3株內(nèi)生菌對棉花枯萎病菌拮抗效果研究

祖麗胡瑪爾·買提喀迪爾 代先興 李猛 王天舒 閆成才 牛冬冬 郝海婷

摘要? ［目的］ 探究3株棉花內(nèi)生菌對棉花枯萎病菌的拮抗效果。［方法］ 以棉花枯萎病菌為試材，采用平板對峙法將3株內(nèi)生菌菌懸液、上清液、菌揮發(fā)物分別對峙棉花枯萎病菌研究3株內(nèi)生菌拮抗效果。［結(jié)果］ 3株內(nèi)生菌菌懸液對棉花枯萎病菌的拮抗效果為O＞T＞DG3-1；3株內(nèi)生菌上清液對棉花枯萎病菌的拮抗效果為T＞O＞DG3-1；3株內(nèi)生菌菌揮發(fā)物對棉花枯萎病菌拮抗效果為DG3-1＞T＞O。并對抑制過的枯萎病菌菌絲形態(tài)進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果顯示，菌絲出現(xiàn)空腔、斷裂以及細(xì)胞壁部分溶解。重新培養(yǎng)抑制過的枯萎病菌，枯萎病菌可以正常生長，但生長較慢。［結(jié)論］ 3株內(nèi)生菌對枯萎病菌生長有不同程度的影響。

關(guān)鍵詞? 芽孢桿菌;根瘤菌;內(nèi)生菌;棉花枯萎病;拮抗

中圖分類號? S435.621? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A? 文章編號? 0517-6611（2024）09-0116-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.026

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Antagonistic Effect of Three Strains of Endophytic Bacteria on Cotton-wilt Fusarium

Zulihumaer· Maitikadier， DAI Xian-xing， LI Meng et al

（Key Laboratory for Comprehensive Management of Agricultural Pests in Southern Xinjiang，Tarim University， Alar， Xinjiang 843300）

Abstract? ［Objective］To explore the antagonistic effect of three endophytic bacteria in cotton against Fusarium wilt.［Method］Using the plate confrontation method， three endophytic bacterial suspensions， supernatants， and volatiles were used to study the antagonistic effects of the three endophytic bacteria against the cotton Fusarium wilt pathogen. ［Result］The antagonistic effect of the three bacterial suspensions on Fusarium oxysporum was O>T>DG3-1. The antagonistic effect of the supernatant of the three bacterial strains on F. oxysporum was T>O>DG3-1; the antagonistic effect of volatiles from three strains of bacteria on F. oxysporum was DG3-1>T>O. Microscopic observation of the morphology of the mycelium that suppressed F. oxysporum showed cavities， breakage， and partial dissolution of the cell wall. Recreate the inhibited F. oxysporum， which could grow normally but slowly. ［Conclusion］Three endophytic bacteria have varying degrees of influence on the growth of Fusarium wilt.

Key words? Bacillus;Rhizobium;Endophytic bacteria;Cotton Fusarium wilt;Antagonism

基金項(xiàng)目? 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)-塔里木大學(xué)科研聯(lián)合基金項(xiàng)目（NNLH-202002）；塔里木大學(xué)校長基金（TDZKJC201801）；2022校級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2023014）；2022校級研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（TDGRI202224）。

作者簡介? 祖麗胡瑪爾·麥提喀迪爾（2000—），女，新疆和田人，碩士研究生，研究方向：植物病理。

*通信作者，副教授，博士，從事植物與微生物互作研究。

收稿日期? 2023-07-05；修回日期? 2023-11-06

棉花是我國重要的一種經(jīng)濟(jì)作物，在推動(dòng)我國國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展過程中起著重要且不可取代的作用。新疆棉花總產(chǎn)量和種植面積處于穩(wěn)步增長狀態(tài)，已經(jīng)連續(xù)20多年位居全國第一位［1］。隨著種植面積的不斷擴(kuò)大和連作種植土傳病害發(fā)生嚴(yán)重，經(jīng)常與棉花黃萎病混合侵染，導(dǎo)致病害頻繁嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)［2-3］。

棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌萎蔫?；‵usarium oxysporum f.sp.vasinfectum（Atk.）Snyder et Hansen）引起的土傳病害［4］。病原菌主要通過土壤進(jìn)行傳播，也可以通過帶菌的棉殼、帶菌的種子、風(fēng)雨、病殘?bào)w、澆水和施肥工具等傳播。病菌以菌絲體、分生孢子、厚壁孢子在土壤、棉籽殼、病殘?bào)w上越冬。由于菌絲和孢子的大量繁殖可以促使薄壁組織大量繁殖膠狀物質(zhì)，引起導(dǎo)管堵塞同時(shí)病原菌大量繁殖毒素造成棉葉枯萎脫落甚至整株枯死［5］。棉花枯萎病在棉花整個(gè)生長期都可發(fā)病，導(dǎo)致棉花枯萎并脫落，影響棉花品質(zhì)和產(chǎn)量。

生物防治方法是指利用微生物之間的拮抗能力抑制病原物的方法。主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌，由于具有綠色、成本低和安全的特點(diǎn)，生物防治方法是防治各種植物病害切實(shí)可行的策略之一［6］。除生物防治外，農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治也是防治棉花枯萎病的有效措施。農(nóng)業(yè)防治主要是通過拔出病株，搬出病土，采用無病種子，但農(nóng)業(yè)防治效果不顯著需數(shù)年累計(jì)。化學(xué)防治成本較低，效果顯著但長期使用農(nóng)藥病蟲會產(chǎn)生抗藥性［7］。通過多個(gè)試驗(yàn)案例驗(yàn)證對植物病害有拮抗效果的有益微生物直接或間接的方式達(dá)到阻礙或殺死病原菌的效果［8］。利用有益微生物防治棉花枯萎病的實(shí)際應(yīng)用已有報(bào)道。柳自清等［9］研究短小芽孢桿菌KX-33種衣劑對棉花枯萎病的盆栽防效。丁建朋等［10］研究生防菌HFW217對棉花枯萎病的防治效果。袁曉娟等［11］驗(yàn)證含短小芽孢桿菌的種衣劑對棉花枯萎病有拮抗效果。筆者以棉花枯萎病菌為靶標(biāo)菌，采用平板對峙法將3種內(nèi)生菌（解淀粉芽孢桿菌O、貝萊斯芽孢桿菌T、根瘤菌DG3-1的菌懸液、上清液以及菌液揮發(fā)物）分別對峙棉花枯萎病菌，比較3株內(nèi)生菌對棉花枯萎病菌的拮抗效果，并通過回接培養(yǎng)觀察3株內(nèi)生菌對枯萎病菌生長的影響，驗(yàn)證3株內(nèi)生菌對棉花枯萎病拮抗效果，為后期制備拮抗棉花枯萎病菌菌劑提供菌種資源。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

供試病原菌：尖孢鐮刀菌由植物保護(hù)專業(yè)病理實(shí)驗(yàn)室但紅俠老師提供。

供試內(nèi)生菌：解淀粉芽孢桿菌（O）、貝萊斯芽孢桿菌（T）、根瘤菌（DG3-1）由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從棉花上分離所得。試驗(yàn)于2021年3—6月在新疆阿拉爾南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2? 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，瓊脂粉15 g/L，氯化鈉10 g/L，水1 L。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，水1 L。

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，水1 L。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，水1 L。

1.3? 試劑和儀器

試劑：酵母提取物、葡萄糖、瓊脂粉、胰蛋白胨、甘油、瓊脂糖購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

儀器：SPX型智能生化培養(yǎng)箱（寧波江南儀器制造廠）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化）BXM-75VE立式蒸汽滅菌器；D8023CTL-K4型微波爐（佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司）；D-37520冷凍離心機(jī)（賽默飛世科技（中國）有限公司）；2D-AS型恒溫培養(yǎng)搖床（常州萬順儀器制造有限公司）。

1.4? 試驗(yàn)方法

1.4.1? 3株內(nèi)生菌菌懸液對棉花枯萎病菌拮抗試驗(yàn)。

采用傳統(tǒng)平板對峙法［12］，用直徑2.5 mm的打孔器打出棉花枯萎病菌菌餅，并將菌餅接種至倒?jié)MPDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿正中心，并在26 ℃的培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4 d，第4天對3株內(nèi)生菌搖菌并離心處理，倒掉上清液，往沉淀的內(nèi)生菌加同等量的滅菌水，搖晃將滅菌水和沉淀混勻制備菌懸液，并將菌懸液同等量接種到病原菌3 mm處的4個(gè)邊上，重復(fù)3次，以接種滅菌水作為對照。

1.4.2? 3株內(nèi)生菌上清液對棉花枯萎病菌拮抗試驗(yàn)。

采用傳統(tǒng)平板對峙法［12］，用直徑2.5 mm的打孔器打出棉花枯萎病菌菌餅，并將菌餅接種至PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿正中心，并在26 ℃的培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4 d，第4天對3株內(nèi)生菌搖菌并離心處理，將離心的上清液同等量接種到病原菌3 mm處的四個(gè)邊上，重復(fù)3次，以接種滅菌水作為對照。

1.4.3? 3株內(nèi)生菌揮發(fā)物對棉花枯萎病菌拮抗試驗(yàn)。

原真菌培養(yǎng)采用無隔板平板皿進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。有隔板的平皿是中間利用隔板將平皿一分為二，培養(yǎng)基和菌都不能通過隔板，只有隔板兩邊的菌產(chǎn)生的揮發(fā)物才可以。

采用有隔板平板皿平板對峙法［13］，用直徑2.5 mm的打孔器打出棉花枯萎病病菌菌餅，并將菌餅接種至倒?jié)MPDA培養(yǎng)基的隔板培養(yǎng)皿的一邊，并在26 ℃的培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4 d，第4天對3株內(nèi)生菌搖菌并離心處理，倒掉上清液往沉淀的內(nèi)生菌加同等量的滅菌水，搖晃將滅菌水和沉淀混勻制備菌懸液，并把菌液同等量接種到隔板培養(yǎng)皿的另一邊，重復(fù)3次，以接種滅菌水作為對照。

拮抗率=對照組病原菌菌落直徑－處理組病原菌菌落直徑/對照組病原菌菌落直徑×100％。

1.4.4? 3株內(nèi)生菌拮抗棉花枯萎病菌的形態(tài)觀察和回接培養(yǎng)。

用接種針在菌絲邊緣挑取少量菌絲制成臨時(shí)玻片，放于光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)特征，并采集圖片。

采用傳統(tǒng)接種法［12］將被拮抗的棉花枯萎病菌菌餅接種至倒?jié)MPDA培養(yǎng)基，在26 ℃下倒置培養(yǎng)6 d，觀察其生長速度并驗(yàn)證3株內(nèi)生菌對棉花枯萎病菌是否抑制生長或殺死。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 3株內(nèi)生菌菌懸液對棉花枯萎病菌拮抗率

通過平板對峙法對棉花枯萎病菌的皿內(nèi)拮抗試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1、圖2），3株內(nèi)生菌對棉花枯萎病菌拮抗效果分別是菌株O拮抗率達(dá)45%，菌株T拮抗率達(dá)38%，菌株DG3-1拮抗率達(dá)7.70%。菌株O菌懸液對棉花枯萎病菌拮抗效果最佳，菌株DG3-1對棉花枯萎病菌拮抗效果相對較弱。

2.2? 3株內(nèi)生菌上清液對棉花枯萎病菌拮抗率

通過平板對峙法對棉花枯萎病菌的皿內(nèi)拮抗試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3、圖4），3株內(nèi)生菌上清液對棉花枯萎病菌拮抗效果分別是菌株O拮抗率達(dá)26%，菌株T拮抗率達(dá)50%，菌株DG3-1拮抗率達(dá)17%。菌株T上清液對棉花枯萎病菌拮抗效果最佳，菌株DG3-1上清液對棉花枯萎病病菌拮抗效果相對較弱。

2.3? 3株內(nèi)生菌菌揮發(fā)物對棉花枯萎病菌抑菌率

通過隔膜平板對峙法對棉花枯萎病菌的皿內(nèi)拮抗試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖5、圖6），3株內(nèi)生菌菌揮發(fā)物對棉花枯萎病菌拮抗效抑制分別是菌株O拮抗率達(dá)19%，菌株T拮抗率達(dá)32%，菌株DG3-1拮抗率達(dá)50%。菌株DG3-1對棉花枯萎病菌拮抗效果最佳，菌株O對棉花枯萎病病菌拮抗效果相對較弱。

2.4? 3株內(nèi)生菌對棉花枯萎病菌生長及菌絲形態(tài)的影響

通過顯微鏡觀察菌絲形態(tài)結(jié)果顯示（圖7），對照菌組菌絲生長完整沒有出現(xiàn)空腔、斷裂以及溶解現(xiàn)象，但被3株內(nèi)生菌拮抗后的菌絲出現(xiàn)被溶解、空腔以及斷裂現(xiàn)象。

將靠近內(nèi)生菌一側(cè)的病原菌菌餅通過傳統(tǒng)接種法接種至新的PDA培養(yǎng)皿，培養(yǎng)6 d后發(fā)現(xiàn)被內(nèi)生菌拮抗過的病原菌仍能生長，生長速度較對照組慢。3株內(nèi)生菌菌懸液只能延阻其生長但不能殺死棉花枯萎病病菌（圖8）。

3? 結(jié)論與討論

尖孢鐮刀菌是一種能夠引起植物枯萎病和根腐病的土傳病原真菌，嚴(yán)重影響植物產(chǎn)量和品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［8］。貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌是應(yīng)用最廣泛菌種。研究表明芽孢桿菌對黃瓜枯萎病［13-14］、番茄枯萎?。?5］、棉花枯萎?。?6］、草莓枯萎?。?7］、香蕉枯萎病［18］等多種病原菌具有一定程度的拮抗效果。

3株內(nèi)生菌菌懸液對棉花枯萎病菌拮抗率分別為菌株O為45%，菌株T為38%，菌株DG3-1為7.70%；楊迪等［19］證實(shí)解淀粉芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌有較顯著的拮抗作用。3株內(nèi)生菌上清液對棉花枯萎病菌的拮抗率分別為菌株O為26%，菌株T為50%，菌株DG3-1為17%；許帥等［20］研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵上清液能夠有效抑制馬鈴薯枯萎病

菌。宗英等［21］研究表明貝萊斯芽孢桿菌IS25R發(fā)酵濾液

對禾谷鐮刀菌的菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的抑制率分別達(dá)

27.7%和26.7%。3株內(nèi)生菌揮發(fā)物對棉花枯萎病菌的拮抗

率分別為菌株O為19%，菌株T為32% ，菌株DG3-1為50%；關(guān)于內(nèi)生菌揮發(fā)物對尖孢鐮刀菌的拮抗作用研究鮮見報(bào)道，后需對揮發(fā)性抑菌機(jī)理深入研究。

顯微鏡觀察菌絲形態(tài)結(jié)果顯示，被3株內(nèi)生菌抑制過的棉花枯萎病菌菌絲出現(xiàn)、被溶解、空腔以及斷裂現(xiàn)象。重新培養(yǎng)被抑制過的枯萎病菌結(jié)果顯示，被抑制過的棉花枯萎病菌可以正常生長但生長速度較慢。研究表明［22-23］芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌具有分解真菌細(xì)胞壁、引起菌絲變短、菌體膨大以及抑制孢子萌發(fā)等能力。該研究證實(shí)了解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌以及根瘤菌，菌懸液、上清液以及菌揮發(fā)物均對尖孢鐮刀菌引起的棉花枯萎病菌有不同程度的拮抗作用，為后期制備生物菌劑提供理論基礎(chǔ)以及菌種資源。

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