基于轉(zhuǎn)錄組的不同火龍果品種抗性差異分析

李健星 譚艷芳 李冬興 王斌 陳婷 黃甫昭 陸樹華

摘 要：? 不同的品種抗性不同，為進(jìn)一步探究不同火龍果品種之間的抗性差異，為后續(xù)火龍果抗性育種提供參考，該研究利用Illumina HiSeq 2000 測序平臺對‘普通白肉（BR）和 ‘厄瓜多爾黃龍（EY）兩個品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，并參考GO Ontology、KEGG等公共數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類與富集分析。結(jié)果表明：（1） BR與EY共有14 248個差異基因，其中5 446個基因上調(diào)，8 802個基因下調(diào)。（2） 相關(guān)GO功能分析表明這些差異基因主要參與酶催化活性、細(xì)胞組分、代謝過程等，其中參與氧化還原酶活性的349個差異基因在BR中表達(dá)量上調(diào)。（3）KEGG通路分析顯示，大部分差異基因富集在新陳代謝和生物合成等，其中參與角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成的差異基因有12個，如CYP86和CER1等。參與氧化還原酶活性的差異基因在BR中較EY表達(dá)量上調(diào)，且顯著富集，表明BR與EY在生長發(fā)育和細(xì)胞代謝過程差異顯著。參與角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成的差異基因在BR中表達(dá)量上調(diào)，此類基因在BR中具有較高的表達(dá)量且顯著富集，表明BR可能具有較強(qiáng)的抗旱和抗病能力。

關(guān)鍵詞： 火龍果， 轉(zhuǎn)錄組， 品種， 差異表達(dá)基因

中圖分類號：? Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）02-0183-08

收稿日期：? 2021-07-04

Resistance difference between different varieties of

pitaya based on transcriptome data

LI Jianxing1，2， TAN Yanfang1， LI Dongxing1，2， WANG Bin1，2， CHEN Ting1，2，

HUANG Fuzhao1，2， LU Shuhua1，2*

（ 1. Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China;

2. Guangxi Key Laboratory of Plant Conservation and Restoration Ecology in Karst Terrain， Guangxi Institute of Botany，

Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China ）

Abstract：? Different varieties have different resistances. In order to further explore the resistance differences in different varieties of pitaya and to provide a reference for further study on breeding of pitaya resistance， we used Illumina HiSeq 2000 sequence platform to sequence the transcriptomes of ‘Putongbairou （BR） and ‘Ecuador Yellow （EY）. Functional classification and enrichment analysis of differentially expressed genes （DEGs） were performed by reference to GO Ontology， KEGG and others databases. The results were as follows： （1） There were 14 248 DEGs between BR and EY， of which 5 446 genes were up-regulated and 8 802 genes were down-regulated. （2） GO functional analysis showed that these DEGs were mainly involved in enzyme catalytic activity， cell components， metabolic processes， etc. Among them， there were 349 differential genes involved in oxidoreductase activity. （3） KEGG pathway analysis showed that most of the DEGs were enriched in metabolism， biosynthesis， etc.， and 12 key genes such as CYP86 and CER1 involving in cutin， suberine and wax biosynthesis. We found that the expressions of DEGs involved in oxidoreductase activity were higher in BR than those in EY， which significantly enriched， indicating that may be significant differences in growth and cell metabolism between BR and EY. DEGs involved in the cutin， suberine and wax biosynthesis were up-regulated in BR， and such genes had higher expressions in BR， and were significantly enriched， which suggest that BR may be superior drought and disease resistance than EY.

Key words： pitaya， transcriptome， varieties， differentially expressed genes

火龍果屬仙人掌科（Cactaceae）、量天尺屬（Hylocereus Britton & Rose）或蛇鞭柱屬（Selenicereus Britton & Rose）植物，營養(yǎng)美味以及獨(dú)特的外觀使其成為消費(fèi)者追捧的新興熱帶水果（陶金等， 2014）。近幾年，我國火龍果產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，據(jù)最新數(shù)據(jù)，截至2020年底，全國火龍果種植面積已超過100萬畝，并形成以廣西、廣東、海南、云南和貴州五?。▍^(qū)）為核心的主產(chǎn)區(qū)。特別近年來在廣西石漠化區(qū)推廣種植成功，形成貧困山區(qū)脫貧致富雙贏的“果化模式”，火龍果耐旱、耐瘠，有利于石山地區(qū)水土保持，在改善生態(tài)環(huán)境的同時又可增加可觀的經(jīng)濟(jì)效益。作為一種新興水果，近年來國內(nèi)外對火龍果的研究也越來越深入，主要集中在不同品種的理化性質(zhì)和營養(yǎng)價值、功能性物質(zhì)提取、栽培技術(shù)、病蟲害研究（趙志平 和 楊春霞，2006;Menezes et al.， 2015;陳煜等， 2017; 彭金輪，2017;Kee et al.， 2019; Magalhes et al.， 2019; Rahmati et al.， 2019），轉(zhuǎn)錄組測序與微衛(wèi)星引物開發(fā)（楊仕美等， 2018;武志江等， 2020），屬間親緣關(guān)系、雜交及新品種的培育（Tel-Zur et al.， 2004a， b， 2011， 2012;Ortiz-Hernández & Carrillo-Salazar，2012）等方面。

量天尺屬含有14個種，世界范圍內(nèi)廣泛栽培的火龍果主要為量天尺屬植物，有H. undatus、H. monacanthus和H. megalanthus（Ortiz-Hernández & Carrillo-Salazar， 2012）。通過雜交，目前火龍果品種繁多，黃鳳珠等（2019）收集了218份種質(zhì)資源，也有相關(guān)文獻(xiàn)報道，在種質(zhì)資源保存過程中發(fā)現(xiàn)，不同品種的火龍果其抗旱和抗病能力差異顯著（梁秋玲等，2011;李潤唐等，2017）。目前通過RNA-seq技術(shù)，可獲得大量的轉(zhuǎn)錄組序列信息，開展基因表達(dá)與功能分析，構(gòu)建信號通路等。本文對火龍果品種‘普通白肉和‘厄瓜多爾黃龍植株幼嫩莖段組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組序列從頭組裝，通過Unigene表達(dá)豐度分析、差異表達(dá)分析、GO和KEGG富集分析等，從轉(zhuǎn)錄組層面闡明火龍果不同品種之間的差異，可為火龍果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、推廣及應(yīng)用提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

火龍果品種‘普通白肉（BR，以下簡稱‘白肉）、‘厄瓜多爾黃龍（EY，以下簡稱‘黃龍）均取自廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所火龍果研究基地（圖1），選取標(biāo)記這兩個品種莖段上開始出芽的位置，待其生長7 d，取幼嫩莖段，每個品種設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，采集后立即放入液氮中，交由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2 文庫構(gòu)建

首先，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集火龍果樣品中的mRNA;然后，將打斷的mRNA作為模板，合成二鏈cDNA;再進(jìn)行純化、末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭;最后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物，構(gòu)建文庫。待文庫檢測合格后上機(jī)測序，采用Illumina HiSeqTM 2000 PE150對樣品轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行高通量測序。

1.3 De novo拼接和注釋

過濾測序得到Raw reads，獲得Clean reads。在Trinity軟件（Grabherr et al.， 2011）中進(jìn)行De novo拼接。在NCBI blast中將拼接完成的Unigene與NCBI非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫、NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫、KOG（clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes）數(shù)據(jù)庫和KEGG（kyotoencyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋。利用HMMER 3.0 package與Protein family（Pfam）進(jìn)行比對（hmmscan e-value≤1e-2）。在Blast2go（http：//www.blast2go.com/ b2ghome）軟件和WEGO軟件中進(jìn)行GO（gene ontology）注釋、分類統(tǒng)計。

1.4 差異基因表達(dá)分析

采用DESeq2（Love et al.， 2014）軟件進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，將差異倍數(shù)|log2FoldChange|>1且padj<0.05作為篩選差異表達(dá)基因（DEGs）的條件。對符合條件的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO Ontology和KEGG Pathway分類，利用超幾何檢驗(yàn)對注釋到的不同的GO（P < 0.05）和KEGG 條目（P < 0.05）進(jìn)行富集分析。采用FPKM 值（fragments per kilobase of transcriptper million fragments mapped）來展現(xiàn)基因表達(dá)水平的高低，在R軟件中繪制差異基因表達(dá)量的火山圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與組裝

為進(jìn)一步探究不同品種火龍果的分子差異機(jī)制，對2個品種火龍果共6個樣本進(jìn)行 RNA-seq分析，獲得平均7.71 Gb Clean reads，Q30 均在 90% 以上，總堿基中的GC數(shù)量比例為49.06%（表1），表明測序結(jié)果良好，Clean reads質(zhì)量合格，可進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析。

2.2 火龍果轉(zhuǎn)錄組Unigene的功能注釋

使用BLAST將所有Unigene與NR、GO、KO、Swiss-Prot、PFAM、KOG、NT共7個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行一致性比對分析，對各數(shù)據(jù)庫注釋的Unigene數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計，進(jìn)而獲得火龍果轉(zhuǎn)錄組Unigene的功能注釋信息。結(jié)果表明，28 551條Unigene（45.02%）在NR數(shù)據(jù)庫比對成功得到注釋，在GO、KO、Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫獲得注釋的Unigene數(shù)目依次為23 082（36.40%）、11 011（17.36%）、21 352（33.67%）（圖2）。4 493條Unigene同時在所有數(shù)據(jù)庫中注釋，至少有1個數(shù)據(jù)庫注釋成功共34 692條（54.71%），28 714條未獲得注釋。

2.3 不同火龍果品種差異表達(dá)基因分析

對‘白肉和‘黃龍火龍果的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。結(jié)果表明，‘白肉和‘黃龍火龍果之間有14 248個差異基因（padj < 0.05且|log2FoldChange|>1）。其中，‘白肉相對于‘黃龍，有5 446個基因上調(diào)，表達(dá)量高于‘黃龍;有8 802個基因下調(diào)，表達(dá)量低于‘黃龍（圖3）。

2.4 差異表達(dá)基因GO功能分類與富集分析

為分析‘白肉與‘黃龍差異基因的生物學(xué)功能，將14 248個差異基因注釋到GO Ontology數(shù)據(jù)庫中，分別從生物學(xué)過程（biological process， BP）、細(xì)胞組分（cellular component， CC）和分子功能（molecular function，MF）3個方面，其中：在生物學(xué)過程分類中，參與氧化還原過程、碳水化合物代謝過程的差異基因數(shù)目最多，分別為632和371個;在細(xì)胞組分分類中，主要是被膜等的差異基因組多，有234個;在分子功能分類中，主要是氧化還原酶最多，有618個。

以富集P值小于0.05作為富集標(biāo)準(zhǔn)。在生物過程分類中富集了包括DNA整合、mRNA修飾、mRNA甲基化、有絲分裂、RNA甲基化等39個條目;在細(xì)胞組分分類中顯著富集了包括肌質(zhì)、肌質(zhì)網(wǎng)等28個條目;在分子功能分類中顯著富集了包括四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合、鐵離子結(jié)合等54項(xiàng)。結(jié)果說明，‘白肉與‘黃龍在生長發(fā)育、細(xì)胞代謝過程等方面存在差異。對上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別進(jìn)行功能分類，在‘白肉與‘黃龍差異表達(dá)基因中滿足P值小于0.05的GO條目即為GO功能顯著富集，部分結(jié)果見圖4。對5 446個上調(diào)基因進(jìn)行GO功能分類與富集分析，結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程分類中，參與氧化還原過程（oxidation-reduction process）的GO term顯著富集，其中包含差異基因341個;在分子功能分類中，參與氧化還原酶活性 （oxidoreductase activity）的GO term顯著

A： A. 氧化還原過程; B. 氧化還原酶活性; C. 抗氧化活性; D. 氧化還原酶活性，作用于過氧化物作為受體; E. 鐵離子結(jié)合; F.? 四吡咯結(jié)合; G. 血紅素結(jié)合。B： A. DNA整合; B. mRNA修飾; C.? mRNA甲基化; D.? RNA甲基化; E.? 病毒殼體; F.? virion部件; G. RNA定向RNA聚合酶復(fù)合物; H.? mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性; I.? 氧裂解酶活性，作用于磷酸鹽; J. 萜烯合酶活性; K. ADP結(jié)合; L.? RNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性; M. 腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶活性; N. RNA定向RNA聚合酶活性。

富集，其中包含差異基因349個，表明‘白肉與‘黃龍在生長發(fā)育、細(xì)胞代謝過程等方面存在差異;在分子功能分類中，抗氧化活性（antioxidant activity）的GO term富集，表明‘白肉和‘黃龍在抗旱性方面有差異。在下調(diào)基因中，主要集中在DNA整合（DNA integration）等方面，差異無顯著表現(xiàn)。

2.5 差異表達(dá)基因KEGG Pathway 富集分析

‘白肉與‘黃龍共有2 237個差異表達(dá)基因注釋到特定的KEGG通路中，這些通路主要為新陳代謝、生物合成、糖酵解、信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)加工等。其中：注釋到新陳代謝的差異基因838個，占差異基因總注釋數(shù)目的37.5%;注釋到生物合成的差異基因335個，占差異基因總注釋數(shù)目的15.0%。以P < 0.05作為篩選顯著富集的條件，‘白肉中表達(dá)量較‘黃龍上調(diào)的差異基因主要富集在生物合成方面，例如角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成（cutin， suberine and wax biosynthesis）、苯丙素的生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、吲哚生物堿的生物合成（indole alkaloid biosynthesis）等（圖5）。其中，參與角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成的差異基因有12個，分別是HHT1、CYP86B1、CYP86A1、FAR、CYP86A1、HHT1、PXG、CYP86A4S、K15404、CER1 FAR K15404、CER1 K15404、CER1。‘白肉中表達(dá)量較‘黃龍下調(diào)的差異基因主要富集在生物合成方面，例如類倍半萜和三萜的生物合成（sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis）、精氨酸的生物合成（arginine biosynthesis）、脂肪酸的生物合成（fatty acid biosynthesis）等（圖6）。

A.? 維生素B6代謝; B.? 泛醌和其他萜類醌生物合成; C. 酪氨酸代謝; D.? RNA聚合酶; E.? 嘧啶代謝; F. 蛋白酶體; G.? 光合作用天線蛋白; H.? 光合作用; I.? 苯丙素的生物合成; J.? 苯丙氨酸代謝; K. 戊糖和葡糖醛酸相互轉(zhuǎn)化; L. 氧化磷酸化; M. 吲哚生物堿生物合成; N.? 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝; O. 半胱氨酸和蛋氨酸代謝; P. 角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成; Q.? 甜菜色素生物合成; R.? 抗壞血酸鹽和醛酸鹽代謝; S.? 精氨酸和脯氨酸代謝; T. 氨基糖和核苷酸糖代謝。

3 討論與結(jié)論

高通量測序技術(shù)已經(jīng)成為不同品種差異分析的常用策略，例如煙草（李智奕，2014）、大豆（張馳等，2015）、桂花（張雪松等，2016）、百香果（王宇等，2019）等。本研究利用RNA-seq技術(shù)對火龍果不同品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，基于良好的測序結(jié)果，進(jìn)一步對‘白肉與‘黃龍火龍果的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共有14 248個差異表達(dá)基因，通過GO Ontology分析表明這些差異表達(dá)基因主要富集在新陳代謝、生物合成、糖酵解、信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)加工等過程，說明‘黃龍可能在生長發(fā)育、抗性方面與‘白肉有差異。在分子功能分類中，與‘黃龍相比，‘白肉火龍果上調(diào)表達(dá)的基因中參與氧化還原酶活性的差異基因有349個，表明‘白肉與‘黃龍在生長發(fā)育、細(xì)胞代謝過程差異顯著，‘白肉比‘黃龍的生長發(fā)育更快，代謝更加旺盛，與實(shí)際栽培種植過程中的現(xiàn)象相符?！兹獗憩F(xiàn)出比‘黃龍更快的生長速度，在一年中結(jié)果的批次、果實(shí)的發(fā)育都有差異，‘白肉一年結(jié)果大概8批，從授粉到成熟需要28～30 d，‘黃龍一年結(jié)果2批，夏果和冬果，成熟期需要90～120 d。在分子功能分類中，兩者抗氧化活性差異顯著，表明‘白肉和‘黃龍在抗旱性方面有差異。為了在干旱環(huán)境中生存，仙人掌科植物必須具備干旱反應(yīng)機(jī)制，特別是抗氧化防御系統(tǒng)。持續(xù)的干旱脅迫會導(dǎo)致氧化性物質(zhì)，如O2、H2O2、O2-、OH的積累，這些物質(zhì)會損害細(xì)胞，甚至導(dǎo)致死亡（Fang & Xiong， 2015），這些抗氧化活性基因在‘白肉中富集，上調(diào)表達(dá)，可能使得‘白肉抗干旱能力強(qiáng)于‘黃龍。

在KEGG Pathway中以P < 0.05作為富集條件，在‘白肉上調(diào)表達(dá)的基因中，主要富集在角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成，其中參與角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成的差異基因有12個，主要代表有CYP86和CER1。植物蠟質(zhì)是植物在進(jìn)化過程中為了適應(yīng)環(huán)境的變化而演變出來的一種結(jié)構(gòu)，表皮蠟質(zhì)在植物抵御外界不良環(huán)境、保持組織和器官功能、保證植物正常發(fā)育等方面具有重要作用（李魏強(qiáng)等，2006;胡曉敏等，2007;任春濤等，2019）。上表皮蠟沉積的主要功能是減少表皮的水分流失，這一特性有助于增強(qiáng)耐旱能力。此外，在與草食性昆蟲和植物病原真菌的相互作用中具有重要作用（Aarts et al.， 1995），蠟質(zhì)層在一定程度上可使植物免受低溫脅迫作用（李婧婧等，2011）。其中，12個關(guān)鍵基因參與角質(zhì)、亞黃素和蠟的生物合成，如CYP86編碼ω-基脂肪酸的形成，促進(jìn)軟木脂生物合成，形成角質(zhì)層。這些脂肪類生物聚合物可防止植物水分和營養(yǎng)流失以及病原體的感染（Aarts et al.， 1995; Hofer et al.， 2008）。CER1編碼參與長鏈醛轉(zhuǎn)化為烷烴的蛋白，這是植物體中蠟生物合成的關(guān)鍵步驟（Hofer et al.， 2008）。本研究對這些關(guān)鍵調(diào)控基因分析發(fā)現(xiàn)，此類基因在‘白肉中具有較高的表達(dá)量，這些可能與植物的抗旱和抗病有關(guān)。

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（責(zé)任編輯 李 莉）

基金項(xiàng)目：? 國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目（2019YFC0507503，2019YFC0507504-03）;廣西創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展專項(xiàng)資金（桂科AA2016100403-01）;廣西自然科學(xué)基金（2019GXNSFBA245097）;廣西喀斯特植物保育與恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金（19-050-6）? [Supported by National Key Research and Development Program （2019YFC0507503， 2019YFC0507504-03）;Innovation-Driven Development Special Fund of Guangxi （AA2016100403-01）;Natural Science Foundation of Guangxi （2019GXNSFBA245097）;Fund of Guangxi Key Laboratory of Plant Conservation and Restoration Ecology in Karst Terrain （19-050-6）]。

第一作者： 李健星（1992-），碩士，助理研究員，主要從事植被生態(tài)學(xué)研究，（E-mail）jxlee140820@163.com。

*通信作者：? 陸樹華，副研究員，主要從事恢復(fù)生態(tài)學(xué)研究，（E-mail）lushuhua13@163.com。