免疫系統(tǒng)人源化的非小細胞肺癌異種移植小鼠模型臨床前研究應用

張 雄 郭文文 張彩勤?

(1.空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心,西安 710032;2.陜西省咸陽市中心醫(yī)院,陜西 咸陽 712000)

肺癌是一種起源于肺部支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤,依據(jù)其腫瘤細胞形態(tài),可將肺癌分為兩類,一類為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC),約占肺癌確診患者的15%,另一類為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),約占肺癌確診患者的85%。其中非小細胞肺癌又可具體分為鱗狀細胞癌、腺癌以及大細胞癌3 類。據(jù)最新臨床數(shù)據(jù)顯示[1],全球幾乎近1/4 的癌癥死亡患者屬于肺癌患者,且約57%的肺癌患者會出現(xiàn)相應腫瘤轉(zhuǎn)移癥狀,其五年生存率低于5%。究其原因在于肺癌的臨床表現(xiàn)復雜,無法通過相關的早期診斷對患者進行篩查,而大多數(shù)肺癌患者診斷明確時,病情已發(fā)展至晚期,確診率與死亡率幾近并駕齊驅(qū)。因此,肺癌的臨床治療仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)[2-3]。

近年來,隨著以免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitions,ICIs)為代表的免疫治療的發(fā)展[4-6],肺癌治療進入了免疫治療的時代。隨之而來,有大量的免疫單藥治療及聯(lián)合治療的策略亟待進行臨床前或臨床試驗以檢驗治療效果。早期臨床前研究中,研究人員通常將研究焦點集中于腫瘤細胞本身,主要采用裸鼠、C57BL/6J 等小鼠進行荷瘤實驗以檢測藥物的治療效果。然而,這種模型不僅缺乏完整的腫瘤免疫微環(huán)境(tumor immune microenvironment,TME)[7],且其與人類腫瘤細胞及免疫系統(tǒng)也存在種屬差異,造成了實驗室結(jié)果難以轉(zhuǎn)化為臨床療法的困境。因此,選擇能夠最大程度模擬人體腫瘤微環(huán)境的臨床前動物模型變得至關重要。為真實模擬人體腫瘤免疫微環(huán)境,以研究藥物的作用機制及確定最佳的診治方案,免疫系統(tǒng)人源化小鼠應運而生[8],主要包括 Hu-PBL(humanized-peripheral blood mononuclear cells)小鼠模型、Hu-HSCs(humanized-hematopoietic stem cells)小鼠模型、Hu-BLT(humanized-bone marrow,liver,thymus)小鼠模型。由于免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型構(gòu)建已有多篇文章進行介紹,因此本文重點綜述肺癌研究過程中構(gòu)建的具有人免疫系統(tǒng)的非小細胞肺癌異種移植模型在相關治療中的具體應用,并綜合現(xiàn)階段臨床難點問題,對其潛在應用及發(fā)展方向進行探討。

1 免疫檢查點抑制劑的臨床前研究

隨著越來越多免疫檢查點的發(fā)現(xiàn)和研究,新型的免疫檢查點抑制劑藥物不斷研發(fā),與此同時伴隨著的是需要開展大量臨床前藥物評估研究以明確藥物療效,以及觀察藥物的毒副作用并確定最佳用藥方案。已有研究證明人源性組織異種移植(patient-derived xenografts,PDX)模型對于常規(guī)用于腫瘤治療的化療藥物的臨床預測準確度高達97%[9],因此可以推測異種移植的肺癌免疫系統(tǒng)人源化小鼠作為一種具有巨大潛力的轉(zhuǎn)化醫(yī)學平臺,是解決上述兩大難題的關鍵所在。

目前已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準上市的非小細胞肺癌的免疫檢查點抑制劑藥物 pembrolizumab、nivolumab、atezolizumab、durvalumab 和avelumab 主要抑制PD-1 和PD-L1 結(jié)合通路,而ipilimumab 主要抑制CTLA-4 和CD80/86 結(jié)合通路,大量的異種移植的非小細胞肺癌免疫系統(tǒng)人源化小鼠被應用到免疫抑制劑藥物的研究過程中,并顯現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。

在治療效果評估方面,多項研究證明人源化小鼠模型具有真實存在的臨床轉(zhuǎn)化應用價值。上海交通大學附屬胸科醫(yī)院的周箴團隊的研究表明,肺癌Hu-PBL-PDX 模型的腫瘤生長能被 PD-1 單抗抑制,并且早期PD-L1 表達水平越高,腫瘤體積抑制率(tumor growth inhibition value,TGI)越大,因此該模型或可幫助指導臨床用藥,預測非小細胞肺癌患者從PD-1/PD-L1 免疫治療中獲益的可能性[10]。Wang 等[11]在免疫缺陷小鼠(NSG)輻照4 h 后,將胎肝來源的CD34+HPSC(human pluripotent stem cells)通過靜脈注射移植入小鼠體內(nèi),并移植患者來源的肺癌組織構(gòu)建Onco-HuNSG-PDX 模型。在Onco-HuNSG-PDX 小鼠中,13 只小鼠中有11 只對pembrolizumab 治療有反應,進一步通過與單純NSG小鼠組的對比發(fā)現(xiàn),Onco-HuNSG 小鼠中CD4+和CD8+T 細胞含量顯著增加,pembrolizumab 的腫瘤抑制作用在缺乏人類免疫細胞的NSG 小鼠和hCD8+T 細胞耗盡的Onco-HuNSG 小鼠中不存在,因此可初步得出pembrolizumab 的功效取決于Onco-HuNSG小鼠中hCD8+T 細胞的人類免疫系統(tǒng)的重建,為其成為研究免疫檢查點抑制劑在T 細胞活化中功效的新平臺提供了進一步的依據(jù)。此外,雖已明確靶向PD-1/PD-L1 通路可恢復T 細胞功能,但其對于腫瘤細胞生物學特征的影響仍需更加深入的研究[12],部分研究人員通過構(gòu)建此類模型證實免疫檢查點抑制劑可通過上調(diào)血清中的IL-4 和IFN-γ 水平實現(xiàn)對NSCLC 的治療作用[13-14]。

在模型構(gòu)建以及模型優(yōu)化拓展應用方面,不同的實驗設計需要選擇不同的模型構(gòu)建方法。在研究PD-L1/PD-1 靶向免疫治療效果的人源化肺癌小鼠模型的實驗過程中[15],研究人員通過模型構(gòu)建難度、T 細胞重建水平以及抗腫瘤藥物治療效果綜合對比首次發(fā)現(xiàn),Hu-PBL-CDX 模型優(yōu)于Hu-HSCs-CDX 模型,且后期所建立的Hu-PBL-PDX 模型可應用于對免疫功能已經(jīng)受到PD-1/PD-L1 通路抑制的T 細胞重新恢復功能的探索性研究中。而探究新型的造模方式,也是目前解決人源化小鼠模型局限性的最佳方案,如患者自體免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型auto-PBMC-PDX 小鼠已成為研究癌癥免疫療法的新興平臺[15-17],用于評估抗PD-L1/PD-1 抗體療法的療效,幫助指導臨床決策,如建議患者是否可以從PD-L1/PD-1 靶向免疫療法中獲得臨床益處等。

在模型潛在應用價值方面,我們發(fā)現(xiàn)移植患者來源肺癌組織的Hu-PBL 和Hu-HSCs 模型個體中進行的免疫檢查點抑制劑如pembrolizumab、nivolumab療效評估[11,14,18],其應答率與臨床試驗中的應答率基本一致,因此該類模型可能代表了一種理想的對病人的選擇和對治療反應的預測因子評估平臺,可用于對于腫瘤標志物的篩選。日本學者Fukui等[19]在驅(qū)動基因突變顯著的患者人群臨床研究中發(fā)現(xiàn),中性粒細胞-淋巴細胞比率(neutrophil-tolymphocyte rate,NLR)可用于前瞻性預測,作為篩選對于PD-1 以及PD-L1 阻斷治療有效的患者的指標,但由于樣本量不足以及實驗樣本具有特殊性的原因,并不能完美轉(zhuǎn)化為臨床標準。NLR 真正作為預測指標在臨床上得到應用有較多工作需要進行,如成本-效果評價、NLR 在腫瘤以及外周血一致性評價、預期設計NLR 具體界限評價等[20-22]。異種移植的免疫系統(tǒng)人源化小鼠可為推動NLR 生物標志物研究,解決此類問題提供良好的臨床前研究模型。

2 免疫聯(lián)合治療

免疫檢查點抑制劑的出現(xiàn)極大程度上改善了非小細胞肺癌患者的生存率,但仍有大量患者對于單一免疫檢查點抑制劑藥物的作用效果不明顯,因此急需基于免疫治療的聯(lián)合化療、放療、靶向藥物治療等的聯(lián)合治療方案來提高免疫治療的效果。目前較為常見的非小細胞肺癌的聯(lián)合治療方案包括雙免疫檢查點聯(lián)合治療[23-24]、PD-1/PD-L1 與抗血管生成藥物聯(lián)合治療[25-26]、PD-1/PD-L1 與含鉑類藥物聯(lián)合治療[27]等。但大多聯(lián)合治療缺乏臨床前實驗證據(jù),具體的用藥方案也有待進一步明確和優(yōu)化。目前的免疫系統(tǒng)和腫瘤雙人源化的小鼠模型可作為此類研究的一種有效的臨床前動物模型,該類模型的應用可為新藥研發(fā)和新型治療方案的確立提供可靠的數(shù)據(jù)基礎。

2.1 免疫聯(lián)合代謝阻斷治療

除了與傳統(tǒng)的治療方案的聯(lián)合,還可針對腫瘤細胞糖酵解代謝的關鍵途徑來促進免疫治療效果。Oxamate 是一種能夠阻斷腫瘤細胞糖酵解的抗癌藥物,有研究通過構(gòu)建Hu-PBL-CDX 非小細胞肺癌模型,研究 Oxamate 與免疫檢查點抑制劑pembrolizumab 聯(lián)合治療對肺癌腫瘤細胞的作用[28],證實Oxamate 與pembrolizumab 雖在單獨治療時均可起到延遲腫瘤生長的作用,但當二者合用時,Oxamate 可通過抑制LDH-A 的活性來阻斷腫瘤細胞糖酵解過程以及增加腫瘤中心CD8+T 細胞浸潤,抑制腫瘤細胞活性,進而增強pembrolizumab 的抗腫瘤療效,且該聯(lián)合療法即使在劑量較大的情況下,也不會對機體正常細胞造成過度影響。因此,人源化異種移植小鼠模型還可作為靶向代謝途徑和免疫聯(lián)合治療方案的臨床前模型,利用該模型來進行免疫聯(lián)合代謝阻斷治療的全面評估,評估結(jié)果可為臨床研究的順利開展奠定堅實的數(shù)據(jù)基礎。

2.2 雙免疫聯(lián)合治療

T 細胞雙特異性抗體 (T-cell bispecific antibodies,TCB)通過將T 細胞與靶向腫瘤細胞交聯(lián)來引發(fā)抗腫瘤反應,且其介導的多克隆T 細胞活化與T 細胞受體特異性無關,無需共刺激信號介導。肺癌免疫治療的研究中[29],研究人員先將健康人來源的PBMC 注射到NCG 小鼠體內(nèi),并移植高表達PD-L1 的HCC827 肺腫瘤細胞成功構(gòu)建肺癌的Hu-PBL-CDX 小鼠模型,然后當小鼠接種腫瘤后4 d 靜脈給予雙特異性抗體ACE-05 治療,發(fā)現(xiàn)在10 只ACE-05 治療的小鼠中,有9 只預先建立的腫瘤在第12 天完全消退,表明雙特異性抗體 ACE-05 可有效誘導非小細胞肺癌腫瘤消退,在后續(xù)研究中也證明了其可降低脫靶毒性。此外,在人胃腺癌異種移植小鼠模型(Hu-HSCs-CDX)中 TCB 已被證明可以上調(diào)T 細胞上的PD-1 表達和癌細胞上PD-L1 表達,且與TCB 單藥治療或抗PD-L1 單藥治療相比,TCB與抗PD-L1 的聯(lián)合用藥具有更強的抗腫瘤作用[30],因此利用肺癌異種移植小鼠模型進一步探索雙免疫聯(lián)合方案具有較好的應用價值。

3 新輔助/輔助治療

新輔助治療是指在腫瘤患者接受手術前進行一定治療處理,達到縮小腫瘤體積、減少腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)、提高耐受性和手術治療等可能目的的一種新治療手段,主要包括新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NACT)、新輔助免疫治療(neoadjuvant the immune checkpoint inhibition,NAICI)以及新輔助內(nèi)分泌治療(neoadjuvant hormonal therapy,NAHT)。針對非小細胞肺癌而言,已有多種新輔助治療手段開始逐步應用,例如新輔助化療已經(jīng)獲批非小細胞肺癌患者的一線應用,但對于患者的長期生存改善并不明顯。另外,如何根據(jù)患者人群的異質(zhì)性,選擇合適的藥物或確定合適治療時機,及其是否存在相關治療不良效應仍是臨床工作的巨大障礙。研究人員用4 周大的雄性無胸腺 NMRI-Foxn1 nu/nu 小鼠 (JanvierTM) 和 C57BL/6J (JanvierTM) 小鼠通過移植人肺癌細胞系(A549 或 LNM-R)構(gòu)建Hu-CDX 模型,然后進行新輔助化療,并聯(lián)合進行免疫治療。結(jié)果顯示,基于順鉑的NACT 可通過 AKT 激活以劑量依賴性方式快速增加 PD-L1 表達,且延緩腫瘤的生長,與單藥治療相比,腫瘤體積減少了47%[31],雖結(jié)果比較理想,但若想在臨床前實驗中較為可靠地評估新輔助治療療效和最佳治療時機,則需進一步研究微環(huán)境中免疫細胞的數(shù)量和功能對聯(lián)合ICI 和NAC 結(jié)果的影響,而免疫人源化的異種移植小鼠模型則是進一步探究的首選動物模型。本研究也通過構(gòu)建免疫人源化的異種移植小鼠模型發(fā)現(xiàn)CD8+PD-1+T 細胞水平與后續(xù)治療積極結(jié)果密切相關,具體而言,外周血中CD8+PD-1+T 細胞的變化可以預測腫瘤微環(huán)境的重編程,進一步有助于確定手術的最佳時間。

4 CAR-T 免疫療法的臨床前研究

嵌合抗原受體修飾T 細胞(chimeric antigen receptor modified T cells,CAR-T cells)療法是一種過繼性細胞免疫治療。該療法是用基因工程合成受體轉(zhuǎn)導患者T 細胞以靶向癌細胞表面抗原,進而介導抗腫瘤作用。CAR-T 目前主要應用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤[32],而在NSCLC 等實體瘤中效果不甚顯著,其原因是大多實體瘤的腫瘤相關抗原(tumorassociated antigen,TAA)靶標在覆蓋率和特異性方面呈現(xiàn)出異質(zhì)性,即大多實體瘤無真正的腫瘤特異性抗原。

為了更好地將CAR-T 療法應用于實體瘤,需選擇和確定具有相對廣的覆蓋率和較強的特異性的靶標。在早期研究中發(fā)現(xiàn),LunX (即BPIFA1、PLUNC、SPLunc1)在肺癌細胞中高度表達[33]。前期細胞實驗中,使用LunX 抗體可以通過誘導LunX表達下調(diào)和阻斷LunX 下游通路抑制LunX 陽性的肺癌腫瘤細胞生長[34],因此研究人員構(gòu)造了以LunX 為靶標的CAR-T 細胞進行深入研究[35],同時構(gòu)建Hu-PDX 模型對其療效進行評估,與PBS 組以及非特異性靶標CAR-TCD19比較發(fā)現(xiàn)CAR-TLunX療法不僅可以減緩腫瘤引起的小鼠體重減輕的癥狀,而且有效延長荷瘤小鼠的生存時間,通過Log-rank時序檢驗分析可得出CAR-TLunX療法大大提高了荷瘤小鼠存活率的結(jié)論。為了進一步研究其潛在的治療機制,研究者進行了免疫熒光分析,結(jié)果顯示CAR-TLunX在首次治療7 d 后可以充分滲透進入PDX 腫瘤模型內(nèi)部,進而實現(xiàn)對腫瘤細胞有效的殺傷。因此,異種移植小鼠PDX 模型為開展大量此類靶標檢測實驗[36]以及研究新型CAR 如可轉(zhuǎn)換CAR、抑制性CAR、靶向雙TAA 的CAR 等提供了平臺[37-40]。

5 納米藥物臨床前評估

除免疫治療和手術治療外,化療仍是臨床上使用較為廣泛的延長非小細胞肺癌患者生存率的手段,但傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物缺乏對腫瘤細胞的特異性,其伴隨產(chǎn)生的細胞毒素則較易誘導機體產(chǎn)生耐藥性。納米靶向藥物是一種以納米材料作為藥物載體,通過對其表面進行修飾,使其可特異性靶向選擇腫瘤細胞,對于提高藥物的利用率以及減少對正常組織細胞損傷有著重要的意義。而其在研究過程中,需要大量人源化模型對其治療效果以及適宜人群進行評斷。

含釓金屬富勒醇是一種新型納米藥物,其微粒直徑約為1 nm,主要特點是能夠在各種pH 濃度中通過非共價鍵凝集成為20～120 nm 的顆粒藥物,可抑制多種腫瘤活性。中國人民解放軍總醫(yī)院尹東濤[41]課題組通過構(gòu)建Hu-PDX 模型對含釓金屬富勒醇納米藥物的生物安全性以及對不同類型非小細胞肺癌作用效果差別進行研究,結(jié)果顯示含釓金屬富勒醇對生長速度相對緩慢的鱗癌有較好的抑制效果(80.34%,P<0.01),而對大細胞肺癌抑制效果則相對較弱(53.26%,P<0.05),但總體治療效果要優(yōu)于單純順鉑治療(33.86%,P<0.05)。同時,在模型構(gòu)建過程中發(fā)現(xiàn)[42],鱗癌的構(gòu)建成功率要略高于腺癌,而患者性別、吸煙史、腫瘤分化程度、TNM 分期、移植方法對肺癌PDX 模型成功率均無顯著性影響。

此外,納米技術也開始和其他治療手段聯(lián)合達到靶向治療的目的。如KRAS/TP53突變是導致肺腺癌出現(xiàn)的主要原因,因此抑制KRAS致癌基因和恢復p53 功能是肺腺癌最有力的治療策略。Gu等[43]通過核糖核酸RNAi 與納米技術結(jié)合構(gòu)成LbL模式藥物,靶向作用于KRAS/TP53,致力于探究該方案可行性。研究人員通過構(gòu)建原位異種移植小鼠模型Hu-PDX 研究腫瘤治療效果,結(jié)果顯示該治療藥物在荷瘤小鼠的肺中優(yōu)先攝取,且用LbL 模式藥物治療的小鼠其中位生存期達23.5 d,與任何單獨的核糖核酸治療(中位生存期9.0 d)或順鉑治療(中位生存期15.5 d)相比,可觀察到明顯增強的抗腫瘤功效和延長的存活時間,進一步的分子實驗證實了該模式藥物可降低單純順鉑治療帶來的肝毒性和腎毒性的影響。因人源化異種移植小鼠模型可高度擬和人體病變經(jīng)過,故其應用顯示出LbL 模式藥物在肺腺癌治療上具有直接的轉(zhuǎn)化潛力,有望進入臨床試驗階段。除核糖核酸可與化療藥物結(jié)合起到靶向治療的作用外,美國丹娜-法伯癌癥研究所在一項國際性NSCLC 臨床試驗中使用了一種名為trastuzumab deruxtecan 的抗體偶聯(lián)藥物[44],該藥物將化療藥物與高度靶向HER2基因突變的抗體相結(jié)合對患者進行治療,結(jié)果顯示超過一半的帶有HER2基因突變的非小細胞肺癌患者體內(nèi)的腫瘤在較長的一段觀察期內(nèi)停止生長,甚至出現(xiàn)縮小的現(xiàn)象,進一步表明了抗體偶聯(lián)藥物的治療前景。而該藥物的進一步療效評估可通過免疫系統(tǒng)和腫瘤雙人源化的動物模型進行研究,以期為進入臨床試驗階段奠定良好基礎。

6 展望

目前有報道稱腫瘤干細胞是造成腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要細胞亞群[45],對于腫瘤的發(fā)生與發(fā)展起作用,但具體調(diào)節(jié)機制并不明確。目前已有團隊通過結(jié)腸癌患者的PDX 模型進行相關研究[46],力圖發(fā)現(xiàn)克服免疫抑制屏障的新方法,因此人源化模型或可在靶向腫瘤干細胞聯(lián)合免疫治療晚期肺癌,以及新輔助/輔助治療早期肺癌的臨床前研究中發(fā)揮不可替代的作用。此外,在免疫聯(lián)合化療、免疫聯(lián)合放療的臨床前研究階段所采用的腫瘤、免疫系統(tǒng)及治療抗體大多都是鼠源性的而非人源性的[47-48],與人體免疫相應的過程存在一定的差別,因此實驗結(jié)果雖有指導意義,但并不能充分證明其臨床應用價值和前景,需在進一步的臨床前研究中使用基于免疫系統(tǒng)人源化的小鼠異種移植模型則可能更加高度擬和臨床患者表現(xiàn),則可為治療方案的臨床轉(zhuǎn)化應用提供更加有力的證據(jù),如在三陰性乳腺癌的臨床前研究中,研究團隊通過構(gòu)建免疫系統(tǒng)人源化小鼠來比較免疫單藥治療和免疫聯(lián)合治療的效果差異,結(jié)果顯示OKI-179 和nivolumab 的組合比單獨使用nivolumab 顯著抑制腫瘤生長(TGI=77%),且OKI-179 的使用會增加腫瘤浸潤細胞的表達,與臨床患者表型具有顯著的一致性[49]。因此在非小細胞肺癌的相關研究中,也期望能夠通過免疫和腫瘤雙人源化的小鼠模型獲得有效的臨床前研究數(shù)據(jù),來加速新型治療藥物或新型治療方案的臨床轉(zhuǎn)化。

7 總結(jié)

基于免疫系統(tǒng)人源化小鼠在非小細胞肺癌研究中的應用正如火如荼的開展,關于肺癌的治療手段也在一步步的趨向于個體化。因此針對非小細胞肺癌的治療手段的臨床前分析也應該逐步向個體化治療、靶向治療邁進。選擇特異腫瘤標志物、搭建高效靶向轉(zhuǎn)運體、確定合理聯(lián)合治療給藥系統(tǒng)、制定合適免疫治療方案以及選取恰當新輔助/輔助治療的時機仍為目前尚待解決的棘手難題,需進行詳細的臨床前研究,以期獲得更加完善的實驗數(shù)據(jù)。

另外,雖現(xiàn)階段人源化小鼠模型在各種治療手段的臨床前評估體現(xiàn)了獨特的優(yōu)越性,但其也存在著各種亟待解決的問題,如B 細胞、NK 細胞重建水平不高、供體來源受限、不能完全擬合人體內(nèi)免疫微環(huán)境以及部分模型重建效果穩(wěn)定性不強等[11]。因此,我們研究室致力于進一步改進模型構(gòu)建方法中存在的一些問題,以期構(gòu)建更為完備有效的臨床前評估模型[28,50],幫助其進一步在非小細胞肺癌的治療研究中煥發(fā)新的活力。