青海省祁連牦牛的母系遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

楊振菲,馬志杰，2，陳生梅，白詩睿，李廣禎，李文浩，李劍

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016;2.青海省高原家畜遺傳資源保護與創(chuàng)新利用重點實驗室，西寧 810016;3.青海省祁連縣畜牧獸醫(yī)站,祁連 810400)

牦牛是生活在青藏高原及其毗鄰高山、亞高山高寒地區(qū)的特有牛種,中國現(xiàn)有牦牛1500多萬頭，是世界上擁有牦牛數(shù)量和品種(類群) 最多的國家[1]。牦牛適應(yīng)能力強，在遺傳上是一個極為寶貴的基因庫，它能在空氣稀薄、氣候寒冷、牧草生長周期短的高寒生態(tài)環(huán)境中生長繁殖，并為牧民提供肉、乳、皮毛等生活必需品，是青藏高原牧民的重要生活和經(jīng)濟來源[2]。祁連縣隸屬于青海省海北藏族自治州，位于祁連山中部的群山峻嶺和山間盆地之中，縣境高山、丘陵、盆地和河谷錯縱分布，地貌類型多樣，適宜農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn),境內(nèi)平均海拔3169m，年平均氣溫1℃，全年無絕對無霜期，降水少，日照時間長，氣候干燥，年降雨量272.7～514mm，屬典型的高原大陸性氣候[3]。畜牧業(yè)是該縣的主要產(chǎn)業(yè)之一，牦牛是其寶貴的動物遺傳資源和優(yōu)勢種畜。據(jù)統(tǒng)計,祁連縣飼養(yǎng)牦牛達17萬頭,占全縣各類牲畜總數(shù)的14%，年產(chǎn)牛肉2766t、牛皮3.5萬張[4]。

線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)具有進化速率快、分子結(jié)構(gòu)簡單、重組性率低等特點，是開展哺乳動物遺傳多樣性、起源進化和分類等研究常用的分子遺傳標(biāo)記之一。mtDNAD-loop區(qū)是線粒體基因組中變異最豐富的區(qū)域，且在物種分子進化和分類中存在有效的變異信息，對探究動物的系統(tǒng)發(fā)育、遺傳分化、分類地位等具有重要作用[5]。在牦牛的母系遺傳研究中,賴松家等[6]測定分析了我國5個牦牛品種的mtDNAD-loop區(qū)全序列，共確定了24種單倍型,各品種總的單倍型多樣度為0.9697,單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系聚為2個聚類簇,表明牦牛D-loop區(qū)遺傳變異豐富，我國牦牛有2個母系起源或者有2個主要的馴化點。郭松長等[7]通過分析我國10個家牦牛品種D-loop區(qū)部分序列的遺傳變異，表明家牦牛具有豐富的母系遺傳多樣性，且牦牛品種間遺傳多樣性水平存在較大差異，其中環(huán)湖牦牛的單倍型多樣性最高,達0.985，而巴州牦牛單倍型多樣性最低,為0.800，推測青海省可能為家牦牛的馴化中心；聚類分析顯示我國家牦牛存在2個聚類簇，推測有2個母系起源。Wang ZF等[8]對405頭我國家牦牛與47頭野牦牛D-loop區(qū)進行綜合分析，結(jié)果表明我國家牦牛、野牦牛的單倍型多樣度分別為0.916和0.967；系統(tǒng)發(fā)育分析表明牦牛存在3個母系支系，其中Ⅰ、Ⅱ支系被家、野牦牛所共享，只有少量野牦牛分布于第Ⅲ支系。曾玉峰等[9]利用微衛(wèi)星DNA和mtDNA兩種分子標(biāo)記探究了甘肅省境內(nèi)6個牦牛品種/群體(瑪曲、碌曲、夏河、天祝和肅南牦牛)的遺傳多樣性,對其240頭牦牛的mtDNA D-loop序列測序分析共確定41種單倍型，單倍型多樣度在瑪曲、碌曲牦牛群體中都較高，其值均在0.900以上，但在天祝白牦牛群體中較低(0.662)；構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中6個牦牛群體分為明顯的2支，表明其有2個母系起源。在西藏牦牛的母系遺傳研究中，宋喬喬等[10]對8個西藏牦牛群體(即日多、類烏齊、丁青、錯那、隆子、仲巴、聶榮和申札牦牛)共328頭個體的mtDNA D-loop區(qū)序列進行群體遺傳分析，共檢測出91種單倍型,平均單倍型多樣度為0.884，核苷酸多樣度為0.010,表明西藏牦牛具有較豐富的遺傳多樣性， 但和野牦牛的遺傳多樣性相比較低；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示西藏牦?？煞譃?大類。在四川牦牛的母系遺傳研究中，官永強等[11]對四川省的4個牦牛品種(即昌臺、金川、木里和麥洼牦牛)與西藏、青海、新疆等地的品種(類群)以及野牦牛進行綜合分析，結(jié)果顯示昌臺牦牛在四川4個品種中具有最高的單倍型多樣度(0.883)和核苷酸多樣度(0.017);進化樹分析顯示四川牦牛及其他地區(qū)牦牛品種(群體)具有明顯的2個支系,昌臺牦牛和金川牦牛與九龍、達日、大通、天祝、西藏、玉樹牦牛具有較近的遺傳關(guān)系。Yue XP等[12]對我國13個家牦牛、野牦牛品種(群體)共742條D-loop序列進行綜合分析，表明在家牦牛中大通牦牛單倍型多樣度最高(0.945)，而環(huán)湖牦牛的單倍型多樣度最低(0.785)。李瑞哲等[13]通過D-loop區(qū)序列變異對雪多牦牛的母系遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)雪多牦牛單倍型多樣度為0.900，核苷酸多樣度為0.012，且有2個聚類支系，表明雪多牦牛具有豐富的母系遺傳多樣性，擁有2個母系起源。李廣禎等[14]對31條門源白牦牛和235條天祝白牦牛的D-loop序列進行了綜合分析，共確定了56種單倍型，其中門源白牦牛擁有特有單倍型7種,天祝白牦牛包含特有單倍型43種；天祝白牦牛單倍型多樣度(0.946)高于門源白牦牛(0.862)，但均由2個母系支系組成,提示白牦牛有2個母系起源。Wang XD等[15]對青海省4個牦牛品種(群體)(即雪多、環(huán)湖、祁連和玉樹牦牛)共86頭個體線粒體基因組進行了測序，結(jié)合國內(nèi)其他牦牛品種(群體)相應(yīng)序列對牦牛母系遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育進行了分析，表明雪多牦牛的單倍型多樣度最高(0.992)，而環(huán)湖牦牛的單倍型多樣度最低(0.905)，進一步證實牦牛由3個不同的母系支系組成，且發(fā)現(xiàn)雪多牦牛和野牦牛少量個體共存于第3個母系分支。

綜上所述，當(dāng)前研究者已基于mtDNA序列變異對我國多個牦牛品種(群體)進行了母系遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育等分析[6-15]。盡管當(dāng)前已有基于小樣本對祁連牦牛母系遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析的研究報道[15]，但其不足以準確地反映其母系遺傳多樣性水平和群體結(jié)構(gòu)組成。鑒于此，本研究基于較大樣本量對祁連牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列遺傳變異進行系統(tǒng)分析，深入探究其母系遺傳多樣性水平、群體遺傳結(jié)構(gòu)組成及母系遺傳背景，以期為今后開展祁連牦牛的保種和選育研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1樣品采集、基因組DNA提取與Genbank中數(shù)據(jù)下載

采用頸靜脈采血法在青海省祁連縣默勒鎮(zhèn)共采集33頭牦牛的頸靜脈血樣，采樣前詢問牧戶有關(guān)牦牛群的選育背景信息并查閱系譜記錄，采用分戶采樣方式，確保樣品間無親緣關(guān)系且具有代表性。使用血液基因組DNA提取試劑盒(艾德萊生物科技有限公司，北京)提取基因組DNA，后-20℃保存?zhèn)溆?。從Genbank數(shù)據(jù)庫中下載已報道的22條祁連牦牛mtDNAD-loop序列(GenBank No.∶MW414121-MW414142)用于后續(xù)綜合分析。

1.2引物合成、PCR擴增和測序

參照野牦牛研究中運用的引物信息[16]，由上海生工生物工程有限公司合成1對引物用以擴增祁連牦牛的mtDNA D-Loop區(qū)序列，其中上游引物(PF)為:5＇-GTAAAGAGCCTCACCAGTAT- 3＇，下游引物(PR)為:5＇-TCCTCTAGCCATTGACTAT-3＇。

PCR反應(yīng)體系(25μL)為：2×Prime STAR Max Premix (上海寶生物公司) 12.5μL，上、下游引物各1μL，基因組DNA為1μL，超純水9.5μL，共計25μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性4min；95℃變性1min，62℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；后72℃延伸10min。對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后送膠回收純化產(chǎn)物至北京擎科生物有限公司進行測序。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

將測序結(jié)果使用Chromas 2.3軟件進行校對，后用BioEdit7.2.5軟件進行多序列比對分析，再用DnaSP5.10.01、Arlequin3.11軟件得到祁連牦牛群體的多態(tài)位點和單倍型數(shù)目，確定各單倍型(單倍型組)的頻率，計算群體的單倍型多樣度和核苷酸多樣度大小以揭示其遺傳多樣性水平和群體結(jié)構(gòu)組成。用Mega5軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建單倍型(組)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以揭示祁連牦牛的母系支系組成和遺傳背景。

2 結(jié)果與分析

2.1祁連牦牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳變異分析

對33條本研究測定的序列和22條Genbank中下載的序列共55條祁連牦牛的mtDNA D-loop區(qū)序列進行多序列比對分析，獲得有效分析序列長度為692 bp,其中T、C、A、G四種核苷酸的含量分別為28.03%、24.49%、32.25%和15.23%，A+T含量為60.28%，G+C含量為39.72%。序列比對分析排除2處插入/缺失后共檢測到33處多態(tài)位點，占所分析序列長度的4.77%。在33處多態(tài)位點中，3處(即247、314和440位點)為單一多態(tài)位點，占分析序列長度的0.43%；30處為簡約信息位點，分別為109、116、134、141、157、172、187、193、220、248、249、255、256、266、275、292、295、308、309、310、316、325、328、333、355、390、391、397、500和538位點，占分析序列長度的4.34%。所有突變位點均為兩核苷酸之間的變異(圖1)。

“.”代表與H1單倍型序列中的核苷酸相同；N代表分享同一種單倍型的個體數(shù)；Hg代表單倍型組類型圖1 祁連牦牛mtDNA D-loop區(qū)17種單倍型序列核苷酸變異、頻率及單倍型組類型

2.2祁連牦牛母系遺傳多樣性分析

55條祁連牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列分析共確定了17種單倍型，其中單倍型H2由19個個體共享，為優(yōu)勢單倍型，單倍型H4、H6和 H7分別由6、5、7個個體共享，單倍型H12由3個個體共享,單倍型H10、H11和H13均由2個個體共享，其余的單倍型均只在一個個體中出現(xiàn)。計算結(jié)果表明，祁連牦牛群體的單倍型多樣度為0.850±0.037，核苷酸多樣度為0.016±0.008,平均核苷酸差異K值為8.04。

將祁連牦牛的遺傳多樣性指數(shù)值大小與已報道的野牦牛群體及我國其他17個家牦牛品種相應(yīng)數(shù)值進行比較分析(表1)，結(jié)果表明：相比野牦牛及大通、青海高原、天祝等其他家牦牛品種，祁連牦牛群體單倍型多樣度值(0.850)和核苷酸多樣度值(0.016)均較低，表明祁連牦牛遺傳變異不太豐富，母系遺傳多樣性水平較低。

表1 祁連牦牛與野牦牛及我國17個家牦牛品種母系遺傳多樣性指數(shù)值大小比較

2.3祁連牦牛系統(tǒng)發(fā)育分析

以美洲野牛(GenBank No.:EU177871)為外群,基于NJ法構(gòu)建祁連牦牛群體不同單倍型(組)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(圖2)。聚類結(jié)果表明：祁連牦牛的17種單倍型共聚為2個分支，其中單倍型H2、H4、H5、H6、H8、H9、H10、H14、H16和H17聚為一支(即支系Ⅰ),單倍型H1、H3、H7、H11、H12、H13和H15聚為另一支(即支系Ⅱ)。17種單倍型分別屬于A、B、C、D和E 5種單倍型組，分別占35%(6/17)、12%(2/17)、29%(5/17)、12%(2/17)和12%(2/17)。

圖2 基于NJ法(i和ii)構(gòu)建的祁連牦牛母系單倍型(組)間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及支系組成

3 討論

遺傳多樣性是物種進化與分化的基礎(chǔ)，是組成生物多樣性不可或缺的一部分。單倍型多樣度和核苷酸多樣度大小能夠反映動物群體遺傳變異的豐富程度，進而可評定其遺傳多樣性水平。在一個動物群體中，如果它的單倍型多樣度和核苷酸多樣度值越高，則它的遺傳變異越高，遺傳多樣性就愈加豐富。在青海牦牛的父系群體遺傳研究中,Ma ZJ等[22]對9個青海牦牛品種(群體)(即唐古拉山、天峻、曲麻萊、祁連、郭勒木德、崗龍、雪多、環(huán)湖和大通牦牛)的Y染色體單倍型多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，祁連牦牛的父系遺傳多樣性較低(0.280±0.100)。在本研究母系遺傳研究中,祁連牦牛群體的單倍型多樣度為0.850±0.037，核苷酸多樣度為0.016±0.008,表明其母系遺傳多樣性也較低，這與Ma ZJ等[22]對其父系遺傳的研究結(jié)果一致。在先前對野牦牛的母系遺傳研究當(dāng)中，野牦牛的單倍型多樣度在0.957～0.967之間[7-8，12.16]，擁有豐富的母系遺傳多樣性。而我國部分家牦牛的母系遺傳多樣性分析表明：家牦牛品種(群體)間存在較為顯著的遺傳分化，無明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)，遺傳多樣性豐富，其單倍型多樣度在0.621～0.985之間[6-8,11-14，16-21]。在本研究中，祁連牦牛群體的單倍型多樣度(0.850±0.037)和核苷酸多樣度(0.016±0.008)值與上述其他牦牛品種(群體)(如野牦牛及環(huán)湖、大通、青藏高原、玉樹、雪多、金川、麥洼、昌臺、九龍、木里、嘉黎、天祝、甘南、帕里、類烏齊、斯布、巴州、中甸牦牛)相比，其單倍型多樣度和核苷酸多樣度值均較低，進一步表明其遺傳變異較小，母系遺傳多樣性水平較低。究其原因，可能與祁連牦牛的生存環(huán)境、選育程度、遺傳漂變等因素有關(guān)，其具體原因有待今后作進一步深入研究。

家畜的起源和系統(tǒng)發(fā)育研究可以明確其進化歷史和遺傳背景，對其選育、保護和開發(fā)利用至關(guān)重要。先前，大多數(shù)關(guān)于我國家、野牦牛品種(群體)的系統(tǒng)發(fā)育研究顯示，牦牛擁有2個母系支系，推測其有2個母系起源[6，7,9-11,13，14，18-20]。然而，近年來部分系統(tǒng)性的研究表明，家牦牛、野牦牛均擁有3個母系支系，推測牦牛有3個母系起源。如Wang ZF等[8]檢測了405頭家牦牛與47頭野牦牛mtDNA D-loop區(qū)及蛋白編碼基因序列變異，聚類分析顯示牦牛有3個高度分化的遺傳分支，其中2個分支中有家、野牦牛的分布，而另一個分支中僅有少量野牦牛分布。Wang XD等[15]對青海省4個牦牛品種(群體)共86頭個體線粒體基因組進行測序，結(jié)合國內(nèi)其他牦牛品種(群體)相應(yīng)序列對其系統(tǒng)發(fā)育進行分析，進一步證實牦牛由3個不同的母系支系組成，且發(fā)現(xiàn)雪多牦牛和野牦牛少量個體共存于第3個母系分支。與此同時，Ma ZJ等[16]基于野牦牛mtDNA D-loop區(qū)和全線粒體基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示野牦牛聚為3個母系支系，表明其有3個母系起源。在本研究中，祁連牦牛的系統(tǒng)發(fā)育分析聚類關(guān)系圖中(圖2)，17種單倍型分為2個大的母系支系，說明祁連牦牛具有2個母系起源，這與先前研究者對其他家牦牛品種(群體)母系遺傳背景的研究結(jié)果相似[6-7,9-11,13-14，18-20]。