黃精組培常見問題討論*

馬菁華，歐明燭，劉 芳，陳云飛，任啟飛

(貴州省植物園，貴州 貴陽(yáng) 550004)

黃精是百合科黃精屬(Polygonatum)多年生草本植物，也稱老虎姜、黃雞菜、雞頭黃精。黃精是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一，以其干燥根莖入藥，味甘性平，用于脾胃氣虛、口干食少、體倦乏力、肺虛燥咳、腰膝酸軟等病癥[1]。黃精的化學(xué)成分包括多糖、皂苷、生物堿、氨基酸、揮發(fā)油等[2-3]，除藥用外還加工成保健品、護(hù)膚品、飲料、蜜餞、飼料添加劑等[4-5]。隨著黃精應(yīng)用價(jià)值的開發(fā)，市場(chǎng)需求急劇增加，野生黃精的采挖遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求，同時(shí)也造成野生資源的枯竭和生態(tài)環(huán)境的破壞，急需開展黃精人工培育。

組培繁殖是以植物生理學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的新興技術(shù)，在離體條件下利用植物的器官、組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體等培養(yǎng)出新的植株。組培繁殖不受自然條件限制，節(jié)省空間，繁殖快、繁殖系數(shù)高，是解決黃精種源匱乏、繁殖效率低的有效手段。

1 黃精組培快繁進(jìn)展

對(duì)多花黃精(Polygonatumcyrtonema)的組培研究較多。周新華等以多花黃精根莖芽培養(yǎng)的無(wú)菌苗為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)3～4月采集的外植體有利于植株生長(zhǎng)和腋芽萌發(fā)，將根莖芽切成1份的無(wú)菌塊莖培養(yǎng)45天的效果最好[6]。沈?qū)毭鞯纫远嗷S精頂芽為外植體開展組培，一個(gè)頂芽可在6個(gè)月后獲得80株組培苗[7]。饒寶蓉等以多花黃精的種子為試材，成功開展黃精組培實(shí)生苗生長(zhǎng)影響研究[8]。呂煜夢(mèng)通過優(yōu)化外植體消毒和誘導(dǎo)不定芽條件，建立了黃精離體無(wú)菌體系，并研究了不定芽增殖影響因素[9]。劉劍東等研究初步確定了pH值、溫度、光照等環(huán)境影響因子[10]。王輝等以多花黃精種子無(wú)菌萌發(fā)后形成的幼芽為材料建立多花黃精高效再生體系，完成了從愈傷組織到生苗煉苗的完整環(huán)節(jié)，可為黃精產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供技術(shù)支持[11]。

也有少量其他種黃精的組培研究。鐘華等探索不同栽培基質(zhì)對(duì)滇黃精(P.kingianumColl.et Hemsl.)組培苗生長(zhǎng)的影響[12]。陸靜等以四川主載品種大葉黃精(P.kingianumColl.et Hemsl.var.grancd folium D.M.Liu et W.Z.Zeng，var.nov.)地下根莖芽為外植體進(jìn)行組培快繁體系的初步研究，能夠獲得大量組培苗，并發(fā)現(xiàn)6-BA在組培中起重要作用[13]。

2 黃精組培常見問題討論

由上文可知，利用黃精不同部位作為外植體研究黃精組培的成功案例很多，組培快繁技術(shù)已十分成熟。但不可否認(rèn)組培仍然面臨選擇哪個(gè)部位作為外植體，如何處理，怎樣搭配生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，煉苗條件等諸多問題，如何提高組培的效率，降低組培成本，仍需進(jìn)一步探索。目前，影響黃精組培效率的問題主要包括外植體污染、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的選擇、組培苗煉苗等。

2.1 外植體污染

2.1.1 污染現(xiàn)象的發(fā)生

組培首先面對(duì)的選擇是外植體。細(xì)胞分生能力、消毒難度、分化時(shí)間等影響到外植體的選擇，黃精可用作外植體進(jìn)行組培的部位包括根狀莖[14-15]、葉片[16-17]、嫩芽[7]、莢果[18]、種子[19-20]、種子萌發(fā)形成的初生根莖[10]、種子萌發(fā)的幼芽[11]等。無(wú)論用哪個(gè)部位來(lái)進(jìn)行組培，都有污染現(xiàn)象的發(fā)生。程強(qiáng)強(qiáng)等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)根莖芽包片的細(xì)菌不易消除，極易產(chǎn)生細(xì)菌污染[21]。根據(jù)孫駿威統(tǒng)計(jì)，以根狀莖為外植體進(jìn)行組培，處理4 d后開始細(xì)菌污染，之后開始真菌污染，6～10 d為污染高峰期[14]。不同外植體的污染程度也有差異，種子污染率在16%～64%[8]，根狀莖污染達(dá)34.6%～89.1%[9]，帶芽根狀莖污染率22%～53%[13]。

2.1.2 污染控制

組培建立在無(wú)菌條件之上，污染率嚴(yán)重影響組培進(jìn)行，因而外植體的消毒效果極為重要。研究人員開展了多種方式的消毒試驗(yàn)，前處理包括用洗潔精、洗衣粉、多菌靈等浸泡，流水沖洗，消毒程序包括酒精、升汞、次氯酸鈉、過氧化氫等試劑浸泡、無(wú)菌水涮洗等。經(jīng)過不同試驗(yàn)處理對(duì)比，分別找到針對(duì)不同部位的消毒方法。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過洗衣粉和多菌靈處理后根狀莖的污染率降低至34.6%，使用升汞消毒能進(jìn)一步降低污染率至14.0%，但褐化加重(67.2%)[22]。選擇新鮮黃精種子進(jìn)行組培繁殖時(shí)，外果皮是污染的主要來(lái)源，將果皮去除干凈，再用洗衣粉、多菌靈等浸泡、沖洗，之后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)消毒。選用70%酒精1 min，8% NaClO 10～15 min，0.1%HgCl210～15 min可將污染率控制在8%～12%[20]，或75%酒精30 s，0.1% HgCl25 min，隔天重復(fù)消毒一次，污染率也降低至11.6%[23]。表1對(duì)多種消毒方式及其效果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，可為外植體處理提供參考。

表1 外植體消毒方法及效果Tab.1 Disinfection methods and effects of explant

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的選擇

2.2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的作用

激素的使用可以刺激外植體分化形成愈傷組織或不定芽，又可以刺激無(wú)根苗生根，合理的激素搭配可以加速組培速率并增加繁殖系數(shù)，通過調(diào)整激素配比來(lái)控制培養(yǎng)物芽或根的形成以達(dá)到組培目的，幾乎是組培必須手段。細(xì)胞分裂素(6-BA、ZT、KT等)和生長(zhǎng)素(NAA、2，4-D等)是黃精組培中使用較多的激素。

王輝研究發(fā)現(xiàn)2，4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)十分必要[11]；呂煜夢(mèng)研究表明一定濃度的6-BA能促進(jìn)三明野生黃精不定芽的誘導(dǎo)[9]；劉劍東研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用細(xì)胞分裂素不利于叢生芽增殖和生長(zhǎng)，與生長(zhǎng)素組合使用效果更好[10]；程強(qiáng)強(qiáng)研究發(fā)現(xiàn)TDZ有利于誘導(dǎo)不定芽的增殖[21]；但激素使用濃度不可過高，否則易誘導(dǎo)出玻璃化的不定芽[14]。

2.2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的選擇

多數(shù)研究(表2)表明，適合黃精愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的激素配比為6-BA 2～4 mg/L+NAA 0.2～0.5 mg/L，或適量添加TDZ、2，4-D或GA3；不定芽增殖激素為6-BA 1～3 mg/L+NAA 0.2～0.4 mg/L，或適量添加2，4-D、GA3或IAA；生根激素為NAA 0.1～0.5 mg/L，或適量添加IBA、AC等[7-11，13-16，18，19]。

表2 黃精組培合適的激素配比Tab.2 Appropriate hormone proportions for tissueculture of Polygonatum

續(xù)表2

2.3 組培苗移栽煉苗

2.3.1 移栽煉苗必要性

組培苗生根后已是完整的植株，但組培為實(shí)際生產(chǎn)服務(wù)，仍需進(jìn)一步關(guān)注組培苗對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。由于組培苗一直培養(yǎng)在人為設(shè)定的較為適宜的環(huán)境中，且保持無(wú)菌狀態(tài)，生境單一，對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力很弱，為提高組培苗適應(yīng)性，應(yīng)將組培苗移栽至苗盤或室外進(jìn)行馴化煉苗。

2.3.2 移栽煉苗探索

研究者從組培苗出瓶狀態(tài)、栽培基質(zhì)、環(huán)境條件控制等多個(gè)方面對(duì)黃精組培苗煉苗進(jìn)行了試驗(yàn)(表3)。另外，煉苗還應(yīng)注意組培操作、瓶苗選擇及種植管理。繼代培養(yǎng)的次數(shù)通過影響芽體生根及根系長(zhǎng)勢(shì)進(jìn)一步可能影響煉苗成活率[6]，出新芽快生長(zhǎng)健壯的瓶苗更易成活[20]，種植深度以基質(zhì)表層為好，可提高多花黃精組培苗塊莖的成活率[8]。陸靜對(duì)組培苗設(shè)置了按天馴化的步驟，分5天逐步移至樹蔭下[13]；田懷研究發(fā)現(xiàn)根數(shù)過少或過多均不利于煉苗[19]。

表3 出苗情況及煉苗基質(zhì)對(duì)組培苗成活率影響Tab.3 Survival rate of tissue cultured seedlings

3 總結(jié)與建議

3.1 根據(jù)外植體不同，污染控制方法不盡相同，不同消毒試劑作用效力和針對(duì)性不同，單獨(dú)使用一種消毒試劑效果不佳。消毒時(shí)間同樣影響到消毒效果，時(shí)間短則污染率高，時(shí)間長(zhǎng)容易影響外植體活力，同時(shí)會(huì)伴隨褐化率升高。根莖芽、種芽、嫩芽、新葉等新生部位相對(duì)容易消毒，且易受消毒試劑影響而降低活力，因而采取2種試劑搭配消毒即可，但具體濃度和時(shí)間需要試驗(yàn)探索。而根莖、種子等外植體因?yàn)樯L(zhǎng)在地下或存儲(chǔ)時(shí)間較長(zhǎng)，沾染微生物較多而不易消毒，則應(yīng)進(jìn)行一定前處理再選擇消毒試劑消毒，才能達(dá)到理想效果。

3.2 6-BA和NAA在黃精組培中幾乎不可或缺，由于植物不同部位及不同生長(zhǎng)階段對(duì)激素的響應(yīng)不同，激素合理搭配才更有利于組培苗生長(zhǎng)。細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素以及赤霉素的使用誘導(dǎo)外植體在較短時(shí)間內(nèi)分化達(dá)到理想狀態(tài)，但試驗(yàn)條件的不同導(dǎo)致誘導(dǎo)率不盡相同，對(duì)比分析可知激素的使用暫未達(dá)到理想水平，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的探索道路依然較長(zhǎng)。

3.3 煉苗成功與否直接關(guān)系到組培苗能否進(jìn)行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，是非常重要的環(huán)節(jié)。煉苗之前應(yīng)將根部培養(yǎng)基洗凈，以防止?fàn)I養(yǎng)過度造成微生物繁殖過快對(duì)植株造成影響，初期還要噴灑多菌靈進(jìn)一步防止微生物。從上述文獻(xiàn)資料中可以看出煉苗成活率都在83%以上，且沙土搭配有機(jī)類物質(zhì)成活率更高。常用的栽培基質(zhì)主要有河沙、蛭石、珍珠巖、椰糠、草炭等。沙土松軟利于根系向下生長(zhǎng)，是煉苗的首選固定植株的載體，但沙土缺乏營(yíng)養(yǎng)，在基質(zhì)中還應(yīng)搭配椰糠、腐殖質(zhì)等有機(jī)類物質(zhì)可提高植株成活率，必要時(shí)還應(yīng)注意添加肥料元素。

影響組培苗馴化的因素還包括煉苗季節(jié)、溫濕度、光照度、光質(zhì)等。冬季氣溫低，組培苗生長(zhǎng)緩慢，需在人工可控的溫室進(jìn)行煉苗，夏季氣溫高則應(yīng)根據(jù)植物的習(xí)性選擇合適的遮光條件并注意補(bǔ)水。溫度以25 ℃左右為好，濕度需保持在80%以上，黃精是陰生型植物，光照不宜過強(qiáng)。