唾液菌群的直接PCR 擴(kuò)增-高分辨率熔解曲線分析及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

楊瑞，陳炯，趙貴森

河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471023

細(xì)菌是人體的重要組成部分，在人體各部位形成復(fù)雜多樣的微生態(tài)系統(tǒng)[1-2]。由于性別、年齡、生活環(huán)境、飲食習(xí)慣、健康狀況等的不同，人體菌群具有個(gè)體特異性，同一個(gè)體不同部位的菌群也不相同[3]。人體菌群很容易轉(zhuǎn)移到現(xiàn)場(chǎng)物品上，或隨分泌物、排泄物遺留在現(xiàn)場(chǎng)，甚至比人體細(xì)胞的數(shù)量還多，且能在一定時(shí)間內(nèi)保持菌群原有的特性[4]。人死后，尸體各處的菌群隨腐敗進(jìn)展而發(fā)生有規(guī)律的變化[5-6]?，F(xiàn)場(chǎng)檢材或尸體的菌群特征可提供斑痕類型、來源個(gè)體及死亡時(shí)間等信息[7-8]，菌群分析作為解決法醫(yī)學(xué)問題的新途徑日益受到關(guān)注。

菌群可用形態(tài)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)等方法進(jìn)行分析，但受檢材條件等限制，目前法醫(yī)學(xué)菌群分析主要指菌群的DNA 分析，常用的標(biāo)記基因是以序列變異為主的16S rDNA，分析過程一般包括檢材處理、DNA提取、擴(kuò)增、PCR 產(chǎn)物檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析等多個(gè)環(huán)節(jié)[4-10]。在DNA 提取環(huán)節(jié)，又有裂解、純化等步驟，耗時(shí)長(zhǎng)，檢材用量大。PCR 產(chǎn)物則須用雜交、測(cè)序或梯度凝膠電泳等特殊的技術(shù)進(jìn)行分離、檢測(cè)，操作繁瑣，成本高，污染風(fēng)險(xiǎn)大。此外，菌群PCR 是一種以群體特征為研究對(duì)象的多模板PCR[11]，不同于法醫(yī)學(xué)常用的多重PCR，不能按照傳統(tǒng)的PCR 來優(yōu)化和評(píng)價(jià)?，F(xiàn)有的菌群分析技術(shù)均來自其他領(lǐng)域，不符合法醫(yī)學(xué)工作特點(diǎn)，也未經(jīng)改造和驗(yàn)證，難以滿足法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的要求。

熔解曲線分析法利用解鏈溫度差異來鑒別DNA，在熒光定量PCR 儀上擴(kuò)增的DNA 可直接進(jìn)行熔解曲線分析[12]。使用EvaGreen 等飽和熒光染料和高精度的PCR 儀，可以提高熔解曲線的分辨率，即高分辨率熔解（high resolution melting，HRM）。HRM 過程簡(jiǎn)單、快速，靈敏度和信息含量高，已應(yīng)用于變異或突變篩查、病原體快速檢測(cè)、法醫(yī)DNA 分型等[13-16]。關(guān)于HRM 在菌群分析中的應(yīng)用，EVERMAN 等[17]已有初步探索，WANG 等[18]也已將其用于人類唾液菌群的比較，但都要先提取菌群的宏基因組DNA。直接PCR（direct PCR，dPCR）擴(kuò)增已是成熟的法醫(yī)DNA 分型技術(shù)，在菌落篩選、病原體診斷中也有應(yīng)用[19]，可以簡(jiǎn)化操作、縮短時(shí)間，是菌群DNA 分析快速化的另一潛在途徑。16S rDNA 是菌群分析中最常用的標(biāo)記基因，其V4 高變區(qū)在進(jìn)化關(guān)系上更接近16S rDNA 全長(zhǎng)，通用性和分辨率均較高，且在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有報(bào)道[18，20]。

本研究擬結(jié)合dPCR 和HRM 技術(shù)，以16S rDNA V4 區(qū)為例，建立一種免提取、免電泳的唾液菌群快速檢測(cè)技術(shù)，即dPCR-HRM 技術(shù)，并評(píng)估其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

熱啟動(dòng)Taq酶、dNTPs、Ex TaqBuffer（Mg2+free）和MgCl2均購(gòu)自日本TaKaRa 公司，20×EvaGreen 熒光染料購(gòu)自美國(guó)Biotium 公司，多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）A01 菌株的基因組DNA 由河南科技大學(xué)基因工程疫苗課題組贈(zèng)送，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，Tris-EDTA（TE）緩沖液（pH=8.0）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)的通用引物[18]由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成，序列為：518F（5′-CC AGCAGCCGCGGTAAT-3′）和806R（5′-GGACTACCA GGGTATCTAATCCTGTT-3′）。

Rotor-Gene Q 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（德國(guó)Qiagen公司），F(xiàn)LA6000 微量紫外可見分光光度計(jì)（杭州晶飛科技有限公司），TGL-16B 高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 樣本采集

按照知情同意原則，采集本校79 名志愿者的非刺激性唾液[21]共84 份。采集前至少禁食禁水1 h，采集時(shí)志愿者身體前傾，收集自然流出的唾液約1 mL于1.5 mL 微量離心管中并編號(hào)，于采樣后30 min 內(nèi)進(jìn)行后續(xù)處理或置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｆ渲校?～5 號(hào)志愿者為本課題組成員（年齡20～60 歲；男性3 名，女性2 名；吸煙者2 名，不吸煙者3 名），在初次采樣3 個(gè)月后重復(fù)采樣1 次，初次采樣樣本編號(hào)為1～5 號(hào)，第二次采樣樣本編號(hào)為T1～T5。1 號(hào)、2 號(hào)志愿者在第二次采集唾液的同時(shí)無菌采集外周靜脈血，常規(guī)Chelex 法提取基因組DNA。其他樣本來自本校學(xué)生，編號(hào)6～79號(hào)。

本研究已獲得河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批文號(hào)：20180306）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本預(yù)處理

唾液：新鮮或快速解凍平衡至室溫的唾液，渦旋振蕩30 s，常溫下以離心半徑4 cm，3 000 r/min，離心30 s，將上清液移至另一1.5 mL 微量離心管中，以離心半徑4 cm，12 000 r/min，離心10 min，棄去上清液，加入等體積TE 緩沖液重懸。

唾液斑：10 號(hào)、11 號(hào)唾液樣本在采集后立即制成兩組唾液斑，每組20 份，每份均取10 μL 滴加到載玻片上，室溫放置形成唾液斑，分別沉積0、0.5、2、4、8 h后用TE 緩沖液潤(rùn)濕的紗線擦拭轉(zhuǎn)移至加有50 μL TE 緩沖液的微量離心管中，室溫浸泡30 min，渦旋振蕩30 s，以離心半徑4 cm，3 000 r/min，離心30 s，取上清液作為PCR 模板。

混檢樣本：分別取編號(hào)為T1～T5 的唾液樣本各50 μL 等體積混合，制成可以代表一般個(gè)體唾液細(xì)菌含量和菌群結(jié)構(gòu)的混檢樣本[22]，采取與唾液樣本相同方法處理后，分為2 份：1 份從3.5 倍至3.5×105倍行10 倍梯度稀釋；另1 份用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取，紫外分光光度法定量后，從250 ng/μL 至2.5×10-3ng/μL 行10 倍梯度稀釋。

1.3.2 菌群宏基因組DNA 提取

取T1～T5 號(hào)唾液樣本按1.3.1 節(jié)方法制成TE 懸液各50 μL，分別用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，具體操作參照試劑盒說明書。用微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR-HRM 檢測(cè)

PCR 體系為20 μL，包括：10 μmol/L 的正、反向引物各0.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10×PCR 緩沖液2 μL，25 mmol/L MgCl22.4 μL，20×EvaGreen 1 μL，5 U/μL 熱啟動(dòng)Taq酶0.2 μL，以1.3.1 節(jié)制備的細(xì)菌懸液或1.3.2節(jié)提取的菌群DNA為模板，補(bǔ)純水至20 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min 預(yù)變性；94 ℃ 10 s，65 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)，采用降落PCR，前25 個(gè)循環(huán)每次退火溫度降低0.5 ℃。HRM 條件：95 ℃變性1 min，降溫至40 ℃保溫1 min，再以最高速度升溫至75 ℃后開始以每步0.2 ℃逐步升溫、采集熒光信號(hào)，直至95 ℃。上述過程即為PCR-HRM。其中，直接以1.3.1 節(jié)制備的細(xì)菌懸液為模板時(shí)，稱為dPCR-HRM；以1.3.2 節(jié)試劑盒（kit）提取的細(xì)菌基因組DNA 為模板時(shí)，稱為kPCR-HRM。

每批次檢測(cè)均以多殺性巴氏桿菌的基因組DNA和純水分別作為陽性和陰性對(duì)照模板，模擬斑痕實(shí)驗(yàn)時(shí)以擦拭載玻片空白區(qū)的紗線同步制作空白基底對(duì)照。以Chelex 法提取的人外周靜脈血基因組DNA 為無菌模板，驗(yàn)證引物和PCR 擴(kuò)增的特異性。每個(gè)反應(yīng)至少設(shè)置兩個(gè)復(fù)管。

1.4 方法評(píng)估

以已知序列的陽性對(duì)照模板（多殺性巴氏桿菌基因組DNA）優(yōu)化反應(yīng)體系、循環(huán)參數(shù)，建立細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)的PCR-HRM 法，所得圖譜與uMelt[23]（https://dna-utah.org/index.html）預(yù)測(cè)圖譜比較，并用10 倍梯度稀釋（250 ng/μL 至2.5×10-3ng/μL）的多殺性巴氏桿菌DNA 測(cè)試靈敏度。

分別以混檢樣本的菌群DNA、菌群懸液及其梯度稀釋液為模板，優(yōu)化建立的kPCR-HRM、dPCR-HRM技術(shù)，并測(cè)試靈敏度。以建立的kPCR-HRM、dPCRHRM 法分別檢測(cè)T1～T5 號(hào)樣本及混檢樣本，比較兩種方法所得圖譜并驗(yàn)證其可行性和鑒別能力。

使用dPCR-HRM 法，間隔1 d、1 周重復(fù)檢測(cè)T1～T5 號(hào)唾液樣本，評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性；調(diào)查兩組模擬唾液斑樣本，分析dPCR-HRM 法用于斑痕檢材的效果，初步評(píng)價(jià)其法醫(yī)學(xué)實(shí)用性；調(diào)查混檢樣本菌群懸液的梯度稀釋液，分析樣本稀釋對(duì)dPCR-HRM 圖譜的影響，探索一般個(gè)體獲得菌群代表性HRM 圖譜的稀釋度范圍；調(diào)查61 份唾液樣本（編號(hào)19～79），根據(jù)相似度對(duì)樣本圖譜進(jìn)行聚類，計(jì)數(shù)各類樣本的例數(shù)，評(píng)價(jià)唾液菌群dPCR-HRM 圖譜的群體多樣性，再隨機(jī)從上述61 份樣本中抽取6 份進(jìn)行盲測(cè)，與原聚類結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證dPCR-HRM 用于未知樣本分型的可行性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

參考NUNZIATA 等[24-25]的方法，以判型置信度（genotype confidence percentage，GCP）為衡量HRM 圖譜之間相似性的客觀指標(biāo)。待測(cè)樣本相對(duì)于參考樣本 的，其中drt為待測(cè)曲線與參考曲線之間的歐氏距離。應(yīng)用Rotor-Gene Q 2.3.1 軟件（德國(guó)Qiagen 公司），結(jié)合人工核查，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和判型。

Rotor-Gene Q 2.3.1 軟件采集擴(kuò)增和熔解過程中的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線和HRM 曲線。根據(jù)擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）排除擴(kuò)增失敗的反應(yīng)管；然后用“Melt”模式分析，核查熔解曲線的峰型，確定熔解的溫度范圍（82.5～91 ℃）；再用“HRM”模式分析，以熔解前1 ℃（81.5～82.5 ℃）和后1 ℃（91～92 ℃）兩個(gè)區(qū)間的熒光值為準(zhǔn)，對(duì)原始HRM曲線進(jìn)行歸一化，生成歸一化的HRM曲線。在“HRM”模式下，定義“菌群型”及其參考樣本，調(diào)整GCP 界值，查看待測(cè)樣本的判型與GCP 值。以GCP=80%為界值[26]，判斷兩個(gè)HRM 圖譜是否能歸為同一種菌群型。復(fù)管取均值后，導(dǎo)出GCP 等數(shù)據(jù)及熔解曲線和HRM圖譜。涉及不同批次間的比較，如群體樣本調(diào)查時(shí)，先把上述分批檢測(cè)、導(dǎo)出的數(shù)據(jù)用Origin 8 軟件（美國(guó)OriginLab 公司）進(jìn)行整合，各批次均包含22 號(hào)樣本，以控制和修正批次間差異[25]，然后導(dǎo)入LabSpec 5軟件（日本HORIBA Scientific 公司）統(tǒng)一進(jìn)行平滑、扣基線和校準(zhǔn)，生成與系列圖譜相應(yīng)的數(shù)據(jù)矩陣，再用LabSpec 5 軟件的“Model”模式進(jìn)行建模分析，結(jié)合數(shù)據(jù)和人工讀圖判定新檢出的“菌群型”，統(tǒng)計(jì)各種型的數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)的PCR-HRM

經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)體系、循環(huán)參數(shù)，以多殺性巴氏桿菌基因組DNA 為模板，可以得到典型的熔解曲線（圖1A）、HRM 圖譜（圖1B），與根據(jù)多殺性巴氏桿菌16S rDNA V4 區(qū)序列預(yù)測(cè)的圖譜（圖1C～D）基本一致。陰性對(duì)照、無菌的人DNA 對(duì)照，在超凈臺(tái)內(nèi)操作時(shí)無擴(kuò)增和熔解信號(hào)，但常規(guī)條件下循環(huán)次數(shù)大于35 次時(shí)會(huì)有非特異性信號(hào)。

圖1 多殺性巴氏桿菌16S rDNA V4 區(qū)的PCR-HRM 圖譜Fig.1 PCR-HRM profiles of 16S rDNA V4 region of Pasteurella multocida

2.2 菌群的kPCR-HRM

與單一菌株相比，菌群的熔解曲線（圖2A）主峰常較寬，有肩峰或多個(gè)峰，相應(yīng)的HRM 曲線（圖2B）也可分為多段，各段斜率（即熒光下降速率）不同。

以2.5×10-3ng/μL的混檢樣本DNA為模板也可得到HRM 圖譜，但與該樣本模板DNA 量在0.25～25 ng/μL的圖譜（圖2C）明顯不同。以2.5 ng/μL菌群DNA的HRM圖譜為參考標(biāo)準(zhǔn)，模板DNA量在0.25～25 ng/μL所得圖譜的GCP＞96.2%（98.19%±1.75%），而＜0.25 ng/μL 或＞25 ng/μL所得圖譜的GCP＜41.98%（32.14%±11.65%）。

圖2 唾液菌群的kPCR-HRM 圖譜Fig.2 kPCR-HRM profiles of salivary bacterial community

2.3 菌群的dPCR-HRM

直接以1.3.1節(jié)制備的細(xì)菌懸液為模板，用dPCRHRM 法進(jìn)行分析，可以在90 min 內(nèi)得到樣本菌群的HRM 圖譜。同一唾液樣本，其dPCR-HRM 圖譜與kPCR-HRM 圖譜相似（圖3），兩種方法所得HRM 圖譜之間的GCP＞95.85%（96.95%±1.56%）。

圖3 同一樣本的dPCR-HRM 和kPCR-HRM 圖譜Fig.3 dPCR-HRM and kPCR-HRM profiles of the same sample

稀釋35～3.5×103倍的混檢樣本，模板的唾液量為0.29～29 nL，Ct 值在15～30，dPCR-HRM 圖譜基本相似（圖4），以350 倍稀釋時(shí)的圖譜為參考標(biāo)準(zhǔn)，GCP＞92.11%（96.97%±2.79%）。稀釋3.5×105倍，相當(dāng)于約2.9×10-3nL 的唾液仍可檢測(cè)，但模板的唾液量大于29 nL 或小于0.29 nL、Ct 值不在15～30 范圍內(nèi)時(shí)，HRM圖譜可見明顯變異（圖4），如仍以350 倍稀釋時(shí)的圖譜為參考標(biāo)準(zhǔn)，GCP＜81.96%（66.43%±17.23%）。

圖4 梯度稀釋混檢樣本的dPCR-HRM 圖譜Fig.4 dPCR-HRM profiles of the mixed sample with gradient dilution

2.4 dPCR-HRM 的菌群鑒別能力、穩(wěn)定性和適用性

用dPCR-HRM 技術(shù)檢測(cè)T1～T5 號(hào)唾液樣本，不同個(gè)體有不同的dPCR-HRM 圖譜［GCP＜87.07%（52.11%±22.79%），圖5］。同一唾液樣本，間隔1 d、1周重復(fù)檢測(cè)，所得圖譜基本相同［GCP＞92.39%（97.78%±2.30%）］。模擬唾液斑樣本在紗線轉(zhuǎn)移后使用dPCRHRM 法也可成功檢測(cè)，且至少在8 h 內(nèi)圖譜相對(duì)穩(wěn)定［GCP＞90.83%（96.67%±2.98%），圖6］。

圖5 不同個(gè)體唾液菌群的dPCR-HRM 圖譜Fig.5 dPCR-HRM profiles of salivary bacterial community of different individuals

圖6 不同沉積時(shí)間唾液斑的dPCR-HRM 圖譜Fig.6 dPCR-HRM profiles of salivary stains with different deposition times

2.5 群體唾液菌群的dPCR-HRM 型分析

用建立的dPCR-HRM 法集中分析61 名志愿者的唾液，以GCP=80%為界值，可分為10 種基本類型，以①～⑩表示（圖7～8）。由①到⑩，各型檢出的頻數(shù)分別為6、3、9、13、2、2、4、9、12、1。再隨機(jī)抽取6 份進(jìn)行盲測(cè)，除1 個(gè)需要修正溫度偏離外，對(duì)照基本型均可以作出正確判斷。

圖7 10 種唾液菌群型的歸一化HRM 圖譜Fig.7 Normalized HRM profiles of 10 bacterial community types in saliva

圖8 10 種唾液菌群型的熔解曲線Fig.8 Melting curves of 10 bacterial community types in saliva

3 討論

法醫(yī)學(xué)現(xiàn)場(chǎng)檢材中細(xì)菌的種類和數(shù)量包含著其來源個(gè)體、遺留時(shí)間等信息，為法醫(yī)學(xué)問題的解決提供了新的思路。但目前的菌群分析技術(shù)[27]尚難以滿足法醫(yī)學(xué)應(yīng)用要求，需要結(jié)合法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)?zāi)康摹⒓夹g(shù)要求等進(jìn)行改進(jìn)和評(píng)價(jià)。本研究結(jié)合dPCR和HRM 技術(shù)建立了一種可用于人體菌群快速分析的dPCR-HRM技術(shù)，并初步評(píng)價(jià)了其應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的可行性。

3.1 dPCR-HRM 菌群快速檢測(cè)的原理

常規(guī)的菌群DNA 分析包括檢材預(yù)處理、DNA 提取、擴(kuò)增和PCR 產(chǎn)物分析等，步驟多，耗時(shí)長(zhǎng)，難以自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化。其中以DNA 提取和產(chǎn)物分析最為繁瑣，耗費(fèi)檢材，且可能改變樣本菌群結(jié)構(gòu)，增加污染風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)菌DNA 的提取有釋放和純化兩個(gè)環(huán)節(jié)，即先用機(jī)械、理化或酶解等手段破壞細(xì)胞，釋放DNA，然后通過抽提或吸附等去除其中雜質(zhì)。熱解法不需要特別的設(shè)備、試劑，在各種破壞細(xì)胞壁的手段中最為簡(jiǎn)單。唾液等樣本經(jīng)簡(jiǎn)單處理后可直接加入PCR 體系，利用擴(kuò)增前預(yù)變性時(shí)的高溫裂解細(xì)菌，即可釋放出足夠的模板[19，22]。研究[28]表明，在基于16S rDNA 的PCR 分析中，各種模板提取方法對(duì)結(jié)果影響不大，與采樣等其他因素相比較幾乎可以忽略不計(jì)。dPCR 技術(shù)本身在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域就應(yīng)用廣泛[29-30]，如能實(shí)現(xiàn)基于dPCR 的菌群DNA 分析，不僅符合法醫(yī)學(xué)檢材特點(diǎn)和檢驗(yàn)要求，也更易于普及推廣。

菌群檢測(cè)在PCR 后須用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）等較為復(fù)雜的方法進(jìn)行分析，耗時(shí)費(fèi)力[9-11]。雙鏈DNA 的熔解曲線因長(zhǎng)度、序列和GC 含量而異，HRM 利用解鏈溫度差異鑒別DNA，為菌群PCR 產(chǎn)物的分析提供了一種新途徑?？稍跀U(kuò)增前將EvaGreen 熒光染料加入PCR 體系，連續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增和PCR 產(chǎn)物分析。菌群的16S rDNA 片段擴(kuò)增后，體系內(nèi)既有來自各種細(xì)菌同一基因但序列各異的同源雙鏈DNA，也有這些序列相互雜交形成的、不同程度錯(cuò)配的異源雙鏈DNA。這些同源、異源雙鏈DNA 的解鏈溫度各不相同，拷貝數(shù)也因樣本的菌群結(jié)構(gòu)而異，整個(gè)體系在熱變性時(shí)會(huì)生成復(fù)雜的熔解曲線，具體形態(tài)取決于樣本的菌群結(jié)構(gòu)，即細(xì)菌的種類和各種細(xì)菌的豐度。HRM 軟件把每個(gè)樣本的曲線作為一個(gè)整體進(jìn)行分析、比較，計(jì)算樣本曲線之間的歐氏距離，轉(zhuǎn)換成GCP，以客觀、量化的形式反映兩個(gè)樣本HRM 曲線的相似度。

聯(lián)合應(yīng)用dPCR 和HRM 技術(shù)，使用熒光定量PCR儀對(duì)樣本的菌群進(jìn)行PCR-HRM 分析，可集傳統(tǒng)的提取、擴(kuò)增和PCR 分析于一體，全程閉管、無縫銜接，按菌群結(jié)構(gòu)對(duì)樣本進(jìn)行快速分類、篩選，減少需要STR分型或二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）的樣本數(shù)目，降低檢驗(yàn)成本，提高檢驗(yàn)效率。

3.2 dPCR-HRM 的可行性

近年已有使用dPCR快速分析細(xì)菌DNA的報(bào)道[31]，但均以特定細(xì)菌為目標(biāo)。與單一序列的擴(kuò)增不同，菌群PCR 不僅需要樣本釋放足夠DNA 模板，還應(yīng)盡量保持各種細(xì)菌DNA 所占的比例。為了驗(yàn)證dPCR 用于菌群分析的可行性，本研究選取5 份唾液樣本，每份同時(shí)使用dPCR-HRM 和kPCR-HRM 進(jìn)行菌群分析。兩種方法除模板不同外，其他條件保持一致。結(jié)果表明，只要兩種方法所用模板的樣本來源相同，得到的HRM 圖譜高度相似，GCP超過80%［GCP＞95.85%（96.95%±1.56%）］。這與多數(shù)文獻(xiàn)[19，22，28]報(bào)道的一致，即提取方法對(duì)菌群DNA 分析的影響較小。至少對(duì)于唾液樣本的菌群分型來說，不論直接擴(kuò)增還是提取后擴(kuò)增，兩者的有效模板構(gòu)成基本相同，不影響其HRM型的判讀。HRM 技術(shù)用于菌群分析的可行性已被EVERMAN等[17，32]的研究證實(shí)，免于提取的dPCR-HRM在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步簡(jiǎn)化，可在90 min 內(nèi)同步完成數(shù)十甚至上百個(gè)樣本的分析，同時(shí)也更便于操作的自動(dòng)化。

為了評(píng)價(jià)dPCR 擴(kuò)增時(shí)菌群模板DNA 釋放效率及所需最小樣本量，本研究同時(shí)用dPCR-HRM 和kPCR-HRM 法調(diào)查了一組梯度稀釋的唾液樣本。該組樣本由5 人份唾液等體積混合、梯度稀釋而成，以降低個(gè)體差異影響，更能代表一般個(gè)體的情況。調(diào)查結(jié)果表明，kPCR-HRM 法可檢測(cè)低至2.5×10-3ng/μL的唾液DNA，dPCR-HRM 可檢測(cè)到2.9×10-3nL 的唾液。根據(jù)細(xì)菌平均基因組大?。s4×106bp）[33]和唾液細(xì)菌含量（約9×106/μL）[34]估計(jì)，兩者大約分別相當(dāng)于500和20～30 個(gè)細(xì)菌。雖然試劑盒提取的唾液DNA 中難免混合人和其他微生物的DNA[35]，無法準(zhǔn)確計(jì)算實(shí)際的細(xì)菌數(shù)，但結(jié)合兩種模板稀釋后的唾液量估計(jì)，dPCR-HRM 法靈敏度不低于kPCR-HRM 法，支持菌群DNA 可以在本研究的直接擴(kuò)增條件下有效釋放，提取并非必要[28]。

值得注意的是，菌群分析技術(shù)不能簡(jiǎn)單地用傳統(tǒng)的靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。雖然dPCR-HRM 法可檢測(cè)到稀釋3.5×105倍唾液中的細(xì)菌，但所得HRM 圖譜已與稀釋范圍在35～3.5×103倍時(shí)的明顯不同。分析認(rèn)為，樣本稀釋倍數(shù)過高時(shí)，包含的細(xì)菌種類已不能代表樣本原來的菌群結(jié)構(gòu)，所得HRM 圖譜也不具有代表性，且易因隨機(jī)因素和污染而不穩(wěn)定。本研究對(duì)混檢樣本的分析結(jié)果表明，唾液量在1×10-4～1×10-2μL，相當(dāng)于1×103～1×105個(gè)細(xì)菌時(shí)，所得HRM 圖譜基本一致且穩(wěn)定。唾液量過高時(shí)，可能因干擾物過多或擴(kuò)增不平衡等，所得圖譜也不具有代表性。因此，dPCR-HRM 菌群分析的靈敏度以能獲得樣本代表性圖譜的最小樣本量來表示更有實(shí)際意義。本研究條件下，dPCR-HRM分析唾液菌群的靈敏度約為1×10-4μL，至少含1×103個(gè)以上細(xì)菌。

3.3 dPCR-HRM 菌群分析的應(yīng)用

上述分析結(jié)果說明，只有樣本用量在一定范圍內(nèi)時(shí)，菌群HRM 圖譜才有可比性，才能用于分析兩個(gè)樣本是否具有相同或相似的菌群結(jié)構(gòu)。而現(xiàn)場(chǎng)斑痕無法估計(jì)沉積體液的量，直接擴(kuò)增法不能通過DNA 濃度估計(jì)細(xì)菌數(shù)量，必須利用其他信息來判斷dPCRHRM 圖譜是否能代表樣本菌群特征。然而，dPCRHRM 的擴(kuò)增過程本身具有實(shí)時(shí)定量的功能。分析上述梯度稀釋樣本的擴(kuò)增曲線，結(jié)果表明，可以通過樣本的Ct 值來估計(jì)有效模板量。只要同批檢驗(yàn)的兩個(gè)樣本的Ct 值相差不大，即可認(rèn)為通過HRM 圖譜來比較其菌群結(jié)構(gòu)是有意義的。否則，應(yīng)調(diào)整樣本用量。實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)綜合分析樣本的擴(kuò)增曲線、熔解曲線以及陰性、陽性對(duì)照，結(jié)合Ct、GCP 等綜合評(píng)判。

理想的菌群快速檢測(cè)還應(yīng)有較好的鑒別能力、穩(wěn)定性和檢材適應(yīng)性[36]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證dPCR-HRM鑒別菌群的能力，評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性和檢材適應(yīng)性，本研究調(diào)查了一組唾液樣本和唾液斑樣本。結(jié)果表明，來自不同個(gè)體的唾液有不同的HRM 圖譜。圖譜的個(gè)體間差異雖然大小不一［GCP＜87.07%（52.11%±22.79%）］，但遠(yuǎn)大于同一樣本在不同時(shí)間檢測(cè)時(shí)的差異［GCP＞92.39%（97.78%±2.30%）］。且同一樣本的dPCR-HRM圖譜與kPCR-HRM 圖譜基本相同，方法間的差異也遠(yuǎn)小于樣本間的差異。雖然樣本量有限，但支持dPCRHRM 有較好的鑒別能力和穩(wěn)定性。

菌群結(jié)構(gòu)的多樣性或個(gè)體差異是菌群分析法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的主要基礎(chǔ)。雖然唾液菌群的高度多樣性已被包括NGS 在內(nèi)的諸多研究[37-38]證實(shí)，但dPCR-HRM所能揭示的多樣性尚待調(diào)查。本研究結(jié)果表明，即使受試者均在生活環(huán)境和飲食趨同的高校內(nèi)，僅16S rDNA V4 區(qū)就可檢出多種類型。且考慮溫度、PCR循環(huán)次數(shù)對(duì)HRM 分型的影響，參考SAKARIDIS 等[26]的研究，本研究選擇了較為保守的GCP 界值（80%）。未來在體系內(nèi)引入溫度內(nèi)參、控制循環(huán)次數(shù)，并在增強(qiáng)穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上提高GCP 界值，有望進(jìn)一步提高dPCR-HRM 技術(shù)的分型能力。

檢材的復(fù)雜性是法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的顯著特征，斑痕是最常見的現(xiàn)場(chǎng)檢材。本研究對(duì)dPCR-HRM 用于唾液斑的可行性進(jìn)行了初步評(píng)估，發(fā)現(xiàn)模擬唾液斑用常規(guī)的紗線轉(zhuǎn)移法即可進(jìn)行菌群分析。結(jié)合上述靈敏度實(shí)驗(yàn)，支持dPCR-HRM 菌群檢驗(yàn)并不需要額外的檢材處理和消耗，多數(shù)情況下常規(guī)檢材浸洗液即可滿足要求。對(duì)不同沉積時(shí)間唾液斑的調(diào)查結(jié)果表明，8 h 之內(nèi)唾液斑與其來源樣本的圖譜基本相同［GCP＞90.83%（96.67%±2.98%）］，說明本方法所揭示的斑痕菌群結(jié)構(gòu)是相對(duì)穩(wěn)定的，至少與形成斑痕時(shí)的唾液有可比性，這與關(guān)于采樣時(shí)機(jī)、采集方法均會(huì)影響NGS菌群分析的報(bào)道[39]并不一致。結(jié)合文獻(xiàn)[40]分析認(rèn)為，與NGS 的高成本、高分辨率不同，本研究所述方法類似于經(jīng)典的DGGE 菌群分析，分辨率低，對(duì)屬以下水平變化、低豐度菌屬變化和幅度小的變化不敏感。同時(shí)，由于唾液含菌量大，高豐度菌屬間的比例不易因污染、采樣而大幅改變。因此，唾液菌群的HRM 圖譜相對(duì)穩(wěn)定，但該方法的分辨率或圖譜的個(gè)體特異性遠(yuǎn)小于NGS 分析，其意義主要在于樣本初篩，在個(gè)體識(shí)別方面，可通過HRM 圖譜比較快速地排除一部分樣本，為重點(diǎn)樣本的精準(zhǔn)分析創(chuàng)造條件，彌補(bǔ)NGS 成本高、耗時(shí)長(zhǎng)的局限性。如用于含菌量低、優(yōu)勢(shì)菌屬不明顯的樣本，應(yīng)控制環(huán)境、試劑和耗材等可能的細(xì)菌污染源，統(tǒng)一采樣方式和提取方法，以保證樣本間的可比性。

3.4 小結(jié)

細(xì)菌是法醫(yī)學(xué)檢材的重要組成部分。不同體液的菌群有明顯差異，同一類型體液的菌群結(jié)構(gòu)也因人而異?，F(xiàn)場(chǎng)斑痕、尸體中的菌群包含著豐富的信息，菌群分析是解決一系列法醫(yī)學(xué)問題的新途徑。如能實(shí)現(xiàn)體液斑痕的菌群快速檢測(cè)，按體液類型和來源個(gè)體對(duì)現(xiàn)場(chǎng)斑痕進(jìn)行分類篩選，有助于明確目標(biāo)，提高DNA 分型針對(duì)性，提高辦案效率。因此，研發(fā)簡(jiǎn)單快速的菌群分析技術(shù)具有重要意義。

本研究建立了一種不需要提取和電泳的dPCRHRM 菌群分析技術(shù)，簡(jiǎn)單快速且有較高的靈敏度、穩(wěn)定性和鑒別能力，并初步驗(yàn)證了其在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。但是，必須意識(shí)到菌群分析是以群體特征為目標(biāo)的微生態(tài)學(xué)研究，菌群PCR 與傳統(tǒng)的單基因座PCR、復(fù)合擴(kuò)增均有諸多區(qū)別。本研究?jī)H以16S rDNA V4區(qū)和唾液（斑）為例，且只進(jìn)行了小樣本評(píng)估，包含溫度內(nèi)參的多片段dPCR-HRM 分析、dPCR-HRM 用于其他類型體液（斑）及應(yīng)對(duì)復(fù)雜檢材的能力還有待進(jìn)一步研究?，F(xiàn)場(chǎng)斑痕的溯源是法醫(yī)學(xué)的核心問題，雖然人體菌群有高度的個(gè)體特異性，但目前還難以通過菌群分析進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。未來應(yīng)擴(kuò)大樣本范圍和樣本量，調(diào)查不同采樣時(shí)機(jī)和方法，全面評(píng)價(jià)各種影響因素，結(jié)合菌群溯源技術(shù)發(fā)展[35，41]，積極探索實(shí)現(xiàn)法醫(yī)學(xué)斑痕菌群溯源的途徑。