牛乳溯源研究進(jìn)展

孫璐，崔占鴻

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

隨著食品貿(mào)易的全球化，食品的可追溯性和真實性變得越來越困難。利用分析工具來明確食品及其衍生產(chǎn)品的來源和成分真實性對消費者而言十分重要[1]。確定乳及乳制品地理來源對保護(hù)消費者利益至關(guān)重要，原產(chǎn)地溯源是根據(jù)物質(zhì)結(jié)構(gòu)中的水平，應(yīng)用化學(xué)、生物分子和同位素方法來獲得目標(biāo)信息[2]。產(chǎn)地溯源技術(shù)有很多，包括電子鼻、穩(wěn)定同位素技術(shù)、礦物多元素指紋分析、單核苷酸多態(tài)性、高效液體色譜(HPLC)及脂肪酸和氨基酸的碳氮同位素組成等[3]。農(nóng)產(chǎn)品中的礦物質(zhì)元素和穩(wěn)定同位素受加工工藝和貯藏時間影響較小，且相對穩(wěn)定，可用于確定農(nóng)產(chǎn)品的地理來源[4]。另外，計算機模式識別分析已成為地理溯源過程中必不可少的工具，通過多個可測量的變量，可以對不同地理來源的食品樣品進(jìn)行分類。模式識別主要包括判別、主成分、因子和聚類等分析。選擇分類技術(shù)的合適與否，取決于多種因素，包括對標(biāo)準(zhǔn)定義、樣本均勻度、輸入變量的數(shù)量和樣本數(shù)量等。通常的做法是應(yīng)用一種以上的分析技術(shù)并評估它們對所研究問題的適用性[5]?？傊称钒踩蛽郊俚蔫b別成為居民生活中最關(guān)注的問題之一，對產(chǎn)品成分和地理來源的確認(rèn)，對保護(hù)生產(chǎn)者和消費者免受欺詐是十分必要的。對能夠可靠地表征典型乳制品，并追溯其生產(chǎn)區(qū)域分析工具的需求非常突出，可以采用各種現(xiàn)有的分子和計算機技術(shù)實現(xiàn)認(rèn)證的目的。

乳及乳制品被列為均衡健康飲食的重要元素，牛乳為機體提供了必要的能量和營養(yǎng)，確保機體的正常生長和發(fā)育，尤其對于骨骼的形成至關(guān)重要。在預(yù)防心血管疾病、部分癌癥、肥胖和糖尿病等多種慢性疾病方面牛乳也具有積極作用。牛乳富含免疫球蛋白、乳鐵蛋白、肽類、肌苷酸等多種與機體健康和代謝密切相關(guān)的生物活性物質(zhì)。牛乳中的乳鐵蛋白能夠抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤及降低慢性疾病的風(fēng)險有關(guān)[6]。牛乳是最早進(jìn)行摻假的產(chǎn)品之一，可以通過在原乳中添加化合物改變其成分，以不同的形式殘留在乳中，對消費者的健康造成危害。例如，添加三聚氰胺以增加蛋白含量，乳及其制品中殘留的三聚氰胺會影響腎臟，甚至造成機體死亡。乳的營養(yǎng)品質(zhì)與品種、動物個體代謝水平、季節(jié)、健康狀況、營養(yǎng)水平和擠奶次數(shù)均會導(dǎo)致牛奶代謝物譜的改變。不同的代謝譜將在牛乳指紋鑒別過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，通過指紋分析技術(shù)對牛奶質(zhì)量控制及來源的標(biāo)記對消費者和乳制品行業(yè)都有好處。

1 牛乳營養(yǎng)成分

1.1蛋白質(zhì)

乳蛋白是人類營養(yǎng)優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源，含量約占牛乳的3%左右，主要由高豐度蛋白和低豐度蛋白構(gòu)成，其中高豐度蛋白以酪蛋白為主。而低豐度蛋白主要包括乳清蛋白，乳脂肪球膜蛋白及乳鐵蛋白等[7]。隨著各研究領(lǐng)域的不斷深入，大量的牛乳蛋白質(zhì)已經(jīng)被確定對健康有很大的益處，例如抗癌蛋白(β-乳球蛋白、乳鐵蛋白、α-乳清蛋白)、抗高血壓蛋白(α-嗎啡樣肽、β-嗎啡樣肽、β-lactosin B 和酪蛋白衍生的乳三肽)；免疫調(diào)節(jié)蛋白(如乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、牛奶生長因子、免疫球蛋白G)[8]。另一方面，牛奶蛋白過敏是兒童中一種常見的疾病，屬于IgE介導(dǎo)的Ⅰ型過敏反應(yīng)，可能會引起呼吸道癥狀、濕疹、蕁麻疹或腹瀉[9]。兒童作為乳品消費鏈中的特別關(guān)注對象，乳品成分安全及產(chǎn)地來源對其健康而言十分重要。因此，牛乳及其制品的可溯源問題值得重視。

1.2氨基酸

氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本單位，是一類含有氨基和羧基廣泛存在于自然界的小分子化合物，可分為非蛋白質(zhì)氨基酸和蛋白質(zhì)氨基酸[10]。牛乳蛋白質(zhì)由血漿中的游離氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和葡萄糖合成，血漿中游離氨基酸譜的改變也會影響牛乳中的游離氨基酸譜，機體內(nèi)的氨基酸濃度隨著泌乳期而逐漸降低[11]。氨基酸與區(qū)域之間存在一定的相關(guān)性，來自不同地區(qū)的牛乳營養(yǎng)成分存在一定差異，如氨基酸和寡肽可作為生物標(biāo)志物來識別產(chǎn)地名稱保護(hù)認(rèn)證的(PDO，Protected Designation of Origin)奶酪和非 PDO 奶酪[12]。氨基酸與蛋白質(zhì)的追溯分析和肽的定量有關(guān)。

1.3脂肪

脂肪是一種營養(yǎng)元素，是人體非常重要的組成部分，大多數(shù)脂肪由甘油和脂肪酸構(gòu)成，粗脂肪還含有磷脂，固醇類(甾醇)等[13]。乳脂的含量和組成主要受奶牛攝入的日糧性質(zhì)影響，導(dǎo)致牛乳中的脂肪酸譜隨飼料的不同而改變[14]。農(nóng)戶可以通過管理奶牛的營養(yǎng)水平來顯著改變牛奶的揮發(fā)性脂肪酸含量，日糧中的新鮮牧草會提高不飽和脂肪酸，如 α-亞油酸和 CLA)的濃度，降低飽和脂肪酸(SFA)的含量，同時添加干草或青貯飼料會增加牛奶中SFA的比例。此外，與冬季相比，夏季乳脂的總 SFA 濃度通常較低，因為夏季飼料作物的多不飽和脂肪酸含量較高[15]。綜上所述，母畜飼料結(jié)構(gòu)組成中某些微量營養(yǎng)素和脂肪酸濃度的改變是改變?nèi)槠焚|(zhì)的有效手段，也正因如此，越來越多的消費者將動物飲食視為判斷產(chǎn)品質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)。牛乳及其制品中的脂肪酸也可以作為溯源過程中的一個追蹤物。

1.4維生素

維生素是機體必需的七大營養(yǎng)素之一，在食物中雖然含量較少，但種類較多，化學(xué)結(jié)構(gòu)也不相同。維生素共有13 種營養(yǎng)素，包括4種“脂溶性”和9種“水溶性”，這些維生素對于維持健康的體內(nèi)平衡和代謝功能都是必不可少的。不同品種和來源的乳及制品中的部分維生素含量存在差異。Rahat Ullah[16]等基于 β-胡蘿卜素和維生素A 熒光光譜結(jié)合多元技術(shù)鑒定了牛奶和水牛奶，有效地測定了牛奶和其他乳制品中的摻雜物。Naveed Ahmad[17]等,通過用熒光光譜法，基于維生素 A、E、K、D 和 CLA 的光譜特征，繪制加載向量得到驗證，從而區(qū)分鑒定了牛和水牛酥油。

1.5礦物質(zhì)

礦物質(zhì)即無機鹽，機體無法自己合成，只能通過食物獲得[18]。牛乳中的礦物質(zhì)為有機酸合成的鹽，在乳中一般占比約為0.7%[19]。礦物質(zhì)是維持機體健康的重要組成成分之一，礦物質(zhì)營養(yǎng)缺乏將會導(dǎo)致兒童生長速度減慢、熱量減少、骨質(zhì)疏松、骨折和骨骼組織發(fā)育延遲[20]。牛乳中的礦物質(zhì)與人體健康而言十分重要，不同地理來源的牛乳礦物質(zhì)含量存在差異，可作為牛乳地理溯源過程中的一個重要的溯源指標(biāo)，實現(xiàn)不同地理來源的牛乳溯源。

2 指紋圖譜技術(shù)

2.1穩(wěn)定同位素技術(shù)

同位素是指具有質(zhì)子數(shù)相同和中子數(shù)不同的一類元素的總稱,可分為放射性同位素和穩(wěn)定性同位素[21]。這兩種同位素的不同之處在于放射性衰變的能力。在早期，放射性同位素由于易于檢測而成為許多生物試驗的首選工具，隨著高靈敏檢測方法的發(fā)展以及對使用放射性標(biāo)記化合物存在的安全隱患考慮，穩(wěn)定同位素技術(shù)的利用逐漸廣泛，現(xiàn)在已知的穩(wěn)定和放射性同位素有 300 多種[22]。在生物學(xué)科中常用的穩(wěn)定同位素為碳 (13C)、氮 (15N)、氧 (18O) 和氫 (2H)，這些同位素根據(jù)質(zhì)量差異使其分析上可以相互區(qū)分并通過化學(xué)方法引入到脂肪酸、氨基酸和糖類等有機化合物中，從而“追蹤”這些化合物的生物代謝過程。當(dāng)同位素技術(shù)分辨率越高，代謝“指紋”就越明顯[23]。Rebecca J.McLeod[24]等使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法和同位素比質(zhì)譜法分析了58個山羊全脂奶粉樣品和一套 13 種礦物質(zhì)元素及同位素δ13C 和 δ15選擇 N 以創(chuàng)建化學(xué)指紋，使用主成分分析和主坐標(biāo)的規(guī)范分析來評估不同地理來源之間和隨時間推移的樣品化學(xué)指紋的差異。

2.2礦物質(zhì)指紋分析技術(shù)

隨著國際市場的發(fā)展和對優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的需求，食品的安全性和真實性已成為消費者關(guān)注的主要問題。為了保護(hù)特定地理區(qū)域的優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品，建立食品追溯系統(tǒng)非常重要。不同地域來源的牛乳礦物質(zhì)含量差異明顯，礦物質(zhì)指紋分析技術(shù)也因此成為鑒別牛乳地理來源的方法之一。食品產(chǎn)地溯源中利用礦物元素指紋分析技術(shù)的主要決定因素是從多種礦物元素中選出能夠正確表現(xiàn)與該食品相關(guān)且較為穩(wěn)定的礦物元素指紋的信息[25]。依托判別分析等一些化學(xué)計量學(xué)法對來自不同地域來源的食品重點礦物質(zhì)指標(biāo)的差異進(jìn)行比較研究，從而明晰不同地區(qū)來源產(chǎn)品的差異性指標(biāo)，并建立判別模型，鑒別未知樣品[26]。但是礦物質(zhì)指紋分析技術(shù)也有一定的局限性，動物源性農(nóng)產(chǎn)品體內(nèi)的礦物質(zhì)含量受到飼料、飼喂方式的影響具有一定的不確定性，而且在樣品前處理的要求也較高，因此為了提高檢測效率應(yīng)正確選擇研究對象[27]。礦物指紋分析已應(yīng)用于多種農(nóng)產(chǎn)品及其衍生產(chǎn)品的地理真實性研究，例如蜂蜜、水果、大米、酒和馬鈴薯[28]?？傊V物質(zhì)指紋分析技術(shù)是地理來源分類，明確品種、物種和真假的有力工具且作為一種有效的數(shù)據(jù)分析方法，化學(xué)計量學(xué)在食品來源和質(zhì)量的識別中也得到了廣泛的推廣。

2.3電子鼻

電子鼻是一種檢測揮發(fā)性有機化合物的新技術(shù)，由一系列對化學(xué)成分靈敏的傳感器組成，是一種模擬人類嗅覺的低成本、快速檢測儀器[29,30]。電子鼻可以通過將傳入的氣味與先前學(xué)習(xí)的模式進(jìn)行比較來識別不同的復(fù)雜氣味從而創(chuàng)造所謂的呼吸印。當(dāng)揮發(fā)性有機化合物在電子鼻傳感器的表面發(fā)生反應(yīng)時會出現(xiàn)讀數(shù)，使傳感器的電導(dǎo)率發(fā)生變化[31]。雖然電子鼻可以對不同樣品氣味輪廓的細(xì)微差異進(jìn)行區(qū)分，但其無法定性定量分析某一種揮發(fā)性成分[32]。隨著科技進(jìn)步已經(jīng)開發(fā)了幾種不同的電子鼻，主要是使用不同的傳感器，例如微熱板金屬氧化物傳感器、花青素涂覆的金電極石英晶體微量天平傳感器、覆蓋有金屬卟啉的石英晶體微量天平、金屬氧化物半導(dǎo)體傳感器等[33，34]。目前電子鼻主要是和氣相色譜—質(zhì)譜法 (GC-MS)一起使用，以幫助識別導(dǎo)致呼吸印跡發(fā)生變化的特定生物標(biāo)志物并測試電子鼻檢測過程中某些條件的準(zhǔn)確性。

2.4色譜技術(shù)

氣相色譜—質(zhì)譜 (GC-MS) 結(jié)合固相微萃取 (SPME) 是作為最常用的分析工具之一，用于區(qū)分來自不同地理來源的飲料和食品，通過識別揮發(fā)性物質(zhì)的細(xì)微分析差異指紋過將假定的揮發(fā)性有機化合物建立為地理標(biāo)記[35]。GC-MS 是分析揮發(fā)性化合物的最廣泛使用的技術(shù)之一，因為它在從復(fù)雜系統(tǒng)中分離、鑒定和定量單個揮發(fā)性化合物方面具有出色的性能。近年來，GC-MS結(jié)合主成分分析(PCA)、層次聚類分析(HCA)、相似性分析(SA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)等多元分析在代謝組學(xué)分析、化學(xué)品的分類、質(zhì)量控制中廣泛應(yīng)用[36]。此外，研究人員還開發(fā)了一種新型的紅外輔助萃取與頂空固相微萃取 (IRAE-HS-SPME) 和氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用 (GC-MS) 相結(jié)合的方法，用于快速測定食品中的揮發(fā)性成分，如中藥真?zhèn)螜z測、蜂蜜摻假、樹莓酒特性檢測和不同柑橘茶鑒別等[37]。

3 指紋圖譜技術(shù)在牛乳中的應(yīng)用

3.1礦物質(zhì)多元指紋分析技術(shù)在牛乳中的應(yīng)用

為了實施有效的食品安全計劃需要追蹤食品來源的真實性并防止摻假，越來越多的研究通過使用不同的分析技術(shù)致力于根據(jù)食物的特征化學(xué)成分確定其地理來源。牛乳作為適合各個年齡段食用的食品，其成分安全性和來源于廣大消費者而言及其重要。許多研究表明，不同來源的牛乳中的礦物質(zhì)成分水平存在差異。盡管其中鉀、磷、氯、鈣和鈉等一些礦物質(zhì)相同，但每種礦物質(zhì)的含量不同。為了檢測乳及乳制品的季節(jié)性和地理變化，礦物質(zhì)和微量元素的成分分析對于乳制品行業(yè)很重要。Olafur Reykdal[38]等為了明確冰島常用食品(全脂牛奶、新鮮奶酪、硬奶酪、羊肉和碎牛肉以及脫脂牛奶、奶油和乳清)的季節(jié)和地理變化，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 (ICP-MS) 檢測樣品中礦物質(zhì)和微量元素的濃度發(fā)現(xiàn)全脂牛奶中的硒的含量發(fā)生了變化。高玎玲[39]為了系統(tǒng)全面的檢測與評價蒙古乳中礦物質(zhì)含量，以從內(nèi)蒙古自東向西9個旗縣采集奶牛、山羊、蒙古馬和雙峰駝四種家畜原奶共79份為檢測對象，檢測了23種常量和微量元素，利用描述性統(tǒng)計和化學(xué)計量學(xué)進(jìn)行了物種和地區(qū)礦物質(zhì)特征分析，并探究了礦物質(zhì)譜模型進(jìn)行物種真實性判別及產(chǎn)地溯源的可行性，結(jié)果表明四種家畜乳的礦物質(zhì)含量存在差異，不同地區(qū)乳礦物質(zhì)含量存在差異。相對于常量元素，微量元素地區(qū)差異較大，其中硒元素具有明顯的豐度效應(yīng)。環(huán)境條件極大地影響著牛乳中的硒含量，這可能主要是因為硒受土壤中元素的含量和有效性影響，不同地區(qū)牧草和飼料中硒的含量不同從而使牛奶中的硒含量受飼料中硒含量及其有效性受到影響。

3.2穩(wěn)定同位素技術(shù)在牛乳中的應(yīng)用

在牛乳和乳制品的摻假食品鏈透明度、保證食品質(zhì)量和安全以及確定乳制品真?zhèn)畏矫?，穩(wěn)定同位素技術(shù)也是常用的技術(shù)之一。牛奶的成分從根本上取決于奶牛的喂養(yǎng)情況，從而取決于特定的環(huán)境。然而，穩(wěn)定的同位素組成在環(huán)境中并不總是恒定的，甚至在同一區(qū)域也會發(fā)生變化。Gregori[40]等使用 IRMS 進(jìn)行不同來源牛乳中δ2H 和δ18O的穩(wěn)定性測定，通過方差分析偶發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)、年份和季節(jié)的牛乳δ18O值存在顯著差異 (P< 0.05)。Andrius[41]等更好地了解水和食物來源對氧、碳和氮穩(wěn)定同位素比(18O/16O、13C/12C 和15N/14N)分布和一年中不同季節(jié)的牛乳中礦物質(zhì)含量的變化。與區(qū)分牛奶的來源相比，脂肪酸的穩(wěn)定同位素組成也被證明是反芻動物代謝轉(zhuǎn)化過程的更好生物標(biāo)志物。Doris[42]在2012 年、2013 年和 2014 年，每年冬季和夏季采集四個不同地區(qū)的牛乳樣品，并對其中的脂肪酸的百分比和穩(wěn)定同位素比率進(jìn)行研究，以了解不同季節(jié)、年份和區(qū)域牛乳的變化，結(jié)果顯示基于脂肪酸組成的判別分析模型在根據(jù)生產(chǎn)年份/季節(jié)(86.9%)區(qū)分牛奶方面是有效的，地理來源區(qū)分不太成功(64.1%)。總而言之，δ18O、δ13C 和δ15N 為牛乳分析提供了有關(guān)天然樣品中穩(wěn)定同位素比率變化量的寶貴信息，有助于牛乳及乳制品認(rèn)證的研究。

3.3電子鼻在牛乳中的應(yīng)用

電子鼻作為一種低成本和破壞性小的設(shè)備，也可以用于識別牛奶來源并估計牛奶質(zhì)量指標(biāo)中乳脂和蛋白質(zhì)含量。Zoltan[43]等依托益生菌與發(fā)酵食品中獨特的香氣化合物的特性，用電子鼻區(qū)分不同發(fā)酵時間(0d、4d、11d)的細(xì)菌菌株。因此，利用電子鼻建立模型，可以快速預(yù)測和監(jiān)測菌株的一些主要微生物特征和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要香氣成分。龍鳴[44]等為區(qū)分判別牦牛乳的牛種、地區(qū)、胎次及真?zhèn)?，利用電子鼻采集了不同牦牛生乳及不同摻雜物比例牦牛乳的氣味信息，并結(jié)合多元統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示牦牛乳氣味指紋圖譜通過PCA與CDA分析可判別區(qū)分出不同品質(zhì)的牦牛乳，尤其對不同胎次牦牛乳的判別區(qū)分效果明顯優(yōu)于其他指紋圖譜。吳丹丹[45]等為了迅速準(zhǔn)確地鑒別摻假駱駝乳的氣味特征，通過電子鼻10個傳感器和多變量結(jié)合分析更快速、準(zhǔn)確的評價了不同摻假濃度(0.1%、1%、3%、5%、10%、15%、20%和100%)的駝乳。高雅慧[46]等利用Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻對不同加工方式牛奶中的揮發(fā)性有機化合物進(jìn)行檢測，并采用主成分分析、樣品間區(qū)別指數(shù)分析和主成分載荷圖分析對不同加工方式牛奶揮發(fā)性物質(zhì)的差異性進(jìn)行比較?？傊?，電子鼻已成功用于評估牛乳及乳制品保質(zhì)期預(yù)測、牛奶中細(xì)菌培養(yǎng)的分類，乳制品地理來源分類，奶酪分類中潛在的工具。

3.4色譜技術(shù)在牛乳中的應(yīng)用

農(nóng)產(chǎn)品領(lǐng)域是 HPLC-MS 的應(yīng)用學(xué)科和工業(yè)中發(fā)展最快的領(lǐng)域之一。由于分子特異性和高靈敏度，液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)是目前基于FDA建立的檢測牛奶和嬰兒配方奶粉中三聚氰胺的方法[47]。P.Gao[48]結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的凝膠過濾色譜(GFC)指紋方法進(jìn)行原料乳的指紋分析。分析了 10 個批次的 120 個原料奶樣品，以在最佳條件下建立 GFC 指紋圖譜并使用標(biāo)準(zhǔn)色譜指紋圖譜和 PCA 檢測原料奶中的蛋白質(zhì)摻假。選取每個原料乳樣品色譜圖共有的6個主要峰進(jìn)行指紋圖譜分析，利用特征峰建立標(biāo)準(zhǔn)色譜圖譜。然后應(yīng)用主成分分析對摻假乳和生乳的 GFC 信息進(jìn)行分類，從而在主成分分析得分圖中從生乳中有效篩選出摻假樣品。指紋法在檢測牛奶蛋白摻假方面表現(xiàn)出有前景的特征。Ha-Jung Kim[49]等通過氣相色譜分析牛奶和摻假牛奶脂肪混合物(摻假比例為 10%、30%、50%、70% 和 90%)的脂肪酸、三酰甘油和膽固醇特征。結(jié)果表明，油酸(C18∶1n9c)和亞油酸(C18∶2n6c)脂肪酸、C52和C54甘油三酯、膽固醇含量與摻假率顯著成正比。純?nèi)橹械挠退?(C18∶1n9c)、亞油酸 (C18∶2n6c)、C52 和 C54 低于摻假混合物。氣相色譜技術(shù)用于檢測關(guān)鍵脂質(zhì)(例如，甘油三酯)具有評估牛奶來源和檢測牛乳中的添加物。此外，還有一些基于質(zhì)譜 (MS) 的脂質(zhì)指紋檢測技術(shù)無需有機溶劑萃取的新型檢測方法。因此，色譜技術(shù)是一種靈敏、廉價且快速的方法具有用于牛乳真實性應(yīng)用的潛力。

4 展望

牛奶在人類飲食中至關(guān)重要。對這些液態(tài)食品的需求不斷增加，使它們在加工和供應(yīng)鏈中容易受到產(chǎn)品摻假的影響。摻假品很難被消費者發(fā)現(xiàn)，因此需要快速、準(zhǔn)確和靈敏高的檢測方法。本文已經(jīng)描述了各種技術(shù)的潛在優(yōu)勢和局限性。此外，光譜技術(shù)與化學(xué)計量學(xué)相結(jié)合，也是有快速、精確和靈敏地檢測這些液體食品中潛在摻雜物的潛力。