萆薢分清顆粒對阿霉素腎病大鼠足細胞podocalyxin、α-actinin-4 的影響

馬雪莉,魏錦慧,馬鴻斌

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,蘭州 730000)

腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)是臨床常見的腎疾病之一,病理變化表現(xiàn)為腎小球基底膜通透性增高,電荷屏障受損,以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和不同程度的水腫為主要臨床表現(xiàn)。由于NS 與基因突變、免疫功能紊亂、細胞因子表達異常及足細胞受損等多種因素有關(guān),其發(fā)病機制復(fù)雜且具體的細胞分子生物學(xué)免疫機制尚不明確,故目前臨床上針對NS 的一線用藥方案多以抑制免疫炎癥反應(yīng)為主,即給予糖皮質(zhì)激素、細胞毒性藥物及生物制劑等基礎(chǔ)用藥。然而,近年來的臨床實踐證實,免疫抑制劑在帶來療效的同時,尤其糖皮質(zhì)激素亦會使部分患者產(chǎn)生激素依賴及激素抵抗等問題,加之激素的副作用,嚴重影響患者后期生活質(zhì)量[1-2]。中醫(yī)以“整體調(diào)節(jié)、辨證施治”為方向,在慢性腎臟病的治療上發(fā)揮著獨特的診療優(yōu)勢,故進一步探索中醫(yī)藥對本病的作用機制具有極為重要的臨床意義。

萆薢分清顆粒是導(dǎo)師馬鴻斌教授繼承劉寶厚教授腎病“濕熱不除,蛋白難消”的學(xué)術(shù)思想,結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究及自身臨床體會,在清代醫(yī)學(xué)大家程鐘齡所撰《醫(yī)學(xué)心悟》之古方程氏萆薢分清飲的基礎(chǔ)上加減化裁而來,方由丹參12 g、車前草30 g、茯苓15 g、關(guān)黃柏12 g、綿萆薢12 g、續(xù)斷12 g、槲寄生12 g、石菖蒲10 g、甘草10 g 組成。全方共奏健脾益腎、清熱利濕之效,使氣虛得復(fù),瘀祛濕利,精微封藏。導(dǎo)師臨床運用此方治療腎虛濕熱之腎疾病均屢獲良效,臨床證實其能減少NS 患者尿蛋白的排泄率,為其常用之驗方。而其具體作用機制尚不明確。因此本研究擬通過觀察萆薢分清顆粒對阿霉素腎病大鼠足細胞相關(guān)蛋白podocalyxin、α-actinin-4表達的影響,探討其治療腎病綜合征蛋白尿的具體作用機制,為客觀評價此藥療效提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠60 只,SPF 級,6 周齡,體重(200±20)g,購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[SCXK(甘)2020-0001],飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[SYXK(甘)2020-0009],光照明暗各12 h,每日予以新鮮水及飼料。經(jīng)由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(2021-234;2021-235),實驗操作遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

萆薢分清顆粒(綿萆薢12 g、續(xù)斷12 g、槲寄生12 g、茯苓15 g、關(guān)黃柏12 g、丹參12 g、車前草30 g、石菖蒲10 g、甘草10 g,以上均選用中藥配方顆粒劑):購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心。醋酸潑尼松片(prednisone acetate,PRE),購自山東魯抗醫(yī)藥集團賽特有限責(zé)任公司,規(guī)格:每片5 mg,國藥準字:H20033023,生產(chǎn)批號: 210122;注射用鹽酸多柔比星(阿霉素Adriamycin,ADR):酷兒化學(xué)科技(北京) 有限公司,規(guī)格:每支25 mg,國藥準字RE294501,生產(chǎn)批號:HY613701。

α-actinin-4 抗 體(美 國Genetex 公 司,批 號402205);podocalyxin 抗體(美國Genetex 公司,批號822102958);β-actin 抗體(美國Immunoway 公司,批號 B2804);PVDF 膜(Millipore 公 司,批 號IRVH00010);ECL 發(fā)光液(上海翊圣生物科技有限公司,批號36208-A/B);蛋白電泳Marker(上海翊圣生物科技有限公司,批號26616);BCA 蛋白定量試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司,批號20210419);RIPA 蛋白裂解液(北京索萊寶生物科技有限公司,批號20210911)。MiniChemi 610 型全自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司);5424R 型高速冷凍離心機(德國 Eppendorf);KD-P 組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);RM2016 病理切片機(上海萊卡儀器有限公司);JB-P5 石蠟包埋機(俊杰電子有限公司);DW-HL528 超低溫冰箱(中科美菱低溫科技公司);iMark 酶標儀(美國Bio Rad 公司);Cobasc701 全自動生化分析儀(瑞士Roche 公司);SK-O180-E 搖床(SCILOGEX 公司);BX43+sc50 顯微拍照系統(tǒng)(奧林巴斯有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備模型、動物分組、給藥與取樣

SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,隨機選取12 只作為空白組,余48 只大鼠為造模組。造模組采用分2次隔周尾靜脈注射阿霉素(0.4+0.1) mg/100 g 的方法建立阿霉素腎病大鼠模型[3],空白組大鼠注射同等劑量的生理鹽水,以尿蛋白定量≥100 mg/24 h提示模型復(fù)制成功。

按隨機數(shù)字表法將造模成功的大鼠分為模型組、中藥組、潑尼松組、結(jié)合組,每組12 只,進行灌胃。依據(jù)大鼠的等效劑量相當(dāng)于人的6.3 倍,中藥組:萆薢分清顆粒成人每天服用125 g/60 (kg·d)。大鼠的等效劑量為125 g/60 (kg·d)×6.3=13.125 g/(kg·d)。制備為2 g/mL 溶液,則需要6.56 mL/kg。潑尼松組:潑尼松成人用量為1 mg/(kg·d),換算后大鼠等效劑量為6.3 mL/(kg·d),配置為濃度1 mg/mL 的藥液,需要6.3 mL/kg。結(jié)合組給予中藥量6.56 mL/kg 和潑尼松溶液6.3 mL/kg 灌胃?？瞻捉M及模型組予等體積生理鹽水灌胃。每日灌胃1 次,連續(xù)4 周。給藥期間每天測體重并調(diào)整灌胃劑量,每2 周檢測1 次24 h-UTP。

干預(yù)4 周后,大鼠禁食水12 h 后,麻醉大鼠,心臟采血,靜置30 min 后轉(zhuǎn)速離心10 min,取上層血清,放于-80℃冰箱保存。取血完畢后,打開腹腔,剝離腎周圍組織,摘取大鼠雙側(cè)腎,用0.9%生理鹽水沖洗干凈后,剔除腎被膜,一側(cè)置于裝有4%多聚甲醛固定液的小離心管中進行固定,用于HE、Masson 染色觀察。另一側(cè)置于凍存管中,液氮速凍后移至-80℃冰箱,用于免疫組化和Western blot檢測。

1.3.2 檢測24 h-UTP 水平

取收集的24 h 尿液,送至甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科,使用比濁法測定24 h 尿蛋白定量。

1.3.3 生化指標檢測

血TC、ALB,使用全自動生化分析儀,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科生化實驗室檢測。

1.3.4 HE、Msaaon 染色觀察大鼠腎組織病理學(xué)改變

4%多聚甲醛固定腎組織,經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、切片(4 μm)、烤片后分別進行HE、Msaaon 染色處理,光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化。

1.3.5 免疫組織化學(xué)法(IHC)法檢測大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達

取出4%多聚甲醛固定的腎組織,梯度乙醇洗脫切片,滴加3% H2O2沖洗,配制0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=6.0)90℃進行抗原修復(fù)。加入一抗(podocalyxin,1 ∶100;α-actinin-4,1 ∶100),4℃孵育過夜,PBS 液洗3 次,每次5 min,37℃孵育二抗1 h,PBS 液洗5 次。DAB 顯色,蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。染色結(jié)果呈棕黃色顆粒為陽性。使用Image J 計算各張片子灰度值,最終平均光密度值以AOD=IOD/Area(即intDen/area)表示。

1.3.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達水平

取100 mg 冷凍組織,剪碎,加入1 mL 預(yù)冷的生理鹽水,沖洗兩遍,置于低溫勻漿儀中充分勻漿,4℃ 12000 r/min 離心15 min,留上清備用。根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒檢測組織總蛋白濃度;上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶封閉后分別用podocalyxin(1 ∶1000),α-actinin-4(1 ∶1500),內(nèi)參β-actin(1 ∶5000)加入相應(yīng)的一抗4℃孵育過夜,使用封閉液按1 ∶5000 稀釋二抗,室溫孵育1 h,洗脫,置于化學(xué)發(fā)光儀中曝光,使用Image 軟件分析相關(guān)蛋白表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料進行正態(tài)性及方差齊性檢驗,滿足正態(tài)性和方差齊性時,以平均數(shù)±標準差()表示。組間比較采用單因素方差分析,方差齊時,用LSD 檢驗;方差不齊時,用Grames-Howell 檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)改變

實驗過程中,空白組大鼠一般狀態(tài)良好,精神佳,反應(yīng)靈敏,皮毛有光澤,進食量正常;模型組大鼠精神差,活動量減少,毛發(fā)干枯,反應(yīng)遲鈍,時有大便質(zhì)稀,陰囊水腫,部分爛尾,體重增加緩慢;各藥物干預(yù)組初期和模型組有相同表現(xiàn),隨著用藥,后期諸癥逐漸改善,活動量增多,進食量增加,大便形質(zhì)正常。

2.2 萆薢分清顆粒對阿霉素腎病大鼠24 h 尿蛋白定量的影響

造模2 周末,與空白組比,造模組大鼠24 h 尿蛋白定量升高(P<0.05),提示成功復(fù)制模型;灌胃2、4 周時,模型組24 h 尿蛋白水平進一步升高,各藥物干預(yù)組比同期模型組不同程度減少(P<0.05),結(jié)合組降低趨勢最為顯著(P<0.05),見表1。

表1 不同時間各組大鼠 24 h 尿蛋白定量(ˉx±s,mg/24 h)Table 1 24 h urinary protein in each group at different time

2.3 萆薢分清顆粒對阿霉素腎病大鼠血清TC、ALB 的影響

灌胃4 周末,與空白組比較,模型組大鼠TC 值升高,ALB 下降(P<0.05);與模型組比較,各藥物干預(yù)組大鼠TC 值均有不同程度下降,ALB 不同程度升高(P<0.05);與中藥組和潑尼松組比較,結(jié)合組大鼠血清TC 值明顯降低,ALB 明顯升高(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠TC、ALB 水平()Table 2 TC and ALB levels of rats in each group

表2 各組大鼠TC、ALB 水平()Table 2 TC and ALB levels of rats in each group

注:與空白組相比,△P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。Note.Compared with the blank group,△P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.

2.4 光鏡下HE、Masson 染色后阿霉素腎病大鼠腎組織的病理變化

經(jīng)HE、Masson 染色后,使用200 倍光鏡觀察,結(jié)果顯示:空白組大鼠腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰,基質(zhì)部未見增生、壞死,小管及間質(zhì)無明顯病理學(xué)改變;模型組腎小球可見局灶節(jié)段性瘢痕形成,系膜細胞及系膜基質(zhì)增生,腎小管空泡變性,管腔內(nèi)可見蛋白管型,間質(zhì)纖維細胞增生伴炎性細胞浸潤;各藥物干預(yù)組間腎小球及腎小管病變均有所改善,結(jié)合組改善最為明顯。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠 HE 染色Figure 1 HE staining of rats in each group

圖2 各組大鼠Masson 染色Figure 2 Masson staining of rats in each group

2.5 免疫組化法檢測腎組織podocalyxin、αactinin-4 的表達

腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組和各藥物干預(yù)組大鼠podocalyxin 表達均明顯降低,α-actinin-4 表達明顯升高(P<0.05);與模型組相比,各藥物干預(yù)組podocalyxin 表達均升高,α-actinin-4 表達均有所下降(P<0.05);且結(jié)合組podocalyxin 表達高于中藥組、潑尼松組,α-actinin-4 表達低于中藥組、潑尼松組(P<0.05),見表3、圖3、圖4。

圖3 免疫組化法測腎組織podocalyxin 的表達Figure 3 Immunohistochemical staining of renal tissue expression of podocalyxin

圖4 免疫組化法測腎組織α-actinin-4 的表達Figure 4 Immunohistochemical staining of renal tissue expression of α-actinin-4

表3 各組大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達比較(平均光密度,)Table 3 Comparison of podocalyxin and α-actinin-4 protein expression in kidney tissues of rats in each group(Mean optical density)

表3 各組大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達比較(平均光密度,)Table 3 Comparison of podocalyxin and α-actinin-4 protein expression in kidney tissues of rats in each group(Mean optical density)

注:與空白組相比,△P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。Note.Compared with the blank group,△P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.

2.6 Western blot 檢測podocalyxin、α-actinin-4 蛋白的相對表達量

與空白組相比,模型組和各藥物干預(yù)組大鼠podocalyxin 表達強度降低,α-actinin-4 表達強度升高(P<0.05);與各模型組相比,各藥物干預(yù)podocalyxin、組有達強度均升高,α-actinin-4 表達強度均降低(P<0.05);且結(jié)合組podocalyxin、表達優(yōu)于中藥組、潑尼松組,α-actinin-4 表達弱于中藥組、潑尼松組(P<0.05),見表4、圖5。

圖5 各組大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達Figure 5 podocalyxin and α-actinin-4 protein expression in renal tissue of rats in each group

表4 各組大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達量()Table 4 Podocalyxin and α-actinin-4 protein expression intensity in renal tissues of rats in each group

表4 各組大鼠腎組織podocalyxin、α-actinin-4 蛋白表達量()Table 4 Podocalyxin and α-actinin-4 protein expression intensity in renal tissues of rats in each group

注:與空白組相比,△P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。Note.Compared with the blank group,△P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.

3 討論

根據(jù)病理表現(xiàn),阿霉素腎病模型可分為急性阿霉素腎病模型與慢性阿霉素腎病模型,急性阿霉素腎病模型病理改變與人類微小病變腎病相似[4]。本實驗根據(jù)文獻報道[3]采用分2 次隔周尾靜脈注射阿霉素(0.4+0.1) mg/100 g 的方法制備阿霉素腎病模型。模型組動物在造模后第15 天24 h 尿蛋白定量顯著上升,第28 天出現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)改變,與空白組比較有統(tǒng)計學(xué)意義,表明本次實驗復(fù)制阿霉素腎病模型較為理想。

NS 臨床表現(xiàn)為持續(xù)大量蛋白尿,而足細胞結(jié)構(gòu)及功能的改變是導(dǎo)致蛋白尿及NS 發(fā)病和進展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。長期持續(xù)大量蛋白尿可造成腎小球硬化、腎小管損傷和腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤及纖維化,導(dǎo)致足細胞病變,最終腎功能下降,從慢性腎病發(fā)展為終末期腎病[5-6]。因此,開展對podocalyxin、αactinin-4 等足細胞蛋白的研究,尋找安全有效降低尿蛋白的方法,防止腎病理損傷的惡化,延遲腎替代治療的時間,逐漸成為治療腎病綜合征蛋白尿的新靶點。

NS 屬于中醫(yī)“水腫”、“關(guān)格”等范疇。本病病機為本虛標實,虛以肺、脾、腎三臟氣血陰陽虧虛為主,邪實則以濕、熱、瘀為甚,三者相互膠濁,致疾病反復(fù)遷延難愈。本研究采用臨床經(jīng)驗方萆薢分清顆粒進行干預(yù),方中綿萆薢利濕通淋,分清去濁為君藥;車前草通利小便,清膀胱濕熱;續(xù)斷補肝腎,強筋骨。二藥合用,補腎清熱利濕,達標本兼治之功,共為臣藥;茯苓利水滲濕健脾;黃柏清瀉下焦?jié)駸?加用槲寄生以增強續(xù)斷補腎之力;石菖蒲交通心腎,化濕通竅;丹參通心竅、清血熱;五藥合用,加強補腎清熱利濕之力,共為佐藥;生甘草一味以調(diào)和諸藥亦增清熱解毒之力為使藥;諸藥合而成方,使得此方配伍嚴謹,療效顯著。共奏健脾益腎、清熱利濕之效,使氣虛得復(fù),瘀祛濕利,精微封藏,以調(diào)節(jié)臟腑陰陽動態(tài)的平衡?，F(xiàn)代藥理研究表明,萆薢水提物可通過減少腎組織中TNF-α、MCP-1 和ICAM-1 的表達及血清MCP-1 蛋白合成水平,起到保護腎的作用[7]。車前草有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用[8];續(xù)斷可增強小鼠非特異性免疫功能[9];茯苓多糖可通過激活PPAR-γ 表達,抑制p38 MAPK 磷酸化,從而延緩db/db 小鼠腎小球硬化,保護腎損傷[10];黃柏中的主要成分黃柏堿可明顯降低大鼠血清中Scr、BUN 含量,抑制炎性因子的釋放,減輕腎的病理損傷,改善腎功能[11]。丹參多酚酸鹽可通過抑制糖尿病腎病小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)及調(diào)控TGF-β1/Smad 信號通路的活化狀態(tài),減輕腎纖維化,延緩腎組織病理學(xué)改變[12]。本實驗中,模型組大鼠24 h 尿蛋白定量升高,腎小球可見局灶節(jié)段性瘢痕形成,系膜細胞及系膜基質(zhì)增生,腎小管空泡變性,管腔內(nèi)可見蛋白管型,間質(zhì)纖維細胞增生伴炎性細胞浸潤;經(jīng)萆薢分清顆粒干預(yù)后,24 h 尿蛋白、血清TC 明顯下降、ALB 升高,腎組織病理明顯改善,提示萆薢分清顆粒能降低阿霉素腎病大鼠24 h 尿蛋白量、血清TC 值,升高ALB 及減輕腎病理變化進而延緩疾病進展的作用,并且中西醫(yī)結(jié)合用藥效果顯著。

足細胞是一種附著在基底膜上的高度終末分化上皮細胞,位于腎小球毛細血管壁最外層,由胞體、主突和足突構(gòu)成。足細胞之所以能在基底膜上穩(wěn)定附著并發(fā)揮其正常功能,主要依賴于足細胞相關(guān)蛋白的維持。目前研究較多的是頂膜區(qū)蛋白podocalyxin 和骨架區(qū)蛋白 α-actinin-4。足細胞podocalyxin、α-actinin-4 與裂孔膜一起構(gòu)成濾過屏障,共同維持足細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及足細胞與GBM的功能完整,podocalyxin 的缺失及α-actinin-4 表達改變可引起足突融合,引發(fā)蛋白尿。podocalyxin 是一種帶有大量負電荷的CD34 家族的唾液酸蛋白,位于足細胞的胞膜頂端,也是維持腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)和功能正常發(fā)揮的最主要物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)微小病變、IgA 腎病等各種腎小球疾病患者,其腎組織穿刺病理活檢中腎小球足細胞podocalyxin 表達明顯降低,并與蛋白尿嚴重程度相關(guān)[14]。實驗研究表明podocalyxin 蛋白與腎小球足細胞關(guān)系密切,podocalyxin 的表達減少可引起足突融合,并與蛋白尿產(chǎn)生關(guān)系密切[15]。骨架蛋白αactinin-4 是收縮蛋白超家族成員,是維持足細胞骨架和裂隙隔膜功能的重要肌動蛋白相關(guān)分子,可將松散的肌動蛋白纖維交聯(lián)成可收縮束狀結(jié)構(gòu)[16]。α-actinin-4 特異表達于腎小球臟層上皮細胞即足細胞[17],α-actinin-4 能將細胞骨架與裂孔隔膜分子連接起來,在保持足細胞生理結(jié)構(gòu)中起核心作用。其中,肌動蛋白細胞骨架的改變與α-actinin-4 分子表達和分布的異常密切相關(guān)。近年的許多實驗證實足細胞功能及結(jié)構(gòu)的異常,濾過膜的損傷及蛋白尿的出現(xiàn)是由α-actinin-4 的異常表達所導(dǎo)致[18]。本實驗中,模型組大鼠免疫組化結(jié)果顯示podocalyxin陽性表達明顯減弱,α-actinin-4 呈強陽性表達;免疫印跡結(jié)果顯示podocalyxin 表達強度降低,α-actinin-4 表達強度升高;藥物干預(yù)后,各治療組podocalyxin陽性表達增強,α-actinin-4 陽性表達減弱,podocalyxin 表達強度升高,α-actinin-4 表達強度下降。且結(jié)合組表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。這提示萆薢分清顆粒能通過下調(diào)大鼠腎組織足細胞骨架αactinin-4 及上調(diào)足細胞頂膜區(qū)podocalyxin 表達,修復(fù)受損的足細胞,穩(wěn)定足細胞結(jié)構(gòu)與功能,減少尿蛋白的排泄,延緩慢性腎病的發(fā)展。

綜上,萆薢分清顆粒可能通過上調(diào)阿霉素腎病大鼠腎組織中足細胞podocalyxin 表達,下調(diào)αactinin-4 表達,修復(fù)受損的足細胞,減輕大鼠腎病理損傷,減少尿蛋白排泄,延緩腎病綜合征大鼠病情進展。