北川羌族人群57 個常染色體InDel 位點的遺傳多態(tài)性及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

蔣春月，馬浩，范慶煒，楊慧凌，徐冬冬，王韻，杜冰，2

1.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心，四川 南充 637000

插入/缺失（insertion/deletion，InDel）是基因組中插入或缺失一個或多個堿基而形成的遺傳標(biāo)記，屬于二等位基因遺傳標(biāo)記[1]。InDel 多態(tài)性遺傳標(biāo)記兼具STR和SNP的優(yōu)點，突變率低，擴增片段可小于100 bp，適用于降解檢材，可采用目前法醫(yī)學(xué)主流遺傳標(biāo)記STR 常用的毛細管電泳平臺進行分型，受到國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者的關(guān)注[2]。本研究擬通過調(diào)查AGCU InDel 60熒光檢測試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）中57 個常染色體InDel（autosomal-InDel，A-InDel）位點在四川省北川羌族自治縣羌族人群中的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，評估其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 樣本

按照知情同意原則，用FTA 采血卡采集200 例四川省北川羌族健康無關(guān)個體的血樣，其中男性171例，女性29 例。

通過Ensembl數(shù)據(jù)庫（http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens）查詢千人基因組計劃Ⅲ期數(shù)據(jù)，獲得5 個東亞人群、5 個南亞人群、7 個非洲人群、4 個美洲人群以及5 個歐洲人群共26 個人群的InDel 位點基因型和等位基因頻率作為比較數(shù)據(jù)，探討本研究人群與這些人群的遺傳關(guān)系，具體信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫中26 個人群的信息Tab.1 Information of 26 populations in the database

本研究已獲得川北醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，審批文號為［2021］14 號。

1.2 PCR 擴增

根據(jù)AGCU InDel 60 熒光檢測試劑盒說明書，采用直接擴增法（免提?。ρ獦舆M行PCR 擴增。擴增體系為10 μL，其中Reaction Mix 4 μL、InDel 60 Primers 2 μL、熱啟動U-Taq酶0.4 μL、去離子水3.6 μL，模板DNA為直徑1.2 mm的血斑1片。采用9700型PCR儀（美國Applied Biosystems 公司）進行擴增，擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，62 ℃60 s，25 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 毛細管電泳和數(shù)據(jù)分析

采用3500 基因分析儀（美國Applied Biosystems公司）進行毛細管電泳。取1 μL PCR 產(chǎn)物、10 μL去離子甲酰胺和0.3 μL 內(nèi)標(biāo)AGCU Marker SIZ-500 混勻，95 ℃變性3 min 后，立即冰浴3 min。用GeneMapper?ID-X1.4 軟件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）進行分型。InDel 位點中的插入（insertion）等位基因和缺失（deletion）等位基因分別命名為I 和D，Amelogenin位點的兩個等位基因分別為X 和Y。

1.4 質(zhì)量控制

每批樣本的檢測均采用去離子水和標(biāo)準(zhǔn)品9948分別作為擴增的陰性對照和陽性對照。

1.5 統(tǒng)計分析

采用Modified-Powerstats 標(biāo)準(zhǔn)版軟件計算獲得57 個A-InDel 位點的等位基因頻率（Fins和Fdel）、DP、PIC、CDP。采用Cervus 3.0.7 軟件（http://www.fieldge netics.com/pages/home.jsp）進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗，并計算Ho、He、PEtrio、PEduo、CPEtrio和CPEduo。使用STRAF 網(wǎng)頁版（http://cmpg.unibe.ch/shiny/STRAF/）進行連鎖不平衡分析。采用Arlequin 3.5.2.2軟件計算遺傳分化系數(shù)（Fst），并基于基因型數(shù)據(jù)計算27 個人群的Fst遺傳距離，再用MEGA 5.05 軟件（https://megasoft ware.net/）采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用POPTREE2 軟件基于基因頻率計算27 個人群的Nei’s 遺傳距離，并采用NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 等位基因分型結(jié)果

200 例北川羌族無關(guān)個體的血樣中，57 個AInDel、2 個Y-InDel 和Amelogenin位點均得到有效擴增，擴增產(chǎn)物片段均在80～230 bp，InDel 位點信息見表2。男性樣本的Y-InDel 位點檢測到1 個等位基因，Amelogenin位點檢測結(jié)果為XY；女性樣本的Y-InDel位點檢測結(jié)果為陰性，Amelogenin位點檢測結(jié)果為X。

表2 北川羌族人群59 個A-InDel位點的基本信息Tab.2 Basic information of 59 A-InDels in Beichuan Qiang population

2.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗

經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢驗，57 個A-InDel 位點中，除rs5787309、rs10590825、rs1160980、rs33971783和rs561160795 外，其余52 個位點均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。采用Bonferroni法進行校正，57 個A-InDel 位點的P值均大于0.000 88（0.05/57），表明所有位點均符合Hardy-Weinberg 平衡。

2.3 連鎖不平衡檢驗

57個A-InDel位點兩兩之間共進行了1 596次連鎖不平衡檢驗，其中87 次比較結(jié)果的P值為0.000 947～0.049 932，且該87 對兩兩比較的位點均位于不同的染色體上。經(jīng)過Bonferroni法校正，各位點間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象［P值均大于0.000 031（0.05/1 596）］。

2.4 等位基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)

57個A-InDel位點的等位基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)見表3。Fdel值為0.272 5～0.760 0，F(xiàn)ins值為0.240 0～0.727 5；Ho值為0.370 0～0.585 0，He 值為0.365 7～0.501 2，PIC 值為0.298 3～0.375 0，DP 值為0.529 5～0.659 0，PEtrio值為0.234 9～0.281 2，PEduo值為0.066 5～0.125 0。由于57個A-InDel位點間處于連鎖平衡狀態(tài)，故可采用乘積定律計算其CDP 和CPE。57 個A-InDel位點在北川羌族人群中的CDP 值為1-2.974 8×10-24，CPEtrio值為0.999 999 999，CPEduo值為0.999 062 660。

2.5 北川羌族人群與其他人群基于57個A-InDel位點的群體遺傳學(xué)比較

應(yīng)用本研究獲得的北川羌族人群和數(shù)據(jù)庫所得26 個人群57 個A-InDel 位點的數(shù)據(jù)，計算得到Fst值（表3）、Fst遺傳距離（圖1）和Nei’s 遺傳距離（表4）。rs151335218、rs769299 和rs140683187 等22 個InDel位點的Fst值小于0.06，其余35 個InDel 位點的Fst值均大于0.06。Nei’s 遺傳距離和Fst遺傳距離均顯示北川羌族人群與北京漢族和南方漢族人群遺傳距離最近，與岡比亞西部人群遺傳距離最遠。

圖1 27 個人群的Fst遺傳距離Fig.1 Fst genetic distances of 27 populations

表3 北川羌族人群57 個A-InDel位點的等位基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)Tab.3 Allele frequencies and population genetic parameters of 57 A-InDels in Beichuan Qiang population（n=200）

續(xù)表3Continued Tab.3

根據(jù)Nei’s 遺傳距離和Fst遺傳距離，采用NJ 法構(gòu)建27 個人群間的系統(tǒng)發(fā)育樹?；贜ei’s 遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2A）顯示，整個系統(tǒng)發(fā)育樹主要分為4個分支，北川羌族人群與東亞人群位于同一分支?；贔st遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2B）群體分布格局與基于Nei’s 遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育樹相似。

圖2 27 個人群間的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of 27 populations

3 討論

羌族是我國少數(shù)民族之一，根據(jù)第六次全國人口普查結(jié)果，羌族的總?cè)丝跀?shù)為309 576 人[3]，主要居住在四川省阿壩藏族羌族自治州的茂縣、汶川、理縣和北川羌族自治縣[4]。羌族的民族語言是羌語，屬于漢藏語系中藏緬語族的羌族分支。目前已有學(xué)者[5-7]對羌族線粒體DNA、SNP 和STR 等遺傳標(biāo)記的多態(tài)性進行了研究，本研究對200 例羌族健康無關(guān)個體57 個A-InDel 位點的遺傳多態(tài)性進行調(diào)查分析，為InDel 遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Bonferroni 法校正后，57 個A-InDel 位點均符合Hardy-Weinberg 平衡，因此，本研究樣本資料可靠。連鎖不平衡檢驗結(jié)果顯示，57 個A-InDel 位點在北川羌族人群中不存在連鎖不平衡現(xiàn)象（P＞0.000 031），提示這些位點是相互獨立的遺傳標(biāo)記，可用于法醫(yī)學(xué)鑒定。北川羌族人群57 個AInDel位點中，除rs66595817、rs72085595外，其余55個位點的等位基因頻率均在0.3～0.7范圍內(nèi)，表明這57個A-InDel 位點在北川羌族人群中的等位基因分布較均衡。由表3 可見，F(xiàn)ins、DP、PIC、Ho、He、PEduo、PEtrio的最小值均在rs72085595 出現(xiàn)，該位點在已報道的藏族[8]、成都漢族[8]、摩梭人[8]、黑龍江漢族[9]、上海漢族[9]等人群中的Fins、H 及PIC 也較低，提示該位點在亞洲人群中的遺傳多態(tài)性可能較低。57 個A-InDel 位點在北川羌族人群中的CDP 值為1-2.974 8×10-24，高于0.999 999 999 999 99，可以應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個體識別；而CPEtrio值 為0.999 999 999，CPEduo值 為0.999 062 660（小于0.999 9），提示其可以應(yīng)用于三聯(lián)體親子鑒定，單獨應(yīng)用不能滿足二聯(lián)體親子鑒定要求，但可作為常規(guī)STR 檢測試劑盒的補充和驗證。

Fst反映了特定基因座在群體間分布的差異程度，F(xiàn)st值越小，說明差異程度越小[10]。有學(xué)者[11]認(rèn)為，F(xiàn)st值小于0.06 可保證所選擇的位點適用于不同群體，從而得到穩(wěn)定的個體識別能力。本研究中rs151335218、rs769299、rs140683187 等22 個A-InDel位點的Fst值小于0.06，提示該22 個A-InDel 位點在27 個人群間差異很小，可適用于不同群體。另外，rs34421865、rs3076465、rs34287950 等35 個A-InDel位點的Fst值大于0.06，說明這35 個位點在27 個人群間基因頻率差異較大，在群體遺傳學(xué)和種群識別方面有重要的應(yīng)用價值[10]。

遺傳距離是用于評估群體間遺傳差異或遺傳分化的重要參數(shù)。本研究中北川羌族人群與北京漢族和南方漢族人群遺傳距離最近，與非洲人群遺傳距離較遠，其中與岡比亞西部人群遺傳距離最遠，提示遺傳距離和實際地域的物理距離區(qū)分度基本相似。此外，基于Nei’s 遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2A）顯示有4 個主要分支（東亞分支、南亞分支、歐洲分支和非洲分支），提示群體所處地理位置與遺傳距離密切相關(guān)；美洲人群分散在東亞和非洲的分支，可能是因為二戰(zhàn)前亞洲及非洲人口遷移至美洲所致[12]。就研究人群而言，北川羌族人群屬于東亞分支，與南方漢族和日本人群首先聚類，該結(jié)果與王敬方等[6]對四川羌族SNP 多態(tài)性進行分析得到的結(jié)論類似。為了進一步驗證27 個人群之間的遺傳結(jié)構(gòu)，本研究使用基因型數(shù)據(jù)計算Fst遺傳距離并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2B）?；贔st遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹群體分布格局與基于Nei’s 遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹相似，但北川羌族與北京漢族人群的遺傳關(guān)系更為密切。由此可以看出，基于基因頻率的Nei’s 遺傳距離的分析結(jié)果與基于基因型的Fst遺傳距離的分析結(jié)果基本一致，提示這57 個A-InDel 位點在一定程度上可以用于生物地理祖先推斷。

本研究獲得了57 個A-InDel 位點在四川省北川羌族人群中的等位基因頻率及遺傳學(xué)參數(shù)，為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。