苗期冷凍法快速鑒定小偃麥衍生系的抗寒性

郭慧娟，常利芳，喬麟軼，2，李 欣，2，張樹偉，陳 芳，賈舉慶，暢志堅，2，張曉軍，2

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 省部共建有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)國家重點實驗室（籌），山西太原 030031）

小麥?zhǔn)?Triticum aestivumL.)是我國三大主要糧食作物之一，也是受低溫凍害威脅最嚴(yán)重的作物之一[1]。在華北地區(qū)，冬季氣溫較低，有些小麥品種因抗寒性差導(dǎo)致大量分蘗和主莖死亡，品種無法正常越冬，來年的公頃穗數(shù)大幅減少，直接影響產(chǎn)量。尤其是近年來隨著全球氣候變化，極端寒冷天氣頻現(xiàn)，寒冬和倒春寒等自然災(zāi)害時有發(fā)生，嚴(yán)重影響了小麥安全生產(chǎn)。因此，對小麥品種進(jìn)行抗寒性鑒定，挖掘與利用抗寒種質(zhì)，培育抗寒品種，對于保證小麥的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義[2-3]。

快速準(zhǔn)確鑒定品種的抗寒性是小麥抗寒育種及其種質(zhì)改良的前提[4]。目前，北部冬麥區(qū)品種抗寒性鑒定完全依靠自然鑒定，受年度間冬季溫度變化的影響，鑒定結(jié)果年度間差異較大，品種抗寒性鑒定的可靠性受到影響，亟需增加在可控條件下的品種抗寒性鑒定試驗并建立相應(yīng)的鑒定評價標(biāo)準(zhǔn)。而室內(nèi)抗寒性鑒定主要通過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)及一些生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，其中，室內(nèi)低溫處理、生理生化指標(biāo)間接鑒定[5]及田間調(diào)查越冬死株死莖率、返青率是目前應(yīng)用較多的鑒定方法[6]。劉艷陽等[7]通過超氧化物歧化酶和過氧化物酶的活性測定及低溫脅迫后細(xì)胞膜透性來測定小麥品種的抗寒性。姜麗娜等[8]通過測定小麥拔節(jié)期低溫脅迫下葉片的生理指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)葉片相對導(dǎo)電率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性可作為小麥拔節(jié)期抗寒性鑒定評價指標(biāo)。辛艷等[9]在田間自然條件下，通過計算越冬前后枯株、死莖的百分率法評價品種的抗寒性，同時采用田間目測法評定材料的凍害等級。張淑霞等[10]通過室內(nèi)梯度緩慢降溫冷凍法研究小麥品種的抗寒性，并提出了臨界溫度值的概念，使抗寒性鑒定更符合生產(chǎn)需求。但是，室內(nèi)低溫處理后通過生理生化指標(biāo)測定小麥抗寒性的技術(shù)過程繁瑣，測定誤差較大，準(zhǔn)確性受到限制。而田間越冬返青率調(diào)查受環(huán)境影響較大，遇到暖冬則無法獲得品種抗寒性結(jié)果。因此，如何在室內(nèi)可控條件下準(zhǔn)確簡便鑒定小麥品種的抗寒性成為當(dāng)下亟待解決的問題。

趙瑞玲等[11]通過室內(nèi)梯度降溫的方法對幼苗進(jìn)行一定時間的低溫冷凍處理后，通過測定不同溫度下植株電導(dǎo)率的變化及幼苗冷凍成活率來鑒定不同小麥品種抗寒性，可以得出較為可靠的鑒定結(jié)果，但其鑒定方法過于復(fù)雜，不適合大量材料的鑒定。為了探索一種室內(nèi)快速、準(zhǔn)確鑒定小麥苗期抗寒性的方法，本研究采用實驗室內(nèi)低溫限時冷凍法，對利用小麥和偃麥草遠(yuǎn)緣雜交獲得的29份小偃麥衍生種質(zhì)進(jìn)行了室內(nèi)苗期冷凍成活率測定，結(jié)合田間越冬調(diào)查，分析與小麥田間越冬凍害等級的相關(guān)性，篩選抗寒性較好的小偃麥衍生系種質(zhì)資源，以期為小麥抗寒育種及遺傳研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗選用29份小偃麥衍生系材料，以品種長6878作為抗寒性對照，SY 95-71為半冬性對照。以上31份材料均由山西省作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 室內(nèi)苗期冷凍鑒定 苗期鑒定試驗于2020年10—12月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥染色體工程實驗室進(jìn)行。每份材料選大小均勻飽滿的籽粒50粒，用蒸餾水沖洗3次，5%的NaClO消毒15 min后，再用蒸餾水沖洗3~5次，種胚向上擺放于雙層濾紙作為基質(zhì)的培養(yǎng)皿中。每個材料3個重復(fù)，加入10 mL的蒸餾水，置于22℃的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，每隔2 d加入適量的蒸餾水。幼苗生長至2葉1心時，調(diào)查每個處理的幼苗數(shù)量。

將生長有幼苗的培養(yǎng)皿放入冷藏室內(nèi)，4℃條件下預(yù)冷凍處理24 h。然后放入-18℃冷柜中，處理3 h。冷凍結(jié)束后，在4℃條件下解凍24 h，再置于20℃條件下進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，期間適時補充無菌水。7 d后調(diào)查存活苗數(shù)，以葉片轉(zhuǎn)呈鮮綠色者為存活。參考陳超等[5]的方法，計算冷凍成活率和抗寒系數(shù)。

1.2.2 田間越冬性調(diào)查 2020年9月底，將供試材料播種于山西省晉中市榆次區(qū)東陽試驗基地，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，2次重復(fù)。每個材料按小區(qū)進(jìn)行播種，小區(qū)長2 m、寬0.5 m，小區(qū)面積1 m2，行距0.25 m，播種量為30粒/行。2021年3月小麥返青后，參照游光霞等[2]和武銀玉等[12]鑒定方法，鑒定材料的越冬凍害嚴(yán)重度。共分6級：1級，葉片無凍害；2級，葉尖受凍害發(fā)黃，葉片少量枯萎；3級，植株葉片多枯萎，但無凍死，基部仍有綠色；4級，地面有整片枯葉，近半數(shù)植株凍死；5級，葉片全部枯萎，多數(shù)植株凍死；6級全部植株全株凍死。

1.2.3 田間農(nóng)藝性狀調(diào)查 2021年6月材料成熟后每個材料隨機(jī)選取10株測定產(chǎn)量相關(guān)農(nóng)藝性狀，主要包括株高、分蘗數(shù)、穗長、每穗小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量和總產(chǎn)量。千粒質(zhì)量為籽粒收獲后測定3次，取平均值。穗長、每穗小穗數(shù)和穗粒數(shù)取每個單株的主穗進(jìn)行測定，結(jié)果取平均值。小區(qū)產(chǎn)量為小麥成熟后，收獲該小區(qū)全部植株測定籽粒產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

冷凍成活率和抗寒系數(shù)利用Excel 2010軟件進(jìn)行計算分析?？购禂?shù)與產(chǎn)量性狀的相關(guān)分析采用IBM SPSS V 22.0進(jìn)行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料冷凍成活率比較

經(jīng)-18℃冷凍處理3 h后，供試材料的冷凍成活率變幅為0.67%~87.33%，平均值為32.20%，變異系數(shù)為92.36%。由表1可知，對照長6878的成活率最高，為87.33%，半冬性對照SY 95-71的成活率僅為16.21%。品系16W16-1、CH15132、CH7034、CH 1677的平均成活率均大于80%，具有較強(qiáng)的抗寒性；CH 1302、CH 1532、CH262和14W29的平均成活率均大于45%，為中度抗寒材料；其余材料成活率低于45%，抗寒性較差，其中，品系CH1357的平均成活率最低，僅為0.67%。

表1 供試材料抗寒系數(shù)與農(nóng)藝性狀Tab.1 Cold resistance coefficient and agronomic traits of the tested materials

續(xù)表1 供試材料抗寒系數(shù)與農(nóng)藝性狀Tab.1（Continued） Cold resistance coefficient and agr onomic tr aits of the tested materials

續(xù)表1 供試材料抗寒系數(shù)與農(nóng)藝性狀Tab.1（Continued） Cold r esistance coefficient and agr onomic tr aits of the tested mater ials

根據(jù)公式計算每個品系的抗寒系數(shù)，其結(jié)果顯示16W16-1、CH15132、CH7034、CH1677抗寒系數(shù)均 大 于90%，抗 寒 性 良 好；CH 1302、CH 1532、CH 262均大于60%，有一定的抗寒性；而CH 1364、CH16104、CH1343、CH1361、13W43H、CH15145、CH 1355、CH 1357等10個品系的抗寒系數(shù)均小于10%，易受凍害影響。

2.2 供試材料田間越冬凍害程度

供試材料田間越冬凍害分布如圖1所示。

2021年小麥返青后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，凍害等級最大為6級，最小為2級，變異系數(shù)為31.04%，每個等級材料份數(shù)分布見圖2。其中對照品種長6878凍害2級，半冬性對照SY 95-71凍害為5級。供試材料中16W16-1、CH 7034的凍害等級與長6878相當(dāng)，CH1302、CH15132、CH1677、CH1532、CH262和16W23-3的凍害等級為3級，共有54.8%的供試材料凍害等級大于4級；CHL10、13W43H、CH15145、CH 1355、CH 1357、CH 1361、CH 1343和CH 1364等8個品系凍害等級最高，與室內(nèi)冷凍法鑒定結(jié)果基本吻合。進(jìn)一步的相關(guān)分析表明，田間凍害級別與室內(nèi)冷凍成活率呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)為-0.906。可見，采用室內(nèi)冷凍成活率可以有效鑒定供試材料的抗寒性。

2.3 抗寒性與產(chǎn)量性狀的相關(guān)性分析

從各性狀的平均值來看（表1、2），31份測試品種（系）的平均株高為82.17 cm，以對照品種長6878（116.27 cm）最高，CH1343（52.40 cm）最矮；有效分蘗數(shù)平均為4.52個，以CH 1355（6.86個）最多，16W16-1（2.66個）最少；穗長平均為8.32 cm，CH 15145（11.77 cm）穗子最長，CH 15132（5.51 cm）最短；每穗小穗數(shù)平均為21.62個，CH15145（32.03個）最多，CH 1517（16.58個）最少；穗粒數(shù)平均為54.75粒，13W43H（84.73粒）最多，CH7034（31.49粒）最少；千粒質(zhì)量平均為38.99 g，CH 15145（59.52 g）為最高，CH7034最低（25.76 g）；小區(qū)產(chǎn)量平均為166.79 g，CH 1677最高，為457.59 g，而CH1357最低，僅6.19 g?？梢?，這些品種（系）表型性狀差異較大，變異類型豐富多樣，有利于對其數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

通過對小偃麥衍生系抗寒系數(shù)與7個產(chǎn)量相關(guān)性狀的方差分析（表2），可以看出，抗寒系數(shù)與有效分蘗數(shù)和小區(qū)產(chǎn)量均呈極顯著相關(guān)（P<0.01），表明品種（系）的抗寒性可以顯著影響植株的有效分蘗數(shù)和小區(qū)產(chǎn)量。從圖2可以看出，隨著抗寒系數(shù)的增加，即品種（系）抗寒性的增強(qiáng)，該品種（系）的小區(qū)產(chǎn)量呈顯著增加的趨勢，而有效分蘗數(shù)則呈顯著減少的趨勢?？购禂?shù)與穗長、千粒質(zhì)量、每穗小穗數(shù)和穗粒數(shù)均呈顯著相關(guān)（P<0.05），表明品種（系）的抗寒性也可以顯著影響植株的穗長、千粒質(zhì)量、每穗小穗數(shù)和穗粒數(shù)。隨著抗寒系數(shù)的增加，穗長、千粒質(zhì)量、每穗小穗數(shù)和穗粒數(shù)均呈減少的趨勢?？购禂?shù)與株高的差異不顯著，表明抗寒性對株高的影響較小。

表2 抗寒系數(shù)與產(chǎn)量相關(guān)性狀的方差分析Tab.2 Variance analysis of cold resistance coefficient and yield related traits

3 結(jié)論與討論

小麥因具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性而在全世界廣泛分布，其抗寒性強(qiáng)弱是影響品種廣適性的重要特征之一。低溫是限制小麥生長、發(fā)育的主要因素之一，在我國從南到北幾乎所有的小麥種植區(qū)都會受到寒害的威脅[13]。在小麥的不同生育時期，影響其生長發(fā)育和產(chǎn)量的主要有冬季凍害、早春凍害和低溫冷害[14-16]。不同生長時期的凍害對小麥影響不同，研究表明，拔節(jié)、孕穗期低溫嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量[17-18]。山西省地處內(nèi)陸，氣候干旱，冬季易受極端低溫天氣影響，春季易出現(xiàn)倒春寒，抗寒材料的鑒定選育尤為重要[19]。

根據(jù)田間越冬率鑒定品種的凍害等級是抗寒性鑒定最直接的方法，但田間鑒定需要多年多點重復(fù)試驗，耗時長，工作量大，而且很容易受到環(huán)境的影響。小麥抗寒性的室內(nèi)鑒定方法目前多采用冷凍處理后測定生理生化指標(biāo)，鑒定效率和準(zhǔn)確性有一定的限制[20]。冷凍成活率是室內(nèi)鑒定小麥抗寒性最直觀的指標(biāo)，也是植株抗寒性的直接體現(xiàn)。本研究采用-18℃冷凍3 h作為快速鑒定的條件，是在參考趙瑞玲等[11]研究的基礎(chǔ)上，以冷凍成活率來檢測植株受到極端低溫天氣后的恢復(fù)能力來衡量品種的抗寒性能。但是小麥材料的抗寒性受生態(tài)區(qū)影響，無法采用統(tǒng)一的衡量標(biāo)準(zhǔn)，這為室內(nèi)鑒定的準(zhǔn)確性帶來了一定的困難。本研究在此基礎(chǔ)上增加了本生態(tài)區(qū)抗寒品種作為對照，并將最終的鑒定結(jié)果以對照品種為參照轉(zhuǎn)換為抗寒系數(shù)，其結(jié)果能夠更加直觀準(zhǔn)確地反映供試材料在所在生態(tài)區(qū)的田間抗寒能力。

優(yōu)良抗旱種質(zhì)資源的篩選評價是小麥抗旱性育種及遺傳的基礎(chǔ)。偃麥草屬（Thinopyrum）植物隸屬禾本科小麥族，是多年生草本植物，起源于東歐，天然分布于高加索、中亞等地帶。它根系發(fā)達(dá)，能夠深入土層深處，抗寒性極強(qiáng)，能夠抵抗-40℃低溫，對凍害、寒害具有天然的優(yōu)勢，富含大量的抗寒基因，是小麥遺傳改良的優(yōu)異基因庫[21-22]，也是小麥遺傳改良中應(yīng)用最成功的物種之一。本研究鑒定的29份材料來源于普通小麥與八倍體小偃麥的雜交組合，其中八倍體親本TAI7045、TAI8505、TAI8335和XY 7430都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒性[23-25]，但其后代材料的抗寒性出現(xiàn)了較明顯的分離，參試的29份材料分別源于4個八倍體小偃麥的10個組合，其中源于XY 7430的有19份，源于TAI8505和TAI8335的分別有4份，源于TAI7045的有2份?？购禂?shù)大于90%的4份材料中有3份來自XY 7430，1份來自TAI8505。29份材料中源于TAI7045的2份材料抗寒系數(shù)均低于20%，源于TAI8335的4份材料凍害等級均為4級以上，抗寒系數(shù)均低于50%。源于TAI8505的4份材料中有2份表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒性，另2份抗寒性較弱。來源于XY 7430的19份材料中也有13份抗寒系數(shù)低于50%，這可能是由于材料選育過程中由于未進(jìn)行抗寒性定位選擇而使抗寒基因丟失所致。因此，在品種選育與種質(zhì)資源篩選時，應(yīng)將品種的抗寒性作為一個重要的指標(biāo)進(jìn)行考察。

本研究通過室內(nèi)冷凍法快速鑒定了29份小偃麥衍生種質(zhì)的苗期成活率，篩選出4份抗寒系數(shù)大于90%的小偃麥衍生系，分別為16W16-1、CH15132、CH7034、CH 1677，經(jīng) 過 田 間 越冬率 驗證，本研究采用的苗期冷凍成活率與田間凍害級別呈極顯著負(fù)相關(guān)，表明采用室內(nèi)冷凍法可有效鑒定小麥品種的抗寒性，同時這些品種在小麥產(chǎn)量相關(guān)重要性狀上均表現(xiàn)優(yōu)異，可為小麥抗寒育種及遺傳研究提供了新的優(yōu)異種質(zhì)資源，為挖掘新的抗寒基因奠定了基礎(chǔ)，對小麥抗寒育種和抗寒性遺傳研究具有重要意義。但在生產(chǎn)實踐中應(yīng)注意，小麥能否安全越冬不僅取決于品種的抗寒性，也受其他因素如水肥管理措施、天氣寒冷程度等影響[26]，因此，對小麥抗寒性的評價需綜合考查。