HPLC-示差折光檢測(cè) 1，2，3-三乙酰氧基-5-脫氧-β-D-核糖的有關(guān)物質(zhì)的方法研究

王志鵬，陳麗君，唐 海，周 微

（江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，天津 300410）

1，2，3-三乙酰氧基-5-脫氧-β-D-核糖是合成卡培他濱的關(guān)鍵中間體，其以D-核糖為原料，經(jīng)過一系列反應(yīng)合成 5-脫氧-β-D-核糖，再經(jīng)過甲?；玫剑?-3］。因此，D-核糖與 5-脫氧-β-D-核糖是 1，2，3-三乙酰氧基-5-脫氧-β-D-核糖中潛在的雜質(zhì)，需要建立分析方法進(jìn)行研究。糖類物質(zhì)多見于采用液相色譜-示差檢測(cè)器進(jìn)行常量檢測(cè)［4-6］，作為雜質(zhì)的檢測(cè)文獻(xiàn)報(bào)道較少［7-8］。本研究建立了以示差折光液相色譜法檢測(cè)1，2，3-三乙酰氧基-5-脫氧-β-D-核糖中的 D-核糖以及5-脫氧-β-D-核糖，方法簡(jiǎn)便可靠，靈敏度高，具有重要的意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 液相色譜儀（配示差折光檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司），chromeleon 7 色譜工作站（美國(guó)賽默飛公司）；XS105DU 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；超純水系統(tǒng)（Millipore-Q，Millipore 公司）。

1.2 試藥 1，2，3-三乙酰氧基-5-脫氧-β-D-核糖（連云港海恒生化科技有限公司，批號(hào)20180429、20180510、20180512、20180601、20180602、20180603）；D-核糖（連云港海恒生化科技有限公司，批號(hào)20170301，含量100%）；5-脫氧-β-D-核糖（連云港海恒生化科技有限公司，批號(hào)20170501，含量99.6%）；乙腈（色譜純，德國(guó) Merck 公司）；超純水（Millipore-Q 制備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters XBridge Amide 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（70 ∶30）；流速為 1 ml/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：100 μl；示差折光檢測(cè)器溫度40 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取5-脫氧-β-D-核糖及D-核糖適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml 分別含0.1 mg 的混合溶液，作為雜質(zhì)貯備液；精密量取雜質(zhì)貯備液2 ml 置10 ml 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取樣品約200 mg，精密稱定，置10 ml 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液（流動(dòng)相）。按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果該色譜條件下的色譜峰形對(duì)稱，理論塔板數(shù)為：4 955，符合2020 年版《中國(guó)藥典》的相關(guān)規(guī)定。見圖1。

圖1 陰性樣品（A）供試品（B）對(duì)照品（C）HPLC 色譜圖

2.4 專屬性試驗(yàn) 取1，2，3-三乙酰氧基-5-脫氧-β-D-核糖、D-核糖、5-脫氧-β-D-核糖適量，精密稱定，用流動(dòng)相溶解，分別進(jìn)樣，1，2，3-三乙酰氧基-5-脫氧-β-D-核糖出峰時(shí)間為2.662 min，D-核糖出峰時(shí)間為4.820 min，5-脫氧-β-D-核糖出峰時(shí)間為3.867 min，主峰與各雜質(zhì)可以有效分離。

2.5 檢測(cè)限與定量限 采用逐步稀釋法，5-脫氧-β-D-核糖定量限、檢測(cè)限濃度分別為0.005 5 mg/ml 和0.003 7 mg/ml，相當(dāng)于樣品中含量分別為0.027%和0.018%；D-核糖定量限、檢測(cè)限濃度分別為0.006 1 mg/ml 和0.004 0 mg/ml，相當(dāng)于樣品中含量分別為0.031%和0.020%。5-脫氧-β-D-核糖在定量限水平精密度為 2.7%（n=6），D-核糖的精密度為 2.4%（n=6）。

2.6 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密量取上述“2.2.1”項(xiàng)下的雜質(zhì)貯備液 4、2、1.6、1 和 0.6 ml 分別置 10 ml 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸分析，得出線性方程。結(jié)果表明，5-脫氧-β-D-核糖在5.4～36.3 μg/ml 濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=9.642 5 X+19.403 7（r=0.999 2，n=5）。D-核糖在 6.1～40.4 μg/ml 濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=14.449 2 X-7.782 7（r=0.999 0，n=5）。

2.7 精密度試驗(yàn) 按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣 6 針，5-脫氧-β-D-核糖與D-核糖峰面積 RSD 分別為3.3%和 2.4%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)20180429）樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備 6 份供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果均未檢出5-脫氧-β-D-核糖和D-核糖。

2.9 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液和“2.10”項(xiàng)下的100%回收率1#樣品溶液，在室溫分別放置 0、4、8、16 和 24 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明對(duì)照溶液和樣品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，對(duì)照溶液中，5-脫氧-β-D-核糖的 RSD 為 2.5%，D-核糖的 RSD為2.1%；樣品溶液中5-脫氧-β-D-核糖的RSD 為2.0%，D-核糖的RSD 為1.7%。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 稱取樣品（批號(hào)20180429）9份，每份約200 mg，精密稱定置10 ml 量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下的雜質(zhì)貯備液 3、2 和 0.6 ml，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別作為150%、100%和定量限濃度水平回收率樣品溶液，每種濃度制備3 份。分別進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果表明5-脫氧-β-D-核糖及D-核糖平均回收率分別為101.0%和100.2%，RSD 分別為2.9%和3.2%。在150%、100%及定量限水平回收率均符合規(guī)定。見表1 和表2。

表1 5-脫氧-β-D-核糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 D-核糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.11 樣品測(cè)定 取5 批1，2，3-三乙酰氧基-5-脫氧-β-D-核糖樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 樣品中有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)器選擇 由于D-核糖與5-脫氧-β-D-核糖無紫外吸收，不適合使用紫外檢測(cè)器方法，因此使用HPLC 示差折光檢測(cè)器測(cè)定；示差折光檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，可以對(duì)兩種雜質(zhì)進(jìn)行有效檢測(cè)，故選擇示差檢測(cè)器為本試驗(yàn)色譜系統(tǒng)的檢測(cè)器。

3.2 進(jìn)樣量的選擇 示差折光檢測(cè)器靈敏度比較低，且基線受溫度、流動(dòng)相組成影響較大，一般用于常量檢測(cè)，較少用于痕量檢測(cè)。本方法采用示差檢測(cè)器檢測(cè)5-脫氧-β-D-核糖與D-核糖線性濃度分別在5.4～36.3 μg/ml 和 6.1～40.4 μg/ml，經(jīng)方法驗(yàn)證，進(jìn)樣量為100 μl 時(shí)，方可滿足檢測(cè)需求。

3.3 色譜柱的選擇 本研究曾試用Waters Symmetry Shield RP-18 與Waters XBridge Amide 兩種不同型號(hào)色譜柱，從分離度、峰形、響應(yīng)值3 個(gè)方面考查。在Waters XBridge Amide 柱上分離度較好，峰形對(duì)稱，故選用該色譜柱。

3.4 耐用性試驗(yàn) 對(duì)方法耐用性進(jìn)行試驗(yàn)，通過改變流速［（1.0±0.1）ml/min］、柱溫箱［（40±2）℃/min］、流動(dòng)相比例（乙腈-水 72∶28 和 68∶32）等試驗(yàn)條件，考查色譜峰分離情況，結(jié)果各色譜峰之間分離良好。表明本試驗(yàn)方法的耐用性良好。