基于神經(jīng)肌肉接頭興奮傳遞研究得氣針感調(diào)控機制的思路探討?

周 晨，劉 群，辛娟娟，趙玉雪，吳 爽，張雯晰，喻曉春，高俊虹

(中國中醫(yī)科學院針灸研究所，北京 100700)

得氣是指針刺入腧穴后氣至針下的機體狀態(tài)，為進一步施加針刺手法的前提條件，亦是判斷患者經(jīng)氣強弱、疾病預后的重要依據(jù)[1]。針感則是近現(xiàn)代針灸學家提出的生理學概念，它包括針刺過程中醫(yī)者的主觀感覺和患者的自覺反應[2]。針感中包含得氣針感和非得氣針感(如痛感)。得氣針感主要是指醫(yī)者手下有沉緊感以及患者在針下出現(xiàn)的酸、麻、脹、重感或循經(jīng)傳導的蟻行感[3]。得氣針感的形成機制復雜，一直以來都是針灸研究領域的重點工作，但其產(chǎn)生的物質(zhì)基礎至今尚無定論?？紤]其作為一種復合感覺，必定有神經(jīng)系統(tǒng)的參與，而神經(jīng)廣泛分布于穴區(qū)各層組織，故得氣針感與各個組織層次都有關，是穴區(qū)多種組織結(jié)構(gòu)共同作用的結(jié)果；另一方面，由于患者的感覺受個體差異、身體部位差異等多種因素的影響，存在一定的主觀性和不確定性，故醫(yī)者手下針感則是對得氣判斷的主要依據(jù)；本研究室前期相關研究提示，醫(yī)者手下沉緊感可能與肌肉的關系更為密切[4]，因而肌肉組織在得氣針感主成分產(chǎn)生的原因中占比重更大一些；而神經(jīng)肌肉接頭作為一類經(jīng)典的外周膽堿能特化的化學突觸，是聯(lián)系軀體運動神經(jīng)末梢和骨骼肌的關鍵部位。因此，有關得氣針感與神經(jīng)、肌肉關系的梳理以及神經(jīng)肌肉接頭興奮傳遞調(diào)控機制的研究，不但為探討神經(jīng)系統(tǒng)突觸功能和作用奠定了理論基礎，也將為得氣針感產(chǎn)生的機制研究提供重要線索。

1 得氣針感與穴區(qū)神經(jīng)和肌肉的關系

1.1 得氣針感與穴區(qū)神經(jīng)的關系

得氣針感與神經(jīng)的關系十分密切。早在民國時期，以承淡安為代表的針灸學家用西醫(yī)神經(jīng)的觀點，賦予了“得氣”新的內(nèi)涵即針與神經(jīng)發(fā)生反應，患者也有相應的感覺，“病者亦覺針下酸麻脹重”[5]。20世紀80～90年代，國內(nèi)生理學家研究已發(fā)現(xiàn)90%的穴位都分布著神經(jīng)束、游離神經(jīng)末梢和血管神經(jīng)，如合谷、內(nèi)關、委中、環(huán)跳等要穴多有神經(jīng)支干通過[6]，尤其是通過八髎穴、背俞穴等與神經(jīng)血管的解剖關系可知，古人實際已經(jīng)潛在地循神經(jīng)取穴[7]。Zhang等學者提出了“神經(jīng)針刺單元”學說，認為穴位是多種神經(jīng)末梢裝置的復合結(jié)構(gòu)[8]。針刺的感覺信息是由神經(jīng)傳導的，神經(jīng)是針感產(chǎn)生的必要結(jié)構(gòu)[9]。電生理實驗顯示，針刺內(nèi)關或神門，在產(chǎn)生得氣感的同時，能記錄到肘部及腋部正中神經(jīng)上出現(xiàn)動作電位[10]。針刺在穴區(qū)各種組織中可引起不同的針感反應，但仍以“刺中”神經(jīng)的發(fā)生機會最多。研究表明，深刺足三里、承山、委中等穴位的神經(jīng)束時容易得氣；在針刺后加入手法，加強對腧穴周圍神經(jīng)血管的刺激，可以加速得氣的出現(xiàn)[11]。若阻斷穴位深部神經(jīng)及血管神經(jīng)則針感消失，針效也同時消失[12]。

外周感覺神經(jīng)纖維是針感產(chǎn)生的物質(zhì)基礎，不同類型的神經(jīng)纖維被激動會產(chǎn)生不同的得氣效應[13]。Wang KM[14]等在研究中發(fā)現(xiàn)，針感中的酸感與C纖維關系最密切，麻感主要由Aβ/γ纖維傳遞，脹、重感由Aδ纖維傳導。Beissner[15]等認為，刺痛感主要由Aδ纖維調(diào)控，鈍、壓感則由C纖維參與傳遞。此外亦有研究顯示，毫針直接刺中穴位神經(jīng)干而產(chǎn)生強烈的“竄、動、抽”針感，可能與髓纖維和H類纖維的傳導有關[16]。足夠強度的刺激施于穴位方能引起針感。通常手針捻轉(zhuǎn)可興奮全部Ⅰ-Ⅳ類纖維，以酸脹感為主[17]，電針興奮A類和C類纖維以麻感為主[18，19]。

1.2 得氣針感與穴區(qū)肌肉的關系

針刺是一種外力刺激，當刺激達到一定程度時,就會興奮骨骼肌的深部感受器[20]，通過興奮性突觸，引起肌肉收縮甚至肌肉跳動[21]。肌肉的收縮反應常作為判斷得氣程度的參考指征。有相關臨床實驗發(fā)現(xiàn)，電針參數(shù)恒定，同為足三里穴，得氣點的肌縮反應強度明顯高于非得氣點；且在同等條件下，由于男性相比女性肌肉更加豐厚，男性得氣點的電針肌縮反應更強[22]。在臨床實踐中，針刺飛揚、承山、環(huán)跳等肌肉豐厚尤其是靠近肌腹處的穴位，若手法得當常會出現(xiàn)跳動性針感，可獲得極好的臨床療效[23]。這種現(xiàn)象是由肌肉突發(fā)、快速的收縮所致，是針刺得氣的一種表現(xiàn)，所謂“氣之至也，如魚吞鉤餌之沉浮”。本研究室前期研究工作觀察到，在肌肉豐厚處穴位針刺時，受試者脹感與施針者手下沉緊感常相伴而生，并伴有穴區(qū)肌電發(fā)放，這提示受試者脹感、酸感及施針者手下沉緊感等得氣針感可能主要產(chǎn)生于肌肉組織[4]。

另一方面，相關研究表明肌肉的深部感受器是針感產(chǎn)生的物質(zhì)基礎。眾所周知，分布在骨骼肌內(nèi)的肌梭是一種感受肌纖維伸縮變化的特殊梭形裝置，為肌肉豐厚處穴位主要的針感深部感受器[24]。肌梭受到針刺后會收縮、牽拉甚至敏感性增高，處于相對興奮的狀態(tài)，同時會發(fā)放肌電[25]。臨床上發(fā)現(xiàn)，通過增加穴位處的肌緊張度再行針刺，可更快速有效地幫助針感產(chǎn)生，這可能與直接刺激到穴區(qū)肌梭有關[26]。另有研究監(jiān)測到，針刺得氣時穴位局部有規(guī)律的持續(xù)性肌電發(fā)放，且其幅值、次數(shù)與針感強度成正相關[27]。本實驗室前期的工作亦提示，施針者手下沉緊感的產(chǎn)生可能是由于針刺使肌肉豐厚處的穴區(qū)局部肌肉內(nèi)的肌梭受壓力牽拉等作用而產(chǎn)生形變，引發(fā)牽張反射而使穴區(qū)局部肌緊張所致[28]。

縱觀以上得氣針感產(chǎn)生的機制較為復雜，應為穴區(qū)多種組織結(jié)構(gòu)共同作用的結(jié)果[29-31]，而其中神經(jīng)和肌肉組織在得氣針感主要成分醫(yī)者手下沉緊感產(chǎn)生機制中的作用可能更加重要。

2 神經(jīng)肌肉接頭興奮傳遞調(diào)控機制的研究進展

神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)是運動神經(jīng)元軸突末梢在骨骼肌纖維上的接觸點，主要由運動神經(jīng)元、骨骼肌和雪旺氏細胞(Schwann cell)組成[32]。神經(jīng)元末梢側(cè)的接頭膜稱為突觸前膜，肌細胞側(cè)的接頭膜稱為突觸后膜。前膜乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)囊泡錨定和釋放的部位稱為活性區(qū)，與后膜交叉折疊形成運動終板。后膜有乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)以及與其分布一致的乙酰膽堿酯酶(acetylcholin esterase，AChE)高度富集，AChE的作用受肌肉活性和神經(jīng)誘發(fā)胞膜去極化的調(diào)節(jié)，保證了突觸前后膜信息傳遞的精準高效[33]。當動作電位到達神經(jīng)末梢時，接頭前膜去極化引起電壓門控式Ca2+通道開放，細胞外Ca2+進入神經(jīng)末梢內(nèi)，促使大量囊泡向前膜靠近并與之融合，囊泡中的ACh以胞裂外排的方式釋放入突觸間隙，與后膜表面的N2型AChR陽離子通道結(jié)合，并使之激活開放，觸發(fā)肌細胞產(chǎn)生動作電位，引起骨骼肌收縮，隨后ACh經(jīng)AChE水解迅速失活而生理效應終止[34]。在神經(jīng)肌肉接頭的興奮傳遞過程中，受到突觸前和突觸后來源諸多重要信號分子的調(diào)控。

2.1 NMJ后膜調(diào)控機制研究

一直以來，AChR的簇集被公認為是形成和維持NMJ的標志[35]。目前已知Agrin/LRP4/MuSK信號通路和Neuregulins/ErbB信號通路等介導了的后膜AChR發(fā)育、聚集及穩(wěn)定[36]。

2.1.1 Agrin/LRP4/MuSK信號通路 Agrin/LRP4/MuSK信號通路聚集蛋白(Agrin)是一種由運動神經(jīng)元胞體合成的分泌蛋白，在運動神經(jīng)元、肌肉和Schwann細胞中都有表達，具有高度特異性[37]。Agrin與突觸后膜受體dystroglycan結(jié)合，誘導AChR聚集、重排，不僅在促進NMJ形成的過程中起著關鍵作用，對NMJ的穩(wěn)定和修復也非常重要[38]。肌肉特異性激酶(muscle-specific kinase，MuSK)是一種跨膜蛋白，通過發(fā)育的骨骼肌細胞選擇性表達并聚集在突觸后膜，對于NMJ組織結(jié)構(gòu)和功能的完整必不可少[39]。MuSK作為Agrin受體，在Agrin信號傳導調(diào)控中發(fā)揮著關鍵作用。Jones實驗證明，雖然肌纖維具有表達足夠水平AChR的潛能，但只有MuSK蛋白經(jīng)Agrin快速磷酸化激活后才會啟動細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應，誘導AChR的聚集，這一過程受正反饋調(diào)節(jié)[40]。盡管Agrin和MuSK是調(diào)控AChR簇集信號通路中的關鍵性物質(zhì)，但兩者間并不能直接相互作用[41]。而骨骼肌源性低密度脂蛋白受體相關蛋白4(Low-density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4)作為共受體介導Agrin對MuSK的激活作用，誘導突觸后膜AChR聚集簇形成[42]，還能逆向調(diào)控運動神經(jīng)元軸突末梢的分化[43，44]。此外Choi等研究表明，LRP4還通過與淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)相結(jié)合形成復合物，顯著增強agrin誘導AChR聚集[45]。

2.1.2 Neuregulins/ErbB信號通路 在NMJ發(fā)育過程中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白家族成員Neuregulin1(Nrg1)其酪氨酸激酶受體ErbB廣泛表達于運動神經(jīng)元、骨骼肌纖維及Schwann細胞中[46]。Nrg1參與NMJ后膜特異性基因的表達，Simeone和Straubinger實驗報道敲除小鼠Nrg1，突觸后AChR密度降低50%，Nrg1與ErbB受體的相互作用通過細胞內(nèi)分子erbin，促進MuSK磷酸化[47]。Schmidt認為，Nrg1與受體ErbB的相互作用通過α-dystrobrevin磷酸化穩(wěn)定突觸后裝置，從而有助于將AChR簇錨定在突觸后膜上[48]。Nrg1-III不僅是Schwann細胞識別并包繞軸突形成髓鞘的關鍵因素，還調(diào)控髓鞘厚度[49]。在Nrg1-III敲除體中，未成熟Schwann細胞的形成數(shù)量明顯減少[50]。由于Schwann細胞也表達Nrg1及其受體，越來越多研究提示，Nrg1對NMJ突觸后膜的調(diào)節(jié)作用可能通過調(diào)控Schwann細胞的存活及其功能間接實現(xiàn)[51]。Lee等[52]研究亦發(fā)現(xiàn)，運動神經(jīng)末梢特異性過表達Nrg1轉(zhuǎn)基因小鼠顯示出明顯的NMJ突觸“消減”加速表型，成年后持續(xù)過表達Nrg1則促進NMJ結(jié)構(gòu)與功能重塑，表明運動神經(jīng)源性Nrg1對NMJ可塑性的調(diào)控作用可能依賴于運動神經(jīng)末梢Schwann細胞的功能發(fā)揮。

2.2 NMJ前膜調(diào)控機制研究

NMJ突觸前運動神經(jīng)末梢的分化與成熟依賴于骨骼肌來源“逆向”信號分子的調(diào)控作用，較之于運動神經(jīng)來源“順向”信號研究，目前對“逆向”信號分子研究較為有限，主要集中在β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、層黏連蛋白β2(laminin β2)、β1整合素(β1 integrin)等相關信號分子調(diào)控方面[53]。

2.2.1 Wnt/β-catenin信號通路研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在突觸發(fā)育過程中起著決定性作用，Wnt配體蛋白為突觸生成因子[54]。蓬亂蛋白(dishevelled protein，Dvl)作為Wnt信號通路的中心效應因子，能夠與MuSK相互作用，調(diào)節(jié)AChR聚集[55]，若Dvl突變則會引起體外培養(yǎng)NMJ突觸前后膜的功能異常。Wnt家族中Wnt3a可通過抑制NMJ腳手架蛋白rapsyn轉(zhuǎn)錄，減少AChR聚集簇形成[56]。Li等[57]通過采用骨骼肌特異性敲除β-catenin，可導致小鼠出生后即刻死亡，并伴有嚴重的NMJ發(fā)育缺陷，如運動神經(jīng)軸突功能異常、膈神經(jīng)自發(fā)放電頻率顯著降低，而當運動神經(jīng)元特異性敲除β-catenin后，突變小鼠NMJ形態(tài)和功能不受影響。首次在基因水平證實，Wnt下游信號分子β-catenin直接參與NMJ“逆向”信號通路的調(diào)控。

2.2.2 laminin β2/β1 integrin信號通路 laminin β2除了與P/Q鈣通道結(jié)合外，還激活細胞外基質(zhì)蛋白ECM受體β1 integrin，在缺乏集聚蛋白的情況下增加AChR聚集，提示這一機制參與神經(jīng)AChR簇“預排”的形成。然而在缺乏β1 integrin的小鼠中，肌細胞在Agrin的作用下形成AChR簇，表明laminin β2/β1 integrin通路對NMJ發(fā)育的調(diào)控作用可能還存在一些非AChR轉(zhuǎn)錄依賴的其他途徑[58]。Lluri等[59]研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-2敲除小鼠的肌肉組織中β1 integrin表達水平顯著下降，同時伴有運動神經(jīng)元軸突過度分支和突觸消減障礙的表型，這與骨骼肌特異性β1 integrin敲除小鼠具有一定的相似性，驗證了β1 integrin可作為“逆向”信號分子參與調(diào)控突觸前運動神經(jīng)元的發(fā)育和成熟。Fox等[60]進一步通過基因敲除手段得到的laminin β2突變小鼠，表現(xiàn)出嚴重的NMJ突觸前發(fā)育缺陷，證實了骨骼肌來源多種“逆向”信號分子可相互協(xié)同共同調(diào)控NMJ突觸前膜特化結(jié)構(gòu)的形成、成熟和功能維持。

2.3 Schwann細胞在NMJ調(diào)控中的作用

Schwann細胞包繞在運動神經(jīng)軸突終末，在NMJ的發(fā)育和終板的維持中起積極作用[61]。在發(fā)育過程中，軸突終末隨Schwann細胞延伸，并向肌肉-神經(jīng)接觸之前的NMJ附近遷移[62]。體內(nèi)實驗證明，Schwann細胞在突觸生長期前數(shù)量增多，在軸突生長和神經(jīng)支配過程中起引導作用[63]。相反，缺乏Schwann細胞會誘導發(fā)育中的NMJ突觸前和突觸后缺陷[64]。

Schwann細胞會分泌Agrin、Tgf-β1和CNTF、BDNF、MMPs等神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進AChR聚集，提高發(fā)育突觸的遞質(zhì)傳輸效率，可支持肌肉-神經(jīng)接觸。反過來，Schwann細胞受肌肉衍生因子如NT-3、Nrg1或神經(jīng)元釋放因子如ATP、Ach和Agrin的影響[65]。Fields研究表明，小鼠在高頻神經(jīng)刺激下，ACh從神經(jīng)末梢釋放期間會引起Schwann細胞中的Ca2+應答[66]。Trachtenberg實驗室觀察到，新生大鼠NMJ去神經(jīng)支配后，局部注射Nrg1就能阻止Schwann細胞退變[67]。

3 神經(jīng)肌肉接頭興奮傳遞在得氣針感中調(diào)控機制的新思路

由上可知，有關得氣針感與肌肉、神經(jīng)的關系以及NMJ結(jié)構(gòu)、功能和信號機制方面的研究由來已久。亦有許多相關研究表明，針刺能夠通過調(diào)節(jié)NMJ分子，促進NMJ重建再生。Huang等研究表明，針刺能增加AChR的表達，促進受損骨骼肌合成更多Agrin，正向調(diào)控MuSK蛋白的表達水平，加強AChR的募集，促進骨骼肌功能的恢復[68，69，70]。徐前威[71]報道，電針能通過增加AChE和AChR表達，促進大量新生肌纖維生成，有利于受損骨骼肌運動終板的修復。徐家淳[72]在離體研究中發(fā)現(xiàn)，火針干預能調(diào)控脊髓損傷神經(jīng)干細胞Wnt 3a、β-catenin基因的表達。趙碩[73]認為，針刺促進坐骨神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)纖維修復的機制，與上調(diào)脊神經(jīng)節(jié)中NCAM和CNTF的表達有關。黃志強[74]檢測到，電針能提高急性損傷脊髓中NGF、BDNF的表達。陳怡然[75]等發(fā)現(xiàn)，針刺治療能加快神經(jīng)組織中Schwann細胞增殖，促進髓鞘重建和軸突再生，上述研究成果為NMJ信號分子在針刺調(diào)控中的作用提供了重要線索，然而NMJ在穴區(qū)不同組織結(jié)構(gòu)得氣針感中扮演的角色猶未可知。

如前所述，得氣針感作為一種復合感覺，必定有神經(jīng)系統(tǒng)的參與；另一方面，肌肉組織在得氣針感主要成分產(chǎn)生的原因中占比重更大一些；作為運動神經(jīng)末端和肌肉相連接的最重要的部位，NMJ是引發(fā)肌肉收縮的關鍵部位，其各個層面的調(diào)控作用與得氣針感產(chǎn)生的機制密不可分。綜上所述，以運動神經(jīng)元軸突末梢和肌纖維相連接的效應位點NMJ為切入點，觀察穴區(qū)組織神經(jīng)元及其神經(jīng)纖維投射的分布規(guī)律以及針刺得氣前后NMJ相關的組織形態(tài)學變化情況，并結(jié)合針刺得氣前后穴區(qū)局部組織中NMJ前膜和后膜的相關信號站點的調(diào)控變化，詳細分析上述參與NMJ調(diào)控各層面的信號分子中哪一個或哪一些成分在介導得氣針感中發(fā)揮作用，探討其興奮傳遞在得氣針感產(chǎn)生過程中的調(diào)控機制，將為指導臨床實踐提供全新的視角和思路。