基因編輯技術(shù)在我國畜牧業(yè)的研究進展

張格陽 張子敬 翟亞瑩 呂世杰 朱肖亭 朱進華 李崢 于翔 王紅利 施巧婷 閆祥洲 王二耀*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河南鄭州 450008；4.河南省動物檢疫總站，河南鄭州 450000；5.河南省郟縣紅牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，河南平頂山 467100）

基因編輯（geneediting）簡單講是通過對基因進行定點修飾、定位敲除以及插入目的基因片段來改變其特征和功能的技術(shù)。目前，鋅指核酸內(nèi)切酶（zincfingerendonuclease，ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物（transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TAL ENs）和新型基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是3 種主要基因編輯技術(shù)。近年來，基因編輯技術(shù)取得了喜人的進展，被越來越多的人熟知和關(guān)注。除了廣泛應用于人類生命科學研和及臨床應用外，在畜牧業(yè)也有應用。

畜牧業(yè)作為支撐我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的支柱之一，不僅是實現(xiàn)經(jīng)濟繁榮的重要內(nèi)容，也是發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)的關(guān)鍵途徑。高效精準的基因編輯技術(shù)為研究家畜的疾病機制和培育良好品質(zhì)品種家畜提供了強有力的“武器”。在治療家畜疾病方面,通過特定基因編輯技術(shù)在DNA 水平上使用能良好表達的基因來替換或補償致病基因突變，抑或是切除致病性基因,從而達到治療疾病的目的。在家畜遺傳育種方面，與傳統(tǒng)育種方式不同，在有一定安全性保障的同時，根據(jù)人們的不同需求，借助基因編輯技術(shù)在指定位置對基因?qū)嵤┒c編輯。一方面極大縮短了育種時間，另一方面也降低了育種過程中的人力、物力、財力成本[1]。

1 主要基因編輯技術(shù)

1.1 鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)

鋅指核酸酶（ZFN）：由DNA 識別域鋅指蛋白（Zinc-Finger Protein，ZFP）（負責識別）與DNA 切割域限制性核酸內(nèi)切酶FokI（負責切割）構(gòu)成。

機理：ZFN 作為人工合成的限制性內(nèi)切酶通過其鋅指DNA 結(jié)合域、DNA 切割域發(fā)揮作用。研究者通過改造DNA 結(jié)合域，靶向定位于不同的DNA 序列，再由DNA 切割域進行特異性切割。此外，ZFN 技術(shù)還可與細胞內(nèi)DNA 修復機制共同發(fā)揮作用，使研究者自由編輯基因組。

鋅指核酸酶（ZFNs）在基因靶向修飾方面起到促進作用，盡管如此，為了彌補鋅指基序與其靶序列間缺乏特異性缺陷，構(gòu)建大型文庫用來篩選能與靶點序列特異性結(jié)合的鋅指蛋白是必不可少的步驟。與此同時，該技術(shù)的弊端還有易脫靶、細胞死亡、額外突變等[2]。

1.2 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）技術(shù)

類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）：TALEN 為第二代基因組編輯核酸酶。TAL 效應因子（TALE）可以特異性結(jié)合目的序列，通過將一段人造TALE 與FokI 核酸酶連接起來，即組成了TALEN，一類具有特異性基因組編輯功能的強大工具。

與ZFNs 技術(shù)相比，因為TALEN 具有高度特異性，能與DNA 靶位點結(jié)合，大大降低了功能蛋白脫靶的幾率。并且與ZFNs 相比，TALEN 具有靈活性強、操作簡便、構(gòu)建更便捷、脫靶效應和細胞毒性低等優(yōu)勢。但裝配TALEN 模塊是一個高強度、費時、費力的過程。

1.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)

CRISPR 序列由眾多短而保守的重復序列（repeats）和間隔區(qū)（spacer）組成。間隔區(qū)是一些可變序列，其與先前入侵細菌基因組外的外源遺傳物質(zhì)的序列相對應。這些間隔序列儲存在細菌基因組內(nèi)，被看作是通過再感染來觸發(fā)降解入侵病毒DNA 的記憶機制。

機理：①具有核酸酶活性的Cas9 蛋白質(zhì)在sgRNA 引導下特異性地識別原間隔序列的相鄰序列。②Cas9 蛋白質(zhì)到達目標DNA 的指定部位后，發(fā)揮核酸酶作用，切斷DNA 雙鏈，引起雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB）。③雙鏈dna 盾斷裂后啟動細胞自我復原系統(tǒng)，利用非同源末端的連接復原（non-homologous end-joining，NHEJ）和同源重組修復（homology dependent repair，HDR）兩種方式的基因修復。研究人員可以導入外源基因，通過同源重組將目標基因重組為目標基因，并通過在接收細胞中表達外源基因來進行基因編輯。

CRISPR-Cas9 技術(shù)優(yōu)勢在于構(gòu)建和使用時非常簡單、方便和低成本，使用它可以用來同時瞄準多個基因的優(yōu)勢，可以逐條甚至批量檢測人類或動物基因組中的基因表達和互做情況,以明確基因的功能及調(diào)控網(wǎng)絡。但易脫靶一直是CRISPR-Cas9 技術(shù)亟待解決的問題。

2 基因編輯技術(shù)在畜牧業(yè)上的應用

基因編輯技術(shù)為畜牧業(yè)發(fā)展做出了極大貢獻。在改良生產(chǎn)性能方面，基因編輯技術(shù)通過改造動物基因組，大力改良畜禽經(jīng)濟性狀，加快生長速度，提高飼料利用率等。在改善肉質(zhì)方面，為達到人們對肉質(zhì)的需求，基因編輯方法既可以降低動物脂肪量，也可以降低其肌肉質(zhì)量；在提高家畜抗病力方面，開發(fā)具有抗藥性的新物種，增加動物基因適應性，減少抗生素使用，促進人類健康和環(huán)境保護的研究；在構(gòu)建疾病模型方面，轉(zhuǎn)基因動物的應用既能開發(fā)人類疾病模型，也有助于理解疾病的運作機理和治療方法。

2.1 豬

全世界第一例POSA26 定點基因敲入豬模型來源于2014 年Li 等采用了TALEN 介導的基因敲入技術(shù)獲得的結(jié)果[3]。賴良學等開發(fā)了ZFN 和TALEN 靶向技術(shù)，并將其應用于豬基因組修飾中[4]。該研究小組通過ZFN 獲得了PPARγ 基因敲除豬。研究小組又使用TALEN 技術(shù)將一對外來loxp 引入豬基因組的ROSA26 位點，可以將任意的基因通過重組酶介導插入到ROSA26 的位點處，并且在豬組織中實現(xiàn)目標基因的無差異表達。Yang 等用ZFN 技術(shù)分別得到敲除GGTA1（α 1,3-galactosyltransferase）基因和PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）基因的克隆豬，并且在原代細胞中觀察到雙等位基因失活的比率達到1%，這比之前同源重組的打靶效率高10000 倍[5]。中國科學院動物研究所周琪等研究團隊構(gòu)建了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，利用“一步法” 直接將切割v WF 基因的CRISPR-Cas9 系統(tǒng)注射到豬受精卵中，該方法非常便利、安全和高效[6]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除豬以及相應的宿主細胞中CD163 全蛋白或者是病毒互相作用的SRCR5 區(qū)基因，可以使其對I 型和II 型的PRRSV 分離株產(chǎn)生抵抗力。2018 年，華南農(nóng)業(yè)大學吳珍芳帶領的團隊將CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)與體細胞核移植（Somatic Cell nuclear transfer，SCNT）相結(jié)合，獲得了一頭敲除CD163 基因的杜洛克豬[7]。2018 年，研究人員利用CRISPR/Cas9 將靶向非洲豬瘟（ASFV）磷蛋白p30（ASFV-p30）導入病毒體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由ASFV 引起的空斑完全消失，且毒力下降4 個數(shù)量級。2014 年，Hai 等通過卵顯微注射和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)組合的辦法成功獲得血管性血友病因子（vWF）雙等位基因敲除的小型豬[8]。Yu 等利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得了可用于研究杜興氏肌肉營養(yǎng)不良癥（Duchenne Muscular Dystrophy，DMD）基因敲除肌營養(yǎng)不良癥疾病模型[9]。Zhou 等采用顯微注射技術(shù)，分別將豬酪氨酸酶基因、PARK12 基因以及PINK1 基因的gRNA 和Cas9 調(diào)至豬成纖維細胞中，順利獲得敲除這些基因后的純合子細胞[10]。并且把經(jīng)人工篩選出來的敲除酪氨酸酶基因純合子當做供體，經(jīng)由體細胞核移植后得到因敲除酪氨酸酶基因本應為黑色的表現(xiàn)為白的版納豬。研究人員利用CRISPR/Cas9 技術(shù)也在豬成纖維細胞中成功進行了肌肉生長抑制素基因敲除，為建立基因敲除的克隆豬和新豬種培育打下了基礎。2015 年，Cui 等利用ZFNs 技術(shù)成功敲除了豬的生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）基因，該試驗為進一步研究人類侏儒綜合征提供了理想的動物模型[11]。

2.2 牛、羊

張存芳研究表明，利用ZFN 技術(shù)將雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）引入羊肌肉生長抑制素（MSTN）基因，誘導細胞自身固有的非同源末端（non-homologous end-joining，NHEJ）修復途徑提高MSTN 基因敲除效率，為通過胚胎工程手段獲得產(chǎn)肉性能高的轉(zhuǎn)基因家畜奠定基礎[12]。利用ZFN 在牛中高效產(chǎn)生MSTN 雙等位基因突變[13]。

MSTN 屬于TGF-β 超家族，抑制肌肉細胞生長。Luo 等利用組裝后的ZFN 來破壞編碼肌肉生長抑制蛋白的牛MSTN 基因，同時又采用ZFN 技術(shù)誘導基因靶向策略，突變頻率約為20%，雙等位基因突變效率為8%，通過SCNT 成功獲得了來自黃牛的MSTN 基因靶向成纖維細胞克隆牛[13]。在牛、山羊和豬的細胞基因中導入特異的自然突變體和單核苷酸多態(tài)性（SNP），是Tan 等在2013 年利用TALEN 技術(shù)和同源重組做的研究，如把Celtic 牛的無角基因POLLED 導入有角的奶牛，將豬、羊的Pc、GDF8、p65 和LDLR基因引入SNP 等[14]。

選定以山羊成纖維細胞進行試驗后，Ni 等以山羊MSTN 基因、核孔蛋白（NUP）基因、病毒蛋白（PrP）基因以及β-乳球蛋白（BLG）基因為對象設計了gRNAs，并且依據(jù)CRISPR/Cas9 技術(shù)同時編輯了4個基因，敲除細胞雙等位基因MSTN 后，又經(jīng)過體細胞核移植手段成功獲得基因敲除后的山羊后代[15]。中國農(nóng)業(yè)大學呼銳利用CRISPR/Cas9 技術(shù)將Cas9 mRNA 和sgRNA（Single Guide RNA）注射到原核，成功生產(chǎn)出FGF5 基因敲除羊[16]。

3 基因編輯技術(shù)的發(fā)展與應用前景

基因編輯技術(shù)解決了家畜育種周期長和遺傳資源少等問題，大大縮短了育種周期，降低育種成本，迅速增加了遺傳多樣性。有了基因編輯技術(shù)的加持，畜禽基因功能的研究和轉(zhuǎn)基因育種變得更加高效。基因編輯技術(shù)彌補了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的整合隨機、遺傳不穩(wěn)定等缺陷。基因編輯技術(shù)前景廣闊，特別是CRISPR/Cas9 技術(shù)因為其簡單、高效、成本低等原因，越來越多地被研究人員認可、使用。采用基因編輯技術(shù)，我們也可以進行以下研究和應用：①基因遺傳功能和控制方面的基本生物研究；②為提高畜禽生產(chǎn)能力或者質(zhì)量而進行的轉(zhuǎn)基因育種；③轉(zhuǎn)基因生物反應器；④抗病育種；⑤人類疾病的轉(zhuǎn)基因模型；⑥作為異質(zhì)器官移植的供體。

基因編輯技術(shù)正在迅速發(fā)展，其缺陷也正在被研究和攻克?？傆幸惶?，基因編輯將極大促進轉(zhuǎn)基因技術(shù)在畜牧領域的應用。