香石竹DcSKP1基因克隆及表達分析

周旭紅 趙雪艷 楊曉密 吳學(xué)尉 瞿素萍

摘 要：? SKP1基因是SCF E3泛素連接酶蛋白復(fù)合物的核心成分，參與多種生物過程。然而，香石竹SKP1基因還未被克隆，該文利用RT-PCR結(jié)合 RACE技術(shù)，從香石竹（Dianthus caryophyllus）的花藥中分離克隆了1個減數(shù)分裂相關(guān)基因SKP1的全長cDNA序列，命名為DcSKP1（GenBank登錄號為MK931293）。結(jié)果表明：（1）DcSKP1基因cDNA 全長序列為 962 bp，含有1個長度為567 bp 的ORF，該基因編碼188個氨基酸。（2）蛋白序列比對顯示，DcSKP1中存在一個高度保守TPEE基序，還具有Skp1_POZ結(jié)構(gòu)域和Skp1結(jié)構(gòu)域，并與擬南芥的SKP1聚集在一個分支上。（3）利用熒光定量PCR對香石竹DcSKP1基因表達模式進行研究，發(fā)現(xiàn)DcSKP1基因在各個組織部位都有表達，在花藥中的表達量高于莖、葉組織，且在幼小的花藥中表達量最高，隨著花藥發(fā)育的進程表達量下降。由此推測，DcSKP1基因可能在香石竹減數(shù)分裂中具有重要作用。

關(guān)鍵詞： 香石竹， DcSKP1， 減數(shù)分裂， 生物信息學(xué)分析， 基因表達分析

中圖分類號：? Q943

文獻標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）02-0286-08

Clone and expression analysis of DcSKP1 in Dianthus caryophyllus

ZHOU Xuhong1，2， ZHAO Xueyan3， YANG Xiaomi2， WU Xuewei3， QU Suping1*

（ 1. Flower Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650205， China; 2. Yunnan University of Chinese Medicine，

Science and Technology Department， Kunming 650500， China; 3. School of Agriculture， Yunnan University， Kunming 650500， China? ）

Abstract：? SKP1 gene is the core component of the SCF （Cul1-Rbx1-Skp1-F box） E3 ubiquitin ligase protein complex and is involved in many different biological processes. However， the SKP1 gene of carnation has not been cloned. In this study， a new DcSKP1 gene （the accession number in GenBank was MK931293） was isolated from the flower of Dianthus caryophyllus by using RT-PCR and RACE approaches. The results were as follows： （1） The full length cDNA sequence of DcSKP1 was 962 bp， and a ORF of 567 bp encoded 188 amino acids. （2） Protein sequence alignment showed that DcSKP1 had a highly conserved TPEE motif， Skp1_POZ domain and Skp1 domain， and clustered on a branch with Arabidopsis thaliana Skp1. （3） The DcSKP1 gene expression pattern of Dianthus caryophyllus was studied by qRT-PCR， and it was found that the DcSKP1 gene was expressed in all tissue sites，? the expression level in anthers was higher than that in stem and leaf tissues，? the expression level was the highest in young anthers， and the expression level decreased with the development of anthers. It is speculated that DcSKP1 gene may play an important role in carnation meiosis in D. caryophllus.

Key words： Dianthus caryophyllus， DcSKP1， meiosis， bioinformatics analysis， gene expression analysis

許多細胞事件，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄的機制主要由泛素介導(dǎo)的蛋白降解所調(diào)控 （Hershko &Ciechanover， 1998;Ning et al.， 2016）。泛素化是一個三酶級聯(lián)的過程，首先泛素被泛素激活酶（E1）激活，然后轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶（E2）上，在泛素連接酶（E3）的幫助下與底物蛋白的賴氨酸殘基結(jié)合，賦予底物特異性 （劉衛(wèi)霞等，2002）。多個泛素分子可以附著在蛋白底物上已有的泛素分子上形成多泛素鏈，多泛素化的蛋白通常被26S蛋白酶體降解。SCF復(fù)合物形成已知最大的E3泛素蛋白連接酶 （Schulman et al.， 2000），SCFs參與關(guān)鍵蛋白的泛素化，控制細胞周期進展和轉(zhuǎn)錄控制等基本生物學(xué)過程 （孫新艷等， 2017）。擬南芥SKP1-like-1 （ASK1），編碼連接Cullin和F-box蛋白的SCF亞基 （Yang et al.， 1999）。已有研究表明，ASK1可以與F-box蛋白相互作用 （Takahashi et al.， 2004），由于這些F-box蛋白在不同的通路中發(fā)揮著重要作用 （鄭鴻平和李逸平，2011），ASK1作為SCFs中的關(guān)鍵成分，在擬南芥中廣泛地表達，且在許多發(fā)育和生理過程中可能具有重要功能 （葉佑丕，2014;Lu et al.， 2016）。擬南芥ask1突變體在雄性減數(shù)分裂、花器官發(fā)育和營養(yǎng)生長方面存在缺陷。ask1-1最早檢測到的缺陷發(fā)生在細線期到偶線期的轉(zhuǎn)化過程中，核仁未能遷移到核外周，同源染色體不發(fā)生聯(lián)會 （Wang et al.， 2004），ASK1-1突變也導(dǎo)致擬南芥雄性減數(shù)分裂中重組頻率的增加 （Wang & Yang， 2006）和雄性不育（Yang et al.， 1999）。

香石竹是四大鮮切花之一，具有較高的產(chǎn)量和產(chǎn)值。目前，香石竹的育種主要還是采用傳統(tǒng)的雜交育種，包括種間雜交和種內(nèi)雜交育種方式;自然芽變或是采用輻射來誘導(dǎo)芽變也是香石竹育種方法之一;此外，也會利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的方法培育藍色香石竹 （Fukui et al.， 2003）及抗衰老 （余義勛和包滿珠， 2004）、抗枯萎病 （胡忠亮等， 2018）和耐熱 （吳姍姍， 2014）等品系。但有關(guān)調(diào)控參與香石竹減數(shù)分裂的基因來創(chuàng)制優(yōu)異香石竹品種的研究較少，這極大地阻礙了香石竹育種的進程。SKP1基因可調(diào)控花器官發(fā)育和減數(shù)分裂，但香石竹SKP1基因還未被克隆。本研究通過克隆香石竹SKP1基因，研究其在花藥和莖葉的表達模式，為深入了解香石竹花發(fā)育的分子機制及運用于香石竹育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用香石竹（Dianthus caryophyllus）‘羅加特’采集地點為云南集創(chuàng)園藝科技有限公司寶峰基地。2018年9月采集香石竹莖、葉組織和不同發(fā)育時期的花蕾，并用鑷子取出幼嫩的花藥，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 DcSKP1基因克隆與生物信息學(xué)分析 取-80 ℃冰箱保存的香石竹花藥，加入磁珠，放入全自動樣品快速研磨機中，研磨60 s。迅速倒出磁珠，快速加入1 mL Trizol試劑（Invitrogen 美國）于離心管中，RNA提取按Trizol試劑盒的說明書進行操作。合成cDNA第一鏈?zhǔn)褂肨akara 公司的PrimeScript-RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒，按試劑盒的說明書進行操作。特異的引物根據(jù)已公布的香石竹基因組序列（http：//carnation.kazusa.or.jp/blast.html）進行設(shè)計，先擴增中間片斷，再根據(jù)中間片斷的序列設(shè)計3′-RACE 和5′-RACE引物，按照SMARTer RACE 5′/3′Kit（Takara日本）試劑盒的操作擴增3′-RACE和5′- RACE cDNA序列，最后再設(shè)計全長引物，擴增全長cDNA序列。引物序列如表1。

使用NCBI網(wǎng)站（http：//www. ncbi. nlm. nih.gov/BLAST）比對分析目的基因的同源序列，該基因及其他物種SKP1基因的氨基酸相似性比對分析用DNAMEN軟件，并使用MEGA 6.0軟件畫系統(tǒng)進化樹。蛋白的分子量和理論等電點預(yù)測采用ExPASy ProtParam分析，蛋白的亞細胞定位在線預(yù)測用PSORTII分析，蛋白的信號肽預(yù)測用Signal P 4.1分析，磷酸化位點預(yù)測采用Net Phos 2.0分析，蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測用TMHMM 2.0分析，蛋白親水性預(yù)測用Protscale 軟件分析。

1.2.2 DcSKP1基因的表達分析 選取長度為1.1～1.2 cm的花蕾、1.3～1.4 cm的花蕾和1.5～1.6 cm的花蕾，取出花藥，以及葉和莖的組織各三份，放入液氮中速凍。提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA稀釋10倍保存在-20 ℃的冰箱中備用，作為熒光定量PCR模板。GAPDH為內(nèi)參基因，引物為GAPDH 579-F和GAPDH 788-R，DcSKP1引物為Dca36455-1153F和Dca36455-1265R（表1）。做三次生物學(xué)和實驗重復(fù)，采用SPSS 12.0 軟件分析數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆DcSKP1基因全長cDNA序列

以提取的香石竹花藥cDNA為模板進行PCR擴增。首先擴增中間片斷，通過3′-RACE與5′-RACE技術(shù)擴增DcSKP1基因3′端和5′端序列，根據(jù)拼接后的cDNA全長序列設(shè)計引物擴增包括完整ORF在內(nèi)的DcSKP1基因全長cDNA序列，擴增的產(chǎn)物見圖1。DcSKP1基因中間片段擴增測序得到了500 bp的序列（圖1：A），DcSKP1基因5′端和3′端序列測序后得到了長度分別為376 bp（圖1：B）和567 bp（圖1：C）序列，將以上克隆得到的3段序列拼接后得到一個長度為962 bp的DcSKP1全長cDNA序列。再設(shè)計引物擴增cDNA全長包括完整ORF在內(nèi)的921 bp的序列（圖1：D），該序列與拼接后序列的堿基完全一致?？寺〗Y(jié)果表明，DcSKP1基因cDNA全長序列為 962 bp，含有1個長度為567 bp 的ORF，該基因編碼188個氨基酸，命名為DcSKP1（GenBank登錄號MK931293）。

2.2 DcSKP1氨基酸序列比對及進化分析

利用DNAMAN軟件比對分析多個不同物種Skp1基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)DcSKP1基因存在一個高度保守TPEE基序（157～160氨基酸），基序很可能與糖基化翻譯后修飾有關(guān)。該香石竹蛋白質(zhì)還具有Skp1_POZ結(jié)構(gòu)域（18～77氨基酸）和Skp1結(jié)構(gòu)域（139～186氨基酸）（圖2）。SKP1蛋白可分為兩種類型的蛋白和三種類型的基因 （Kong et al.， 2010）。I型蛋白由Ia型和Ib型基因編碼，具有兩個保守區(qū)域（Skp1_POZ和Skp1）和兩個可變區(qū)域。Ⅱ型蛋白由Ⅱ型基因編碼，與I型蛋白有很大不同。Ⅱ型蛋白含有一個額外的c端區(qū)域。Ia型基因包含單個內(nèi)含子，而Ib型基因不包含任何內(nèi)含子。Ⅱ型基因在多個位置有多個內(nèi)含子 （Min et al.， 2012）。本研究分離的DcSKP1基因包含一個內(nèi)含子，歸為I型蛋白和Ia型基因。

采用最大似然法 （maximum likelihood，ML）將其他物種的SKP1基因與香石竹DcSKP1氨基酸序列進行比對，建立系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示其與擬南芥的SKP1聚集在一個分支上（圖3），表明這兩個基因的同源性最高。

2.3 香石竹DcSKP1生物信息學(xué)分析

對DcSKP1進行氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析，DcSKP1的分子式為C913H1443N237O317S7，理論等電點為4.52，分子量為21 036.32 Da。該蛋白正電荷殘基為19，負電荷殘基為38，預(yù)測不穩(wěn)定指數(shù)為47.83，為不穩(wěn)定蛋白。香石竹DcSKP1 氨基酸組成中主要為 Glu 和 Leu，其中 Glu 所占比例約為 11.7%，Thr 所占比例約為10.1%。預(yù)測DcSKP1蛋白的亞細胞定位可能 52.2%在細胞核中，26.1%在細胞質(zhì)中，4.3%在高爾基體中，4.3%在細胞骨架中，4.3%在過氧化物酶體中，4.3%在質(zhì)膜和4.3%在線粒體中。Dcskp1 蛋白的信號肽無峰值出現(xiàn)（圖4），說明DcSKP1蛋白不存在信號肽，也說明該蛋白不屬于分泌蛋白。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測DcSKP1沒有跨膜螺旋，說明DcSKP1 是一個非跨膜蛋白。預(yù)測磷酸化位點發(fā)現(xiàn)在該蛋白質(zhì)序列中可能含有 48 個磷酸化位點（score>0.5），包含 16 個絲氨酸位點，12 個蘇氨酸位點和 1 個酪氨酸位點（圖5）。蛋白質(zhì)疏水性和親水性預(yù)測，該蛋白最可能是親水性蛋白（MIN：-2.489，MAX：2.011）（圖6）。

2.4 DcSKP1基因的熒光定量表達分析

熒光定量PCR結(jié)果顯示，DcSKP1基因在香石竹花藥3個不同發(fā)育時期均有表達，但表達趨勢逐漸下降，花蕾長度為1.1～1.2 cm（Stage 1）時的花藥表達量最高，花蕾長度為1.3～1.6 cm（Stage 2 和Stage 3）時期的花藥表達量低，且Stage 1與Stage 2和Stage 3有顯著差異，在莖和葉中表達量更低，與花藥中的表達量有顯著差異（圖7）。由此可見，DcSKP1基因可能與香石竹花藥發(fā)育相關(guān)，尤其與減數(shù)分裂有關(guān)。

3 討論和結(jié)論

SCF能參與一系列的生物學(xué)反應(yīng)，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和細胞周期調(diào)控 （宋瑜龍， 2011; 孫新艷等， 2017）。SCF復(fù)合物在酵母系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)，并且在細胞周期底物泛素化降解過程中發(fā)揮重要作用 （Feldman et al.， 1997）。SCF復(fù)合物由三個亞基組成：Cullin（CDC53）、SKP1和F-box蛋白，SKP1是SCF E3泛素連接酶蛋白復(fù)合物的核心成分，參與多種生物過程。 在這個復(fù)合物中，SKP1是一種連接蛋白，與Cullin和F-box蛋白結(jié)合。SKP1可以與許多F-box蛋白相互作用，泛素化不同的底物特異性因子 （Vierstra & Smalle， 2004）。煙草SKP1基因具有Skp1結(jié)構(gòu)域 （張付云等， 2007; 夏江宏等， 2015），亞細胞定位發(fā)現(xiàn)NtSKP1蛋白在胞漿和核部位均有表達 （張付云等， 2009）。香石竹DcSKP1基因存在Skp1_POZ結(jié)構(gòu)域和Skp1結(jié)構(gòu)域，還具有一個高度保守TPEE基序，很可能與糖基化的翻譯后修飾有關(guān)，香石竹DcSKP1基因通過軟件預(yù)測主要定位于細胞核。

擬南芥SKP1（atk1-1）突變體的雄性育性降低，有活力的花粉粒減少，雄配子減數(shù)分裂異常。atk1-1突變體中的雄性減數(shù)分裂產(chǎn)生反常數(shù)量的不同大小的小孢子，減數(shù)分裂紡錘體缺乏正常紡錘體的雙極結(jié)構(gòu)，這種異常的紡錘體可能是染色體異常分離和隨后的孢子和花粉異常的原因，atk1-1染色體在中期I中不正確排列也可能與異常的紡錘體有關(guān) （Chen et al.， 2002）。此外，ASK1還抑制花粉減數(shù)分裂中的重組 （Wang & Yang， 2006）。宋瑜龍（2011）對小麥的研究表明，SKP1 表達量急劇下降，可能會使細胞分裂不能正常進行，從而導(dǎo)致小麥花粉粒的生長發(fā)育受到影響，過早地趨于死亡，同時，SKP1 蛋白也會大幅度下降，大量的SCF 復(fù)合體很難形成，泛素蛋白酶體途徑受阻，導(dǎo)致一些細胞周期抑制蛋白降解不及時，進而影響花粉粒的活性，引起雄性不育的發(fā)生。本研究中香石竹DcSKP1基因在幼小的花藥中表達量高，隨著花藥的不斷發(fā)育表達量有所下降，而幼小的花藥正在進行減數(shù)分裂，提示DcSKP1基因可能參與香石竹減數(shù)分裂過程。

水稻OmSKP1主要定位于細胞核，OmSKP1在營養(yǎng)組織（葉）和生殖組織（花）中都有表達，且花中的表達水平明顯高于葉片，說明OmSKP1主要在花中進行表達 （范錫麟， 2013）。小麥TSK1基因在花藥、幼根以及花頂端分生組織等分生較旺盛的組織中有較強的表達，暗示該基因可能參與植物細胞分裂相關(guān)的過程 （李馳峻， 2006）。小麥在可育和不育株中，隨著花藥生長時期（單核期、二核期、三核期）的推后，SKP1 基因的相對表達量都逐步降低。但在同一個發(fā)育期，可育花藥中SKP1

基因的相對表達量比不育株花藥中SKP1基因的相對表達量高 （宋瑜龍， 2011）。在擬南芥中，ASK1基因在生殖生長和營養(yǎng)生長整個過程中都有持續(xù)、廣泛的表達，而在有絲分裂旺盛的部位以及減數(shù)分裂部位有更高的表達量 （Porat et al.， 1998）。ASK1基因的表達量在減數(shù)分裂細胞周期中有波動，從細線期到粗線期出現(xiàn)一個峰值水平。因此，細線期到粗線期對于ASK1的功能似乎至關(guān)重要 （Wang & Yang， 2006）。草莓FaSKP1-1基因在植物的各個組織部位如根、葉、莖、花瓣、花柱、花托、花粉及果實中均有表達 （殷姍姍等， 2016）。本研究對香石竹DcSKP1基因表達模式進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DcSKP1基因在各個組織部位都有表達，在花藥中的表達量高于莖、葉組織，且表達量具有顯著差異。這表明DcSKP1基因與花藥的發(fā)育有關(guān)，可能參與香石竹減數(shù)分裂的過程。本研究結(jié)果為研究香石竹花粉敗育的原因、減數(shù)分裂調(diào)控的信號通路和培育優(yōu)異的植物新品種奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李 莉）

收稿日期：? 2020-05-06

基金項目：? 國家自然科學(xué)基金（31860570）;云南省萬人計劃青年撥尖人才項目（YNWR-QNBJ-2018-389）;教育部部省合建重點項目（2018BSHJ0108）? [Supported by National Natural Science Foundation of China （31860570）; Young Talents Project of Yunnan Ten Thousand Plan （YNWR-QNBJ-2018-389）; Emphasis Project of Education Ministry and Provincial Cooperation （2018BSHJ0108） ]。

第一作者： 周旭紅（1978- ），博士，研究員，主要從事花卉遺傳育種研究，（E-mail） zhouxuhong7801@126.com。

*通信作者：? 瞿素萍，碩士，研究員，研究方向為花卉標(biāo)準(zhǔn)制定，（E-mail）1035496319@qq.com。

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