聯(lián)合應(yīng)用常染色體STR和SNP排除半同胞關(guān)系1例

徐倩南，朱如心，姜磊，李成濤，劉希玲

1.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；2.河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000

1 案 例

1.1 簡(jiǎn)要案情

宋某（男性）和魏某（女性）委托本院對(duì)兩者之間有無(wú)生物學(xué)半同胞關(guān)系進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2 檢驗(yàn)過(guò)程

按照《法庭科學(xué)DNA 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》（GA/T 383—2014）對(duì)兩名被鑒定人（宋某和魏某）的血紗布進(jìn)行DNA 提取。

1.2.1 常染色體STR 基因座檢測(cè)

分別采用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統(tǒng)（司法鑒定科學(xué)研究院研發(fā)）、Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng)22NC［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］和21+1 STR 熒光檢測(cè)試劑盒（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）對(duì)兩名被鑒定人的常染色體短串聯(lián)重復(fù)序列（autosomal-short tandem repeat，A-STR）基因座進(jìn)行復(fù)合PCR 擴(kuò)增，用3130xl基因分析儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳和基因型分析。

1.2.2 常染色體SNP 位點(diǎn)檢測(cè)

采用ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒（美國(guó)Verogen公司）的引物混合物A對(duì)兩名被鑒定人的94個(gè)常染色體單核苷酸多態(tài)性（autosomal-single nucleotide polymorphism，A-SNP）位點(diǎn)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，用MiSeq FGx 測(cè)序系統(tǒng)（美國(guó)Verogen 公司）進(jìn)行高通量測(cè)序和基因型分析。由于檢測(cè)所用的引物混合物A中除含94 個(gè)A-SNP 外，還含27 個(gè)A-STR，因此同時(shí)還得到27 個(gè)A-STR 的分型信息，這27 個(gè)A-STR 均包含在1.2.1 節(jié)所述的三款A(yù)-STR 檢測(cè)試劑盒所測(cè)基因座中。

1.2.3 指數(shù)計(jì)算

采用似然比法[1]計(jì)算半同胞指數(shù)（half sibling index，HSI）和累積半同胞指數(shù)（cumulative half sibling index，CHSI）。

1.3 檢測(cè)結(jié)果

1.3.1 A-STR 檢測(cè)結(jié)果

利用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統(tǒng)檢測(cè)了21 個(gè)A-STR，其CHSI 值為0.001 7。利用Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng)22NC 檢測(cè)了21 個(gè)A-STR，其CHSI 值為0.241 6。利用21+1 STR 熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了21 個(gè)A-STR，其CHSI 值為6.943 9。去除三款試劑盒中的重復(fù)基因座，共含55 個(gè)A-STR（表1），其CHSI 值為0.008 9。

表1 55 個(gè)A-STR 的分型結(jié)果Tab.1 Typing results of 55 A-STRs

1.3.2 A-SNP 檢測(cè)結(jié)果

ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒的引物混合物A 檢測(cè)了94 個(gè)A-SNP，除13 個(gè)A-SNP 未在兩名被鑒定人中成功得到分型結(jié)果外，其余81 個(gè)A-SNP的分型結(jié)果均成功獲得（表2），經(jīng)計(jì)算，其CHSI 值為0.006 9。

表2 81 個(gè)A-SNP 的分型結(jié)果Tab.2 Typing results of 81 A-SNPs

1.3.3 聯(lián)合應(yīng)用A-STR 和A-SNP 的HSI 計(jì)算結(jié)果

聯(lián)合應(yīng)用A-STR 和A-SNP 分型結(jié)果計(jì)算CHSI，其中：（1）利用ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得27 個(gè)A-STR 和81 個(gè)A-SNP，其CHSI 值為6.483 3×10-5；（2）利用21+1 STR 熒光檢測(cè)試劑盒的21 個(gè)ASTR和ForenSeq DNA Signature Prep試劑盒所得81個(gè)A-SNP，其CHSI值為0.048 2；（3）利用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)22NC 的21 個(gè)A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個(gè)A-SNP，其CHSI 值為0.001 7；（4）利用21+1 STR 熒光檢測(cè)試劑盒和Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng)22NC 兩個(gè)試劑盒的37 個(gè)ASTR 以 及ForenSeq DNA Signature Prep試劑盒所得81個(gè)A-SNP，其CHSI值為0.004 6；（5）利用SiFaSTRTM23plex DNA身份鑒定系統(tǒng)的21 個(gè)A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81個(gè)A-SNP，其CHSI值為1.148 3×10-5；（6）利用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統(tǒng)和Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)22NC的39 個(gè)A-STR 以 及ForenSeq DNA Signature Prep 試 劑盒所得81 個(gè)A-SNP，其CHSI 值為1.022 9×10-5；（7）利用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統(tǒng)和21+1 STR熒光檢測(cè)試劑盒的40 個(gè)A-STR 以及ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個(gè)A-SNP，其CHSI 值為4.649 0×10-5；（8）利用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統(tǒng)、Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng)22NC 和21+1 STR 熒光檢測(cè)試劑盒的55 個(gè)A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個(gè)A-SNP，其CHSI 值為6.181 6×10-5。

1.4 鑒定意見(jiàn)

聯(lián)合應(yīng)用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統(tǒng)、Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng)22NC 和21+1 STR 熒光檢測(cè)試劑盒的55個(gè)A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個(gè)A-SNP 的分型結(jié)果計(jì)算，可得CHSI值為6.181 6×10-5。依據(jù)現(xiàn)有資料和DNA 分型結(jié)果綜合分析，傾向于認(rèn)為宋某與魏某為無(wú)關(guān)個(gè)體。

2 討論

生物學(xué)半同胞關(guān)系鑒定在日常檢案中的數(shù)量逐年增多，但由于技術(shù)手段的限制和相應(yīng)鑒定規(guī)范的缺乏，一直以來(lái)是司法鑒定實(shí)踐中的難點(diǎn)。通常，包括半同胞關(guān)系鑒定在內(nèi)的復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定可根據(jù)多個(gè)被鑒定人進(jìn)行家系重建，并根據(jù)A-STR 分型結(jié)果推斷父母基因型，從而推斷被鑒定人之間的親緣關(guān)系[2]。也有學(xué)者[3-6]提出同時(shí)檢測(cè)A-STR、性染色體STR 或mtDNA 來(lái)進(jìn)行半同胞關(guān)系的判定。本例中只有兩人參與鑒定，且性別不同，使得Y-STR 無(wú)法發(fā)揮其應(yīng)用價(jià)值，X-STR 的應(yīng)用價(jià)值也極為有限[4]。通過(guò)mtDNA 高變區(qū)（hypervariable region，HVR）Ⅰ和Ⅱ的序列分析僅可在同母異父半同胞關(guān)系鑒定中用于輔助推斷，無(wú)法為半同胞關(guān)系的認(rèn)定提供有力證據(jù)[4]，同時(shí)，mtDNA 全序列的測(cè)定需在二代測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行[3，7]，對(duì)樣本質(zhì)量要求較高。本例樣本為帶血紗布，所含血樣較少，無(wú)法滿(mǎn)足測(cè)定mtDNA 全序列對(duì)樣本的要求。因此，聯(lián)合應(yīng)用多種常染色體遺傳標(biāo)記成為解決本例的重要策略，已有研究[8-9]報(bào)道聯(lián)合應(yīng)用ASTR 和A-SNP 可為半同胞關(guān)系鑒定提供可靠依據(jù)。

基于上述分析，本例選用三款A(yù)-STR 分型試劑盒以及基于MiSeq FGx 測(cè)序系統(tǒng)的ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒，其中ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒可 同時(shí)檢測(cè)27 個(gè)A-STR 和94 個(gè)A-SNP，其靈敏度可低至200 pg[10]，對(duì)樣本質(zhì)量的要求較低，但本例樣本為帶血紗布，所含血樣較少，使得提取所得DNA 量極其有限，因此，在系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)下成功得到81 個(gè)A-SNP 的分型結(jié)果，依然有13 個(gè)A-SNP 未得到分型結(jié)果。本例在對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，還計(jì)算了各個(gè)試劑盒分型結(jié)果下的CHSI 值。ZHANG等[9]研究了聯(lián)合使用21+1 STR 熒光檢測(cè)試劑盒和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒在親緣關(guān)系鑒定方面的價(jià)值，由于ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒可同時(shí)檢測(cè)27 個(gè)A-STR，其中有8 個(gè)與21+1 STR 熒光檢測(cè)試劑盒共有，因此最終探討了40 個(gè)ASTR 和91 個(gè)A-SNP 在親緣關(guān)系鑒定中的應(yīng)用，計(jì)算了全同胞關(guān)系指數(shù)和部分二級(jí)親緣關(guān)系指數(shù)，并通過(guò)設(shè)定單邊閾值判定親緣關(guān)系，結(jié)果表明，將閾值設(shè)定為1、10、100 或1 000 時(shí)，判定二級(jí)親緣關(guān)系的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性均無(wú)法達(dá)到100%。LI 等[8]研究ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒在提高親緣關(guān)系鑒定效能的表現(xiàn)時(shí)，通過(guò)計(jì)算所測(cè)27 個(gè)A-STR 和94 個(gè)A-SNP 的似然率，設(shè)置雙邊閾值來(lái)判定個(gè)體之間的親緣關(guān)系。在判定二級(jí)親緣關(guān)系時(shí)，將較低閾值設(shè)定為0.000 1，較高閾值設(shè)定為10 000，即當(dāng)二級(jí)親緣關(guān)系指數(shù)小于0.000 1 時(shí)判定兩者為無(wú)關(guān)個(gè)體，當(dāng)二級(jí)親緣關(guān)系指數(shù)大于10 000 時(shí)判定兩者為二級(jí)親緣關(guān)系，以此使得整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（指被正確判定為有關(guān)系個(gè)體的比例）和陰性預(yù)測(cè)值（指被正確判定為無(wú)關(guān)個(gè)體的比例）均達(dá)到100%。半同胞關(guān)系屬于二級(jí)親緣關(guān)系的一種，本例通過(guò)聯(lián)合使用55 個(gè)A-STR 和81 個(gè)A-SNP，得到CHSI 值為6.181 6×10-5，小于0.000 1，傾向于認(rèn)為兩者為無(wú)關(guān)個(gè)體。

此外，聯(lián)合應(yīng)用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統(tǒng)和21+1 STR 熒光檢測(cè)試劑盒的40 個(gè)A-STR以及ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個(gè)A-SNP 或聯(lián)合應(yīng)用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統(tǒng)和Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng)22NC 的39 個(gè)A-STR 以 及ForenSeq DNA Signature Prep試劑盒所得81 個(gè)A-SNP，也傾向于認(rèn)為兩者為無(wú)關(guān)個(gè)體。甚至僅聯(lián)合應(yīng)用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統(tǒng)的21 個(gè)A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試 劑盒所得81 個(gè)A-SNP，所得CHSI 值也小于0.000 1，同樣傾向于認(rèn)為兩者為無(wú)關(guān)個(gè)體。若單獨(dú)使用ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得27 個(gè)A-STR 和81 個(gè)A-SNP 計(jì)算，也得出相同的結(jié)論，且相較于SiFaSTRTM23plex DNA 身份鑒定系統(tǒng)的21 個(gè)A-STR，還增加了6 個(gè)A-STR（D17S1301、D20S482、D22S1045、D2S441、D4S2408和D9S1122）。而聯(lián)合應(yīng)用21+1 STR 熒 光檢測(cè)試劑盒的21 個(gè)A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個(gè)A-SNP 或Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)22NC 的21 個(gè)A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個(gè)A-SNP，無(wú)法得出可靠結(jié)論。同樣的，聯(lián)合應(yīng)用21+1 STR 熒光檢測(cè)試劑盒和Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng)22NC 的37 個(gè)ASTR 以 及ForenSeq DNA Signature Prep 試劑盒所得81 個(gè)A-SNP，也無(wú)法得出可靠結(jié)論。由此可見(jiàn)，僅增加所測(cè)常染色體基因座的數(shù)量有時(shí)并不能達(dá)到提高親緣關(guān)系鑒別能力的目的。本例首先考慮使用基于毛細(xì)管電泳平臺(tái)的三款試劑盒以期得出結(jié)論，在發(fā)現(xiàn)使用55 個(gè)A-STR 無(wú)法得到明確結(jié)論后，再采用二代測(cè)序試劑盒加測(cè)A-SNP，從而在保證節(jié)省人力物力的情況下得到更多信息來(lái)支撐最終的鑒定意見(jiàn)。

近年來(lái)，隨著檢測(cè)技術(shù)的提高，越來(lái)越多的遺傳標(biāo)記可通過(guò)二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)定，大大提高了包括半同胞關(guān)系鑒定在內(nèi)的復(fù)雜親緣關(guān)系的檢測(cè)效能。但在實(shí)際案件中，應(yīng)根據(jù)案件的獨(dú)特性挑選適合的遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢驗(yàn)，而不是一味追求遺傳標(biāo)記數(shù)量的增多。目前關(guān)于半同胞關(guān)系鑒定的相關(guān)研究依然較少，且無(wú)針對(duì)性的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)頒布，使得半同胞關(guān)系的甄別依然存在較大的風(fēng)險(xiǎn)，因此，在今后的類(lèi)似案件中，應(yīng)根據(jù)情況結(jié)合多方數(shù)據(jù)綜合分析判斷。