miR-888 和miR-891a 的雙重微滴式數(shù)字PCR 檢測(cè)在精液鑒定中的應(yīng)用

魏孫祥，陳惠香，胡勝，趙一霞，石慧霞，王哲，李文，季安全，孫啟凡

1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.公安部鑒定中心 現(xiàn)場物證溯源技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038

確定案發(fā)現(xiàn)場遺留的體液斑跡組織屬性對(duì)于推斷案件性質(zhì)、重建犯罪現(xiàn)場等具有重要意義[1-2]，其中精液（斑）是法醫(yī)物證鑒定中常見的生物物證，尤其對(duì)于強(qiáng)奸、猥褻案件至關(guān)重要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長度為18～24 個(gè)堿基的非編碼RNA，具有高穩(wěn)定性、強(qiáng)保守性、良好的組織特異性、可兼容DNA 同步分析等優(yōu)勢(shì)，是法醫(yī)學(xué)體液鑒定的重要工具[3-8]。微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）是一種高靈敏度、高精確性的定量方法，對(duì)于低濃度核酸分子檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性好，可用于miRNA 的絕對(duì)定量檢測(cè)[9-10]。研究[5-6]結(jié)果表明，miR-888 和miR-891a 具有良好的精液特異性，可通過對(duì)其表達(dá)量的檢測(cè)進(jìn)行精液鑒定，但目前使用的檢測(cè)方法均為實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR）相對(duì)定量法，使用不同的內(nèi)參基因可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果作出不同的解釋[11]，受抑制劑、檢測(cè)平臺(tái)和擴(kuò)增效率影響較大，對(duì)結(jié)果的解釋不夠直接和客觀[12]。

本研究旨在建立可同時(shí)檢測(cè)miR-888和miR-891a的雙重ddPCR 檢測(cè)體系，通過絕對(duì)定量對(duì)miR-888 和miR-891a 作為精液特異性標(biāo)記的可靠性進(jìn)行評(píng)估，以期為精液鑒定提供更科學(xué)、準(zhǔn)確的方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑

QX200 AutoDG 微滴式數(shù)字PCR 系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），包括自動(dòng)化微滴生成器、PX1 PCR 反應(yīng)板熱封儀、帶96-深孔反應(yīng)模塊的C1000 Touch 熱循環(huán)儀和QX200TM微滴讀取器；NanoDrop 2000c 分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

miRNeasy Mini試劑盒（德國Qiagen公司），TaqManTMMicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），ddPCR超混合液（無dUTP，美國Bio-Rad公司）。

1.1.2 引物、探針設(shè)計(jì)與標(biāo)準(zhǔn)品RNA 合成

miR-888、miR-891a 的成熟序列[5]及引物和探針信息見表1，探針的報(bào)告基團(tuán)分別采用6-FAM 和HEX熒光修飾。自行設(shè)計(jì)引物、探針后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-888、miR-891a 標(biāo)準(zhǔn)品RNA 由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 miR-888、miR-891a 的成熟序列及引物和探針信息Tab.1 Information of mature sequences，primers and probes of miR-888 and miR-891a

1.1.3 樣本制備

對(duì)75 名來自中國北方地區(qū)年齡在25～35 歲的健康志愿者進(jìn)行樣本采集，收集5 種法醫(yī)學(xué)相關(guān)體液樣本共75 份，其中精液35 份，外周血、月經(jīng)血、唾液、陰道分泌液各10 份。

外周血通過靜脈穿刺收集后置于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝采血管內(nèi)。

唾液使用無菌塑料管收集（樣本收集前志愿者禁食1 h）。

精液使用無菌廣口塑料杯收集（樣本收集前，志愿者禁欲2 d）。

月經(jīng)血（于月經(jīng)周期的第2 天或第3 天采集）和陰道分泌液使用衛(wèi)生棉條獲取。

所有樣本采集制備后均儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

本研究已通過公安部鑒定中心倫理委員會(huì)的審查（審批文號(hào)：2020-024），所有志愿者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取和定量

按照miRNeasy Mini 試劑盒操作說明書進(jìn)行總RNA 的提取[13]，使用NanoDrop 2000c 分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 的質(zhì)量濃度和純度（D260/D280）[8]。

1.2.2 互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）合成

采用莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法[8]，按照TaqManTMMicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。每15 μL 反應(yīng)體系包括總RNA 10 ng，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）預(yù)混液（100 mmol/L）0.15 μL，MultiScribeTM逆轉(zhuǎn)錄酶（50 U/μL）1.00 μL，10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液1.50 μL，RNA 酶抑制劑（20 U/μL）0.19 μL，miR-888逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物（1 μmol/L）0.15 μL，miR-891a 逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物（1 μmol/L）0.15 μL，加無核酸酶水（日本TaKaRa 公司）至15 μL。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄陰性對(duì)照（用無核酸酶水取代逆轉(zhuǎn)錄酶）。反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保持。

1.2.3 雙重ddPCR 檢測(cè)體系的建立和優(yōu)化

按照微滴生成、PCR 擴(kuò)增和微滴讀取3個(gè)步驟進(jìn)行體系的建立。首先針對(duì)miR-888 和miR-891a 建立單獨(dú)的ddPCR 檢測(cè)體系，在此基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化退火溫度和熱循環(huán)數(shù)，建立雙重ddPCR 檢測(cè)體系。

（1）微滴生成。雙重ddPCR 檢測(cè)miR-888和miR-891a，每22 μL 反應(yīng)體系包括探針用ddPCR 超混合液（無dUTP）11 μL，cDNA 1.1 μL，通用反向引物（20 μmol/L）0.99 μL，miR-888、miR-891a 特異性正向引物（20 μmol/L）各0.99 μL，miR-888、miR-891a 熒光探針（20 μmol/L）各0.275 μL，無核酸酶水6.38 μL。設(shè)置陰性對(duì)照（使用無核酸酶水代替cDNA 作為模板）。將樣品轉(zhuǎn)移至96 孔板中，于自動(dòng)化微滴生成器中生成微滴，放置另一96 孔板以接收生成的微滴。

（2）PCR 擴(kuò)增。將接收微滴的96 孔板蓋膜，封膜，PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，56～62 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min，4 ℃保持。升降溫速度為2 ℃/s。miR-888、miR-891a的單獨(dú)檢測(cè)及雙重檢測(cè)均使用此反應(yīng)條件。

（3）微滴讀取。擴(kuò)增完畢后，在QX200TM微滴讀取器上讀取微滴數(shù)據(jù)，采用QuantaSoft v1.7.4軟件（美國Bio-Rad公司）獲取目標(biāo)片段的拷貝濃度。包含10 000個(gè)以上微滴的反應(yīng)被視為有效反應(yīng)，并用于數(shù)據(jù)分析[14-15]。

（4）雙重ddPCR 檢測(cè)條件優(yōu)化。優(yōu)化ddPCR 反應(yīng)條件，包括退火溫度和熱循環(huán)數(shù)。使用帶96-深孔反應(yīng)模塊的C1000 Touch 熱循環(huán)儀溫度梯度功能進(jìn)行PCR 擴(kuò)增退火溫度的優(yōu)化，設(shè)置退火溫度梯度為：62 ℃、61.6 ℃、60.9 ℃、59.8 ℃、58.4 ℃、57.3 ℃、56.5 ℃、56 ℃。設(shè)置熱循環(huán)數(shù)為35、40、42、43、45、46 個(gè)。

1.2.4 雙重檢測(cè)與單獨(dú)檢測(cè)的結(jié)果比較

為驗(yàn)證雙重ddPCR 檢測(cè)體系的準(zhǔn)確性，使用雙重體系與單一體系同時(shí)對(duì)隨機(jī)挑選的4 份精液樣本進(jìn)行miR-888 和miR-891a 的檢測(cè)和拷貝濃度比較。雙重ddPCR 檢測(cè)體系為在同一反應(yīng)孔內(nèi)加入miR-888 和miR-891a 的正反向引物和探針，其中miR-888和miR-891a 的引物濃度配比為1∶1，利用5′端不同熒光修飾的探針可同時(shí)檢測(cè)這兩種miRNA。單獨(dú)miRNA 檢測(cè)體系為在同一反應(yīng)孔內(nèi)僅加入其中一個(gè)miRNA 的引物和探針，用無核酸酶水代替另一個(gè)miRNA 的引物和探針，即miR-888 和miR-891a 在不同反應(yīng)孔內(nèi)單獨(dú)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 靈敏度檢測(cè)

對(duì)隨機(jī)挑選的6 份樣本（精液2 份、外周血1 份、月經(jīng)血1份、唾液1份、陰道分泌液1份）提取的總RNA從10 ng 開始進(jìn)行10 倍梯度稀釋，共4 個(gè)梯度，即總RNA 量分別為10 ng、1 ng、0.1 ng、10 pg，利用1.2.3 節(jié)建立和優(yōu)化后的雙重ddPCR 檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 重復(fù)性檢測(cè)

對(duì)miR-888、miR-891a標(biāo)準(zhǔn)品RNA 各5 ng進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)分別為2 500、12 500、62 500、312 500 倍。以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品核酸為模板，使用1.2.3 節(jié)建立和優(yōu)化后的雙重ddPCR 檢測(cè)miR-888 和miR-891a，每個(gè)濃度設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算其變異系數(shù)，以評(píng)價(jià)檢測(cè)方法在不同濃度下的批內(nèi)重復(fù)性。在同樣的反應(yīng)條件下進(jìn)行2 次試驗(yàn)（每次試驗(yàn)每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)求平均值作為結(jié)果），計(jì)算其變異系數(shù)，評(píng)價(jià)該方法的批間重復(fù)性。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)對(duì)ddPCR 雙重檢測(cè)與單獨(dú)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行差異性分析，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)對(duì)精液與其他常見體液中目標(biāo)片段的拷貝濃度進(jìn)行差異性分析，通過受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析，根據(jù)曲線下面積（area under the curve，AUC）評(píng)估m(xù)iR-888 和miR-891a區(qū)分精液的能力，并計(jì)算約登指數(shù)（Youden index）確定最佳的鑒別截?cái)嘀?。使用GraphPad Prism 9.0 軟件（美國GraphPad Software 公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 總RNA 的質(zhì)量濃度和純度

本研究5 種體液共75 份樣本提取后的總RNA 質(zhì)量濃度和純度見表2。不同類型體液之間的總RNA質(zhì)量濃度和純度具有一定差別。外周血樣本具有最高的質(zhì)量濃度，而唾液樣本的質(zhì)量濃度始終較低。所提總RNA 的平均純度在（1.75±0.10）～（1.99±0.06）。

表2 5 種體液的總RNA 質(zhì)量濃度和純度Tab.2 Mass concentration and purity of total RNA extracted from 5 body fluids（±s）

表2 5 種體液的總RNA 質(zhì)量濃度和純度Tab.2 Mass concentration and purity of total RNA extracted from 5 body fluids（±s）

2.2 雙重ddPCR 檢測(cè)體系的建立和優(yōu)化

如1.2.3節(jié)所述，經(jīng)退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)（56～62 ℃），根據(jù)兩個(gè)檢測(cè)通道陽性微滴和陰性微滴的分離狀態(tài)，將退火溫度設(shè)為56.5 ℃；分別嘗試將熱循環(huán)數(shù)設(shè)為35、40、42、43、45、46 個(gè)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)擴(kuò)增效率較低時(shí)，適當(dāng)增加熱循環(huán)數(shù)能夠提高陽性微滴信號(hào)，并使其更加集中分布，有利于陽性和陰性信號(hào)的區(qū)分，最終將最優(yōu)熱循環(huán)數(shù)設(shè)置為45 個(gè)。

經(jīng)優(yōu)化后，雙重ddPCR檢測(cè)miR-888和miR-891a的擴(kuò)增圖見圖1。

圖1 雙重ddPCR 檢測(cè)miR-888 和miR-891a 的擴(kuò)增圖Fig.1 Amplification plots of miR-888 and miR-891a detected by duplex ddPCR

2.3 雙重檢測(cè)與單獨(dú)檢測(cè)的結(jié)果比較

4 份精液樣本經(jīng)ddPCR 雙重檢測(cè)與單獨(dú)檢測(cè)的結(jié)果見表3，經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，兩種方法得出的目標(biāo)片段拷貝濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 精液樣本經(jīng)ddPCR 雙重檢測(cè)和單獨(dú)檢測(cè)的目標(biāo)片段拷貝濃度Tab.3 The target fragment copy concentrations of semen samples detected by duplex ddPCR and single ddPCR（copies/μL）

2.4 靈敏度檢測(cè)

雙重ddPCR 檢測(cè)體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果見圖2。當(dāng)稀釋100 倍后（0.1 ng 總RNA），該體系仍然能準(zhǔn)確地從5種體液中鑒別出精液。當(dāng)總RNA 量為10 pg時(shí)，該體系在月經(jīng)血中檢測(cè)出1 個(gè)miR-888 陽性微滴、在陰道分泌液中檢測(cè)出1 個(gè)miR-891a 陽性微滴從而出現(xiàn)假陽性。因此，使用該體系時(shí)，初始總RNA 的質(zhì)量至少需要0.1 ng。

圖2 雙重ddPCR 檢測(cè)體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Sensitivity test results of duplex ddPCR detection system

2.5 重復(fù)性檢測(cè)

以4 種稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品核酸為模板，使用雙重ddPCR 檢測(cè)miR-888 和miR-891a，計(jì)算得到miR-888的批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.86%、2.12%、5.60%和10.72%，miR-891a的批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.56%、0.71%、1.17%和2.03%（表4）；miR-888的批間變異系數(shù)分別為2.27%、1.03%、2.39%和3.91%，miR-891a 的批間變異系數(shù)分別為1.78%、0.78%、6.90%和6.98%。4 種稀釋倍數(shù)下的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%。

表4 4 種稀釋倍數(shù)下標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝濃度Tab.4 Copy concentrations of standard substances at 4 dilutions（n=3，±s，copies·μL-1）

表4 4 種稀釋倍數(shù)下標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝濃度Tab.4 Copy concentrations of standard substances at 4 dilutions（n=3，±s，copies·μL-1）

2.6 精液與其他常見體液表達(dá)的差異性分析

本研究對(duì)5種體液共75份樣本進(jìn)行了雙重ddPCR檢測(cè)，結(jié)果見表5。將精液分別與外周血、月經(jīng)血、唾液、陰道分泌液中miR-888 和miR-891a 的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，miR-888 和miR-891a 在精液中的表達(dá)量高于其他體液（P＜0.05）。

表5 5 種體液中miR-888 和miR-891a 的拷貝濃度Tab.5 Copy concentrations of miR-888 and miR-891a in 5 body fluids（±s，copies·μL-1）

表5 5 種體液中miR-888 和miR-891a 的拷貝濃度Tab.5 Copy concentrations of miR-888 and miR-891a in 5 body fluids（±s，copies·μL-1）

注：1）與精液樣本比較，P＜0.05。

2.7 ROC 曲線分析

對(duì)精液與非精液樣本中miR-888 和miR-891a 的拷貝濃度進(jìn)行ROC 曲線分析，結(jié)果見圖3。miR-888的AUC 為0.976，最佳截?cái)嘀禐?.250 copies/μL，此時(shí)靈敏度為94.29%，特異性為100%，約登指數(shù)為0.943，75 份樣本中有2 份精液樣本被誤判為非精液，判別正確率為97.33%；miR-891a 的AUC 為1.000，最佳截?cái)嘀禐?.100 copies/μL，此時(shí)靈敏度和特異性均為100%，約登指數(shù)為1，75 份樣本均被正確判別。

圖3 ROC 曲線分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of ROC curve

3 討論

一直以來，RT-qPCR 被認(rèn)為是檢測(cè)miRNA 表達(dá)量的金標(biāo)準(zhǔn)[16-17]，也是目前基于miRNA 進(jìn)行體液鑒定的主要檢測(cè)方法，但該方法一方面需要科學(xué)準(zhǔn)確地選擇內(nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量分析[11]，或通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以進(jìn)行絕對(duì)定量；同時(shí)，qPCR 針對(duì)不同的目標(biāo)基因需要設(shè)計(jì)單獨(dú)的檢測(cè)體系，復(fù)合檢測(cè)難度較大，無形中限制了其在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用。ddPCR 是近些年逐漸發(fā)展成熟的一種可對(duì)微量核酸進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)的方法，其原理是將待測(cè)樣品分成數(shù)萬個(gè)微滴，每個(gè)微滴不含或含有至少1 個(gè)待檢核酸靶分子，經(jīng)過獨(dú)立PCR 反應(yīng)后，對(duì)微滴進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)，最終根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴比例給出待檢靶分子的拷貝濃度[9-10]。

本研究將ddPCR 技術(shù)引入法醫(yī)學(xué)體液鑒定領(lǐng)域，克服了miRNA 序列較短，引物和探針的設(shè)計(jì)較為復(fù)雜等技術(shù)難點(diǎn)，自行設(shè)計(jì)TaqMan 探針，分別選擇6-FAM 和HEX 熒光修飾的報(bào)告基團(tuán)用于兩條miRNA探針，建立雙重ddPCR 檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)了miRNA 的ddPCR 雙通道檢測(cè)，可同時(shí)對(duì)miR-888 和miR-891a兩種miRNA 進(jìn)行絕對(duì)定量分析，經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，ddPCR 雙重檢測(cè)與單獨(dú)檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明雙重ddPCR 檢測(cè)結(jié)果可信，能夠達(dá)到與單獨(dú)ddPCR 檢測(cè)同樣的準(zhǔn)確性。經(jīng)重復(fù)性試驗(yàn)，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%，說明該體系穩(wěn)定性和重復(fù)性良好[18]，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。探針根據(jù)以下原則進(jìn)行設(shè)計(jì)：跨越莖環(huán)序列和miRNA 成熟序列連接處且不與正向引物重疊，盡可能增加長度以提高解鏈溫度（melting temperature，Tm）值，同時(shí)設(shè)計(jì)5′報(bào)告基團(tuán)、3′淬滅基團(tuán)以及3′小溝結(jié)合物（minor groove binder，MGB）[19]。與傳統(tǒng)的TaqMan 探針相比，MGB 探針能夠在顯著提高Tm的同時(shí)增加特異性，尤其是當(dāng)錯(cuò)配發(fā)生在MGB區(qū)域時(shí)，單個(gè)堿基不匹配就能顯著降低DNA雙鏈的Tm值[20]。這些性質(zhì)決定了MGB 探針尤其適用于長度較短的核酸（如miRNA）和單堿基突變等研究。

miR-888 最初被定義為附睪特異性表達(dá)的miRNA[21]，是一種前列腺分泌液來源的miRNA，具有促進(jìn)前列腺細(xì)胞增殖、遷移和集落形成的功能[22]，miR-891a 的功能和作用研究相對(duì)較少，但miR-891a與miR-888 同樣位于人類X 染色體上同一miRNA 集群中，分布穩(wěn)定且集中，具有較強(qiáng)的精液特異性[5-6，23-24]。本研究結(jié)果支持以上結(jié)論。通過檢測(cè)5種體液共75份樣本中miR-888 和miR-891a 的拷貝濃度，經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)證實(shí)了miR-888 和miR-891a 在精液中的表達(dá)量均高于其他常見體液。經(jīng)ROC分析，miR-888和miR-891a 均具有很高的鑒別精液的能力，且兩者相比，miR-891a 的判別正確率高于miR-888。在本研究使用的75 份樣本中，僅通過miR-891a 的表達(dá)情況即可區(qū)分精液與其他體液，且當(dāng)截?cái)嘀刀?.100 copies/μL時(shí)，判別正確率可達(dá)100%。將miR-888 和miR-891a結(jié)合使用，能夠進(jìn)一步增加結(jié)果的可信度，避免檢測(cè)單個(gè)標(biāo)記造成的假陽性或假陰性。此外，大多數(shù)法醫(yī)學(xué)生物檢材為微量降解樣本，因此，靈敏度是評(píng)估檢測(cè)體系法醫(yī)學(xué)實(shí)際應(yīng)用能力的重要指標(biāo)。經(jīng)靈敏度檢測(cè)，該體系在僅使用0.1 ng 總RNA 時(shí)仍然能準(zhǔn)確區(qū)分出精液，具有較好的應(yīng)用前景。有研究[25]表明，ddPCR 在檢測(cè)空白樣品時(shí)可能會(huì)由于檢出1 個(gè)陽性微滴而被判定為陽性，未觀察到2 個(gè)或更多陽性微滴的存在，本研究支持上述結(jié)論。在總RNA 量為10 pg時(shí)，該體系在月經(jīng)血中檢測(cè)出1個(gè)miR-888陽性微滴、在陰道分泌液中檢測(cè)出1 個(gè)miR-891a 陽性微滴從而出現(xiàn)假陽性，無法準(zhǔn)確鑒別精液。因此，對(duì)于只檢出1 個(gè)陽性微滴的樣品，應(yīng)重復(fù)多次檢測(cè)以進(jìn)一步驗(yàn)證和分析[15]。

綜上所述，本研究建立了雙重ddPCR 檢測(cè)miR-888 和miR-891a 的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)精液的準(zhǔn)確鑒別。鑒于法醫(yī)實(shí)際檢材微量性的特點(diǎn)，雙重ddPCR 檢測(cè)可以大大節(jié)省樣品，簡化實(shí)驗(yàn)流程，縮減檢測(cè)成本。因此，本研究建立的雙重ddPCR 檢測(cè)體系有望在法醫(yī)實(shí)際案件中進(jìn)行推廣和應(yīng)用。