幾年，哺乳動(dòng)物的性別決定機(jī)制研究取得了很大的進(jìn)展，科學(xué)工作者將性別決定基因定位在Y染色體上一個(gè)特定區(qū)域內(nèi)，為家畜動(dòng)物的性別控制開辟了新的研究思路，即通過對(duì)胚胎早期的性別鑒定來控制后代的性別。1990年，SINCLAIR等[11]首次在人體Y染色體上克隆到一個(gè)特異的性別決定基因，SRY基因。此后，SRY基因在很多動(dòng)物中相繼被克隆出來。SRY基因的發(fā)現(xiàn)是哺乳動(dòng)物性別決定理論的重大突破，為性別控制技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)。1991年，KOOPMAN等[12]將一段含有SRY基因的序列導(dǎo)入小鼠胚胎，發(fā)現(xiàn)在出生的小鼠中，部分染色體為XX型的雌性小鼠會(huì)出現(xiàn)性別反轉(zhuǎn)，證明SRY基因是哺乳動(dòng)物性別決定的主效基因。SRY基因又稱為睪丸決定因子（Testis Determining Factor，TDF），是哺乳動(dòng)物性別決定的總開關(guān)[13-14]。20世紀(jì)90年代，HERR等[15]利用SRY基因序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR技術(shù)首次成功鑒定了牛、羊胚胎的性別，并從此開啟了利用SRY基因進(jìn)行胚胎性別鑒定的技術(shù)先河。目前，將性別控制技術(shù)與人工授精和胚胎移植技術(shù)相結(jié)合，達(dá)到人為控制性別的目的，在科學(xué)研究和動(dòng)物生產(chǎn)中已經(jīng)非常普及。

2 家畜性別控制技術(shù)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)肉、蛋、奶的需求量與日俱增，采用性別控制技術(shù)快速生產(chǎn)特定性別的后代可以更好地滿足社會(huì)對(duì)畜產(chǎn)品的需求。因此，性別控制在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用更加廣泛，出現(xiàn)了很多不同的性別控制方法，如X、Y精子分離、胚胎性別鑒定、調(diào)節(jié)母畜生殖道環(huán)境、特定溫度解凍凍精、分子生物學(xué)技術(shù)等。

2.1 X、Y精子分離技術(shù)

根據(jù)X精子和Y精子性別決定的基本理論，可以將精子分離為X精子和Y精子，根據(jù)對(duì)后代的性別需求，分別用X精子或Y精子進(jìn)行人工授精，進(jìn)行性別控制。由于X精子攜帶X染色體，Y精子攜帶Y染色體，而Y染色體要比X染色體小很多，根據(jù)2種精子的性狀差異，可以使用一些特殊的方法將它們分離開[16-19]。目前，哺乳動(dòng)物X、Y精子的分離方法主要有流式細(xì)胞儀分離法和免疫學(xué)分離法。

2.1.1 流式細(xì)胞儀分離法 流式細(xì)胞儀分離法是目前最常用也是最成熟的XY精子分離方法。該方法的主要理論依據(jù)是X精子和Y精子頭部DNA含量存在差異。在家畜中，X精子的DNA含量要比Y精子高出3%~4%[20]，根據(jù)這一差異，采用DNA特異性染料對(duì)精子進(jìn)行染色，染料的著色量與DNA的含量成正比[21]，當(dāng)X精子通過流式細(xì)胞儀時(shí)會(huì)放射出更強(qiáng)的熒光信號(hào)，從而得以分離。目前，通過流式細(xì)胞儀分離動(dòng)物精子的準(zhǔn)確率已達(dá)95%以上，生產(chǎn)的商業(yè)化性控精子已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中，尤其是在奶牛、奶山羊的生產(chǎn)中應(yīng)用較多。

2006年，覃能斌等[22]分別使用經(jīng)過流式細(xì)胞儀分選的鮮精與凍精對(duì)荷斯坦青年母牛（14~17月齡，體質(zhì)量為350~450 kg）和成年母牛（3～5周歲，頭胎或經(jīng)產(chǎn)）進(jìn)行人工輸精，發(fā)現(xiàn)后代雌性犢牛所占比例均達(dá)到90%以上。2009年，高慶華等[23]使用經(jīng)流式細(xì)胞儀分選的西農(nóng)薩能奶山羊Y精子進(jìn)行人工授精結(jié)果發(fā)現(xiàn)，出生的羔羊均為雄性。2012年，曾有權(quán)等[24]通過流式細(xì)胞儀分離豬精子，并進(jìn)行人工授精，發(fā)現(xiàn)母豬妊娠率和產(chǎn)仔率不受影響，輸X精子母豬產(chǎn)生后代為雌性的比例可達(dá)91.67%，輸Y精子母豬產(chǎn)生后代為雄性的比例可達(dá)100%。2021年，何琪富等[25]建立了一種可以定量計(jì)算奶山羊精液中X、Y精子數(shù)量的雙重TaqMan熒光定量PCR方法，可檢測(cè)經(jīng)過分離的奶山羊精液X和Y精子的數(shù)量和比例。

目前，存在的問題是使用性控精子的受孕率仍然普遍低于鮮精。此外，流式細(xì)胞儀運(yùn)行成本高，使得該技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用受到了一定的限制[26-27]。

2.1.2 免疫學(xué)分離法 免疫學(xué)分離法是利用HY抗體檢測(cè)Y精子質(zhì)膜上存在的H－Y型抗原，根據(jù)抗原抗體反應(yīng)來分離家畜的X精子和Y精子[28]。20世紀(jì)八九十年代，ZAVOS[29]和JONES等[30]使用該方法分別分離出較高純度的Y精子。然而，HENDRIKSEN[31]研究表明，X和Y精子會(huì)共享抗原，它們都能夠結(jié)合抗H－Y的抗體。此外，此種方法雖然可以獲得純度較高的X精子和Y精子，但是處理時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)顯著降低精子活力，導(dǎo)致受胎率降低，使得該方法在生產(chǎn)中很難推廣應(yīng)用[32]。

2.2 胚胎性別鑒定技術(shù)

在胚胎移植前，通過對(duì)胚胎進(jìn)行性別鑒定，可以人為選擇所需性別的胚胎進(jìn)行移植。對(duì)胚胎的性別進(jìn)行鑒定有多種方法，如SRY-PCR法、免疫學(xué)法、核型分析法等。目前，最常用的是SRYPCR法，近年來，隨著PCR技術(shù)的快速發(fā)展和普及，使得快速、準(zhǔn)確地對(duì)早期胚胎性別進(jìn)行鑒定成為可能[33]。2004年，MARA等[34]通過雙重PCR技術(shù)擴(kuò)增SRY基因，對(duì)綿羊的早期胚胎進(jìn)行性別鑒定，準(zhǔn)確率高達(dá)87.5%。2007年，劉俊平等[35]采用PCR技術(shù)對(duì)牛體內(nèi)胚胎（分別采用普通精液和性控精液超數(shù)排卵后人工授精處理發(fā)情的奶牛）和體外胚胎（分別采用普通精液和性控精液對(duì)成熟的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行體外受精）的性別進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，2種胚胎移植受體母牛后妊娠率無顯著影響，后代犢牛性別與鑒定結(jié)果符合率達(dá)100%。PCR鑒定胚胎性別的方法雖然操作簡(jiǎn)便，但仍需從胚胎中分離部分細(xì)胞，可能會(huì)對(duì)胚胎后期發(fā)育造成損傷。此外，由于該方法主要是用胚胎作為樣品，導(dǎo)致起始樣品量少，擴(kuò)增量較大，容易污染造成假陽性的結(jié)果，影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[36]。

2.3 調(diào)節(jié)母畜生殖道環(huán)境技術(shù)

1984年，李方來等[37]研究發(fā)現(xiàn)，牛陰道的酸堿環(huán)境可能與后代性別比例有關(guān)，堿性環(huán)境有助于Y精子的受精，而酸性環(huán)境有助于X精子的受精。當(dāng)陰道液的pH值大于7.6時(shí)，后代中公犢占比為66.7%；當(dāng)陰道液的p H值小于6.8時(shí)，后代中公犢占比僅為37.5%。1985年，烏蘭少布[38]報(bào)道了用20%的食醋沖洗母牛陰道，可以改變陰道的酸堿環(huán)境，當(dāng)pH值降到6.7以下時(shí)，后代中母犢可達(dá)63.5%。2015年，于濤等[39]檢測(cè)了奶牛宮頸分泌物的pH值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值越高，后代中雄性占比越高，反之，雄性占比越低；在p H值小于6.7的母牛中，后代多為雌性，而當(dāng)p H值大于7.6時(shí)，后代多為雄性；pH值在6.8~7.5時(shí)，雌雄后代數(shù)目較為平均。2017年，熊前等[40]以羅威納發(fā)情母犬為試驗(yàn)對(duì)象，使用自配的堿性沖洗液對(duì)母犬陰道進(jìn)行沖洗，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組比對(duì)照組公犬比例提高了4.8%，但差異不顯著。這種方法雖在家畜性別控制上具有一定的效果，但是目前用于改變母畜生殖環(huán)境的液體并沒有一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，也無商品化的試劑用于調(diào)節(jié)母畜生殖道環(huán)境，所以很難大范圍推廣應(yīng)用。

2.4 不同溫度解凍凍精技術(shù)

2015年，李來平等[41]將凍精在3種不同溫度區(qū)間內(nèi)解凍，分別為40~45、45~55、55~60℃。前2個(gè)溫度區(qū)間對(duì)后代的性別比例無明顯影響，而55~60℃對(duì)后代性別有很大影響，后代中雌性比例為59%。2004年，姜忠玲等[42]研究也發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)提高解凍溫度可提高后代的雌性比例。2016年，馬正文[43]發(fā)現(xiàn)，在41℃下解凍凍精，同時(shí)采用食醋沖洗母牛陰道，出生后代中雌性比例可達(dá)67.9%。這種方法簡(jiǎn)單實(shí)用，但凍精解凍所需時(shí)間及溫度的控制對(duì)一線操作人員要求較高，使得該技術(shù)的推廣受到了一定的限制。

2.5 分子生物學(xué)技術(shù)

近些年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，科學(xué)工作者對(duì)基因功能的研究取得了很大的突破。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)和基因編輯技術(shù)作為非常重要的靶向基因沉默工具，被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物基因改造[44-48]。這2種技術(shù)可以使動(dòng)物體內(nèi)某些特定基因快速失去功能，目前，有些研究團(tuán)隊(duì)就已經(jīng)將其應(yīng)用于動(dòng)物的性別控制上。

石河子大學(xué)研究表明，通過RNAi降低動(dòng)物體內(nèi)Zfy（Y chromosome linked zinc-finger protein transcriptional factor，Y染色體相關(guān)鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子）基因或者Zfx（X chromosome linked zincfinger protein transcriptional factor，X染色體相關(guān)鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子）基因mRNA的表達(dá)量，可導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)X精子或Y精子的發(fā)育受到破壞，引起后代性別比例的改變。2019年，該研究團(tuán)隊(duì)將針對(duì)奶牛Zfy基因的干擾載體注射到成年公牛睪丸中，采集精液進(jìn)行人工授精，后代犢牛中雌性占比達(dá)到72.0%[49]。此外，該研究團(tuán)隊(duì)還利用同樣的方法在綿羊[50-51]、馬鹿[52]、豬[53-54]、小鼠[55-56]等動(dòng)物上取得了一定的性別控制效果。

在模式動(dòng)物中，2012年，WU等[57]設(shè)計(jì)了針對(duì)小鼠性別決定基因——SRY基因的干擾載體，對(duì)懷孕母鼠的受精卵進(jìn)行注射后發(fā)現(xiàn)，SRY基因的沉默使得其下游的在兩性性腺分化過程中起重要作用的WT 1基因表達(dá)量顯著升高，最終影響了后代小鼠性腺和睪丸發(fā)育。2013年，KATO等[58]利用TALEN技術(shù)結(jié)合原核注射技術(shù)生產(chǎn)出敲除SRY基因的小鼠，發(fā)現(xiàn)SRY基因敲除影響了小鼠性腺的發(fā)育，雄性小鼠出現(xiàn)了像雌鼠一樣的內(nèi)生殖器，但這些小鼠不育，與正常小鼠交配不能產(chǎn)生后代。2017年，SONG等[59]研究發(fā)現(xiàn)，Sp1基因可以作為SRY轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)控因子，Sp1基因突變會(huì)導(dǎo)兔性別發(fā)生反轉(zhuǎn)。2021年，DOUGLAS等[60]在以小鼠為模型，開發(fā)了一種合成的致死性雙組分CRISPR-Cas9策略，以100%的效率生產(chǎn)出均是雄性或雌性的小鼠后代，該研究為之后CRISPRCas9技術(shù)應(yīng)用于其他哺乳動(dòng)物進(jìn)行性別控制奠定了基礎(chǔ)。

3 小結(jié)與展望

家畜性別控制在畜牧業(yè)中意義重大，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，將徹底改變動(dòng)物的生產(chǎn)方式。然而，無論是對(duì)哺乳動(dòng)物的性別決定基因還是性別決定機(jī)制，人類的認(rèn)識(shí)仍然非常有限。由于不同的性別控制技術(shù)有著各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，具體選擇哪一種技術(shù)取決于臨床中的應(yīng)用環(huán)境，而不是單一地選擇某一種方法?？偟膩碚f，性別決定是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，受到各種內(nèi)部和外部因素的影響。隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，在不久的將來人們一定能夠進(jìn)一步闡明哺乳動(dòng)物性別決定機(jī)制，研制出更加高效、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的性別控制方法，并將它們應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，結(jié)合體外受精、胚胎分割、胚胎移植、體細(xì)胞核移植等生物學(xué)技術(shù)，促進(jìn)現(xiàn)代畜牧產(chǎn)業(yè)快速高質(zhì)量發(fā)展。