冬棗核總黃酮提取工藝響應(yīng)曲面法的優(yōu)化

楊文義 李倩倩 李 倩 位建威 于 燕 曲桂武 呂長俊 劉德勝

濱州醫(yī)學(xué)院 山東 煙臺 264003

冬棗是產(chǎn)自山東省濱州市的中國國家地理標志產(chǎn)品，2018年濱州冬棗成為中國品牌價值評價信息發(fā)布的“全國地標產(chǎn)品100強”，是濱州市大力打造的農(nóng)業(yè)品牌之一。冬棗營養(yǎng)豐富，富含多種礦物質(zhì)、多種維生素、多糖、黃酮以及其他生物活性物質(zhì)[1-3]。目前，除鮮食外，產(chǎn)業(yè)界已經(jīng)開發(fā)了多元化冬棗相關(guān)產(chǎn)品，包括冬棗濃縮汁、冬棗酒、冬棗粉、凍干冬棗、冬棗醬以及脆冬棗等。對其加工剩余冬棗核的相關(guān)研究并不多。本研究以濱州冬棗加工后剩余的棗核為研究對象，采用響應(yīng)曲面法對超聲輔助提取冬棗核總黃酮類化合物進行了工藝優(yōu)化，以便進一步開發(fā)利用冬棗，并實現(xiàn)冬棗價值最大化，提升品牌價值，增加農(nóng)民收入。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 本研究采用的冬棗核產(chǎn)自濱州市沾化區(qū)下洼鎮(zhèn)。酸棗核于2020年10月采自昆崳山，經(jīng)我校中藥學(xué)教研室鑒定為鼠李科棗屬植物酸棗的果核。亞硝酸鈉、九水硝酸鋁、NaOH、無水乙醇均為分析純。蘆丁(西安天寶生物科技有限公司，純度>98%，批號為TB201160221)。

1.2 儀器 紫外-可見分光光度計(TU-190型，北京普析通用儀器有限公司)，超聲波清洗器(DL-120B，北京中儀友信有限公司)，循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，鄭州長城工貿(mào)有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1200B，日本東京理化儀器有限公司)。

1.3 提取方法

1.3.1 冬棗核的處理 冬棗去果肉，水浸泡，洗凈，烘干，然后粉碎，過100目篩，精稱約1 g后加入溶劑后超聲提取，過濾后減壓揮干溶劑，得到冬棗核粗提物。

1.3.2 標準曲線的繪制 按照參考文獻[4]所述方法，以蘆丁為標準品，精密稱取蘆丁標準品2 mg，用60%的乙醇溶液溶解，并定容在10 mL容量瓶，以此為母液，制備不同濃度標準溶液。分別吸取不同濃度標準溶液4～10 mL滴入容量瓶中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁，混勻，靜置6 min，再加入4 mL 4%NaOH溶液，加入60%乙醇定容至10 mL ，靜置20 min，在510 nm處測量其吸光度，以吸光度為縱坐標和標準溶液濃度為橫坐標作標準曲線。

1.3.3 冬棗核總黃酮提取工藝條件

1.3.3.1 單因素實驗設(shè)計 考察提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)、超聲功率為單因素，考察上述因素對冬棗核總黃酮提取率的影響。

1.3.3.2 響應(yīng)曲面實驗設(shè)計[5]以冬棗核總黃酮提取率為響應(yīng)面值，選擇上述4個單因素，再運用Design-Expert軟件設(shè)計本研究所探究的工藝參數(shù)(表1)。

表1 冬棗核總黃酮提取的響應(yīng)曲面分析因素水平

1.3.3.3 冬棗核總黃酮的含量測定 取1.3.1項下所得冬棗核提取物，用60%乙醇溶解，并定容到25 mL容量瓶，取4～10 mL滴入容量瓶中，依照1.3.2項從“加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液”做起，在510 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線 蘆丁對照品溶液在實驗設(shè)計濃度范圍內(nèi)與吸光度成良好線性關(guān)系。線性回歸方程為A=0.004 7C-0.0039 2，線性相關(guān)系數(shù)為r=0.998 5，標準曲線的線性范圍為13.0～208.0 μg/mL。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對冬棗核總黃酮提取率的影響 精稱冬棗核粉約1 g，共3份，分別置于250 mL燒杯中，分別加入50 mL 50%乙醇，料液比為1∶50，設(shè)置提取時間為30 min，超聲波功率為350 W，考察乙醇體積分數(shù)為30%、40%、50%、60%、70%對總黃酮提取率的影響。乙醇體積分數(shù)對冬棗核總黃酮提取率的影響見圖1，最佳提取乙醇體積分數(shù)為50%。不同品種棗核中總黃酮含量各有不同，總黃酮含量提取率在1%～2%左右，而本研究所用到的冬棗核在單因素條件下黃酮提取率可達3%以上，這意味著此冬棗核的黃酮含量更為豐富，更具有開發(fā)價值。

圖1 乙醇體積分數(shù)對冬棗核總黃酮提取率的影響

2.2.2 提取時間對冬棗核總黃酮提取率的影響 按照2.2.1項下稱取冬棗核樣品，分別加入50 mL 50%乙醇，料液比為1∶50，設(shè)置提取時間為30 min，超聲波功率為350 W，考察提取時間為10、20、30、40、50 min對總黃酮提取率的影響。由圖2可知，隨著提取時間增加，黃酮提取率增加迅速，在30 min達到最大值。

圖2 提取時間對冬棗核總黃酮提取率的影響

2.2.3 提取溫度對冬棗核總黃酮提取率的影響 按照2.2.1項稱取冬棗核樣品，分別加入50 mL 50%乙醇，料液比為1∶50，設(shè)置提取時間為30 min，超聲波功率為350 W，考察提取溫度為25、35、45、55、65 ℃對總黃酮提取率的影響。由圖3可知，最佳提取溫度為45 ℃。

圖3 提取溫度對冬棗核總黃酮提取率的影響

2.2.4 超聲波功率對冬棗核總黃酮提取率的影響 按照2.2.1項稱取冬棗核樣品，分別加入50 mL 50%乙醇，料液比為1∶50，設(shè)置提取時間為30 min，考察超聲波功率250、300、350、400、450 W對總黃酮提取率的影響。由圖4可知，隨著超聲波功率增大，黃酮提取率也增大，在400 W達到最大提取率，繼續(xù)增大功率會使提取率下降。

圖4 超聲功率對冬棗核總黃酮提取率的影響

2.3 響應(yīng)曲面實驗以及結(jié)果分析

2.3.1 回歸模型的建立與分析 應(yīng)用Design-Expert 10軟件給出設(shè)計實驗29組，其中析因?qū)嶒?4次，中心組合實驗重復(fù)5次(表2)。

表2 冬棗核總黃酮提取的響應(yīng)曲面設(shè)計方案及實驗結(jié)果

通過對表2的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析得到模型方程，公式如下所示：黃酮提取率=2.19-0.097A+0.16B-0.094C-0.23D-0.14AB-0.55AC+0.25AD-0.16BC+0.41BD+0.12CD+0.02A2+0.3B2+0.784C2+0.23D2。從公式中可以看出：AB、AC、AD、BC幾個交互作用與總黃酮提取率都呈現(xiàn)出負相關(guān)，BD以及CD與總黃酮提取率呈現(xiàn)正相關(guān)。一般根據(jù)交互作用系數(shù)大小可以判斷影響大小。根據(jù)回歸方程可以看出：交互作用影響大小為AC>BD>AD>B>AB>CD。

2.3.2 響應(yīng)曲面擬合 根據(jù)以上結(jié)果對其進行擬合，擬合曲線以及殘差正態(tài)分布圖見圖5。擬合曲線中所有的散點基本分布在直線的兩邊，呈現(xiàn)動態(tài)分布。殘差正態(tài)分布中，大多數(shù)點呈線性關(guān)系。這表明本研究響應(yīng)曲面模型擬合效果較好，結(jié)果較準確，可以用于響應(yīng)曲面預(yù)測。

圖5 冬棗核總黃酮提取的擬合曲線及正態(tài)分布圖

表3 總黃酮提取率的方差分析表

2.3.4 單因素對總黃酮提取率影響的響應(yīng)曲面圖 圖6.A為A與B交互作用對總黃酮提取率的影響，當因素A一定時，隨著因素B的增加，響應(yīng)目標總黃酮提取率先減小后增大，當因素B一定時，隨著因素A的增加，響應(yīng)目標總黃酮提取率變化很小，幾乎忽略不計。圖6.B為A與C交互作用對總黃酮提取率的影響，圖形斜率變化很大，表明AC交互作用非常顯著，與前面方差分析P值小于0.05顯著相一致。圖6.C為A與D交互作用對總黃酮提取率的影響，當因素A一定時，隨著因素D的增大，總黃酮提取率不斷減小，當因素D一定時，隨著因素A的增大，總黃酮提取率不斷減小。圖6.D和F分別為B與C交互作用以及C與D交互作用對總黃酮提取率的影響，圖形中心接近于圓形，表明影響不顯著。圖6.E為B與D交互作用對總黃酮提取率的影響，當B因素一定時，隨著因素D的增大，總黃酮提取率不斷減小。當因素D一定時，隨著B的增加，總黃酮提取率不斷減小。

圖6 總黃酮提取率的影響因素二維及三維圖

2.3.5 最佳工藝的預(yù)測與檢驗 本研究利用Design-Expert中的Optimization功能得到最佳優(yōu)化方案：乙醇濃度為50%、提取時間為20 min、超聲功率為350 W，提取溫度為35 ℃，冬棗核黃酮粗品的黃酮提取率預(yù)測值為4.08%。在此工藝下進行5次平行實驗(表4)，測定黃酮的提取率平均為4.02%，與預(yù)測值4.08%相差較小，基本符合預(yù)測值。這充分驗證了回歸模型的合理性，說明了響應(yīng)曲面分析比較適合冬棗核總黃酮提取工藝的優(yōu)化。

表4 冬棗核總黃酮提取的最佳工藝驗證結(jié)果

3 討論

本研究以濱州冬棗核為研究對象，對冬棗核總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，得到了最佳提取工藝。在該工藝指導(dǎo)下，所得冬棗核總黃酮提取率(4.02%)與酸棗核總黃酮(4.11%)比較接近。本研究發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)曲面法優(yōu)化后的總黃酮提取率比單因素條件下的總黃酮提取率明顯增高，原因在于響應(yīng)曲面法采用多元回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，求出的回歸方程精度高，還可以研究各因素之間的交互作用，比單因素條件突出顯著優(yōu)勢，所以該法在中草藥有效成分的提取工藝優(yōu)化中得到廣泛應(yīng)用[4]。冬棗核總黃酮提取物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等活性[3]。本研究對冬棗加工后剩余的棗核進行研究，可為濱州冬棗產(chǎn)業(yè)升級提供理論基礎(chǔ)。