基于氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的乳香醋炙前后揮發(fā)油成分變化分析?

鄭立紅，劉振麗，宋志前，王 淳，彭詩濤，李林福，寧張弛△

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；3.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000)

乳香為橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.及同屬植物Boswelliabhaw-dajianaBirdw.樹皮滲出的樹脂，具有活血定痛、消腫生肌的功效[1]。歷代醫(yī)家認為乳香氣味辛烈，具有強刺激性，雖活血消腫止痛能力較強，但多以外用為主，口服易引起嘔吐，因此乳香的炮制受到了極大重視。據(jù)文獻記載，乳香的炮制始于唐代，有水飛、風(fēng)干、醋炙等方法，現(xiàn)代臨床治療多以醋乳香入藥。

揮發(fā)油類成分是乳香的主要成分之一[2]。傳統(tǒng)中藥炮制理論認為，醋炙可除去部分揮發(fā)油成分，消除其對胃黏膜的刺激性。目前針對乳香揮發(fā)油類成分的研究已有報道，其化學(xué)成分主要為單萜、二萜類、烯類和酯類成分，具有鎮(zhèn)痛、抗菌及抗氧化的活性[2-6]。但是，醋乳香為臨床治療應(yīng)用的主要規(guī)格，關(guān)于醋乳香揮發(fā)油成分的研究還較少，乳香醋炙后揮發(fā)油成分的變化尚未闡明?，F(xiàn)行的醋乳香炮制國家標準僅以“炒至表面光亮”為準，由于缺乏規(guī)范的工藝，使醋乳香的質(zhì)量水平參差不齊，難以保證臨床治療效果發(fā)揮的穩(wěn)定性。揮發(fā)油成分作為醋乳香中的一類重要組成成分，闡明醋炙過程對其的作用是亟待解決的問題之一，同時醋炙過程中的溫度和時間條件對乳香揮發(fā)油成分的作用也需進一步探索。

本研究擬采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)檢測乳香和醋乳香的揮發(fā)油成分變化差異，同時考察了醋乳香炮制過程中炮制溫度和炮制時間對揮發(fā)油成分及其相對含量的影響，為醋乳香的藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)，同時也為制訂合理的乳香醋炙工藝提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要藥物、試劑及儀器

表1示，所收集到的市售乳香及醋乳香，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定均為橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.或同屬植物Boswelliabhaw-dajiana Birdw.樹皮滲出的樹脂。龍門米醋(批號20151126)，北京二商龍和食品有限公司；RS-Fluka(C8-C20，批號1443129)，德國SIGMA公司；乙酸辛酯對照品、α-蒎烯對照品(批號分別為111671-200602、897-200001)，中國食品藥品檢定研究院。

表1 乳香及醋乳香來源

GC-MS-QP2010型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Rxi-5 ms石英毛細管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)，日本島津公司；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同炮制方法醋乳香制備

取乳香分別在80 ℃溫度下炮制20 min、25 min及30 min，在100 ℃溫度下炮制3 min、4 min及8 min，120 ℃溫度下炮制2 min、3 min及5 min，每100 kg乳香用米醋5 kg[7]。

2.2 揮發(fā)油的提取

稱取市售乳香、醋乳香及不同炮制條件自制醋乳香各30 g，加10倍量水浸泡0.5 h，用水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油6 h，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后備用。所得揮發(fā)油為淡黃色透明油狀物，具有特殊的濃郁香味。

2.3 GC-MS條件

GC條件：Restek Rxi-5 ms石英毛細管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min程序升溫至130 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持3 min，進樣量1 μL，分流比1∶60，載氣氦氣。MS條件：電離方式為電子轟擊(electron impact，EI)，離子源溫度200 ℃，接口溫度為250 ℃，電子能量70 eV，電離電壓0.78 kV，質(zhì)量掃描范圍45～450 amu。

2.4 分析測定

按上述GC-MS條件對市售乳香、醋乳香及不同炮制條件醋乳香揮發(fā)油進行分析，得其總離子流(total ion chromatogram，TIC)圖(見圖1)。

注：1.α-蒎烯；2.乙酸辛酯;A.α-蒎烯對照品；B.乙酸辛酯對照品；C.乳香供試品；D.醋乳香供試品

2.5 揮發(fā)油化學(xué)成分分析

對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到各組分的質(zhì)譜圖，經(jīng)過質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索(質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST05.LIB、NIST08.LIB、NIST05 S.LIB、NIST08 S.LIB、Wiley9.LIB)和人工譜圖解析，保留指數(shù)(retention index，RI)是在相同條件下參考C8-C20正構(gòu)烷烴混標測得[8]，進一步確定市售不同批次乳香及醋乳香揮發(fā)油中的化學(xué)成分，并采用面積歸一化法計算。

2.5.1 市售乳香及醋乳香中揮發(fā)油主要成分對比研究 表2示，20批次市售乳香及醋乳香揮發(fā)油分別共鑒定出31個和33個成分，占色譜峰總數(shù)的93.94%和100%，可見乳香醋炙后有2個新成分產(chǎn)生，分別為ethlbenzene和α-側(cè)柏烯。乳香和醋乳香共有成分為5個，10批乳香共有成分7個，分別為α-蒎烯、正辛醇、芳樟醇、乙酸辛酯、乙酸冰片酯、鄰苯二甲酸二乙酯、黑松醇；10批醋乳香共有成分9個，分別為α-水芹烯、α-蒎烯、正辛醇、芳樟醇、trans,trans-3,5-heptadien-2-one、乙酸辛酯、乙酸冰片酯、醋酸正癸酯、鄰苯二甲酸二乙酯。乳香醋炙后，有7個成分含量逐漸減低直至消失，分別為莰烯、benzene、1-methoxy-2-methyl、己基己酸酯、醋酸正葵酯、辛酸己酯和香樹油烯。乳香在醋炙后有些揮發(fā)油成分相對含量增加或有新的成分產(chǎn)生，如α-側(cè)柏烯在醋炙后產(chǎn)生，而另一些成分相對含量則減少，如α-蒎烯等。己酸乙酯、α-蒎烯、香柑油烯等在乳香中量較少，炮制后含量減少。乙酸冰片酯和乙酸辛酯2個成分含量在低溫下隨著炮制時間延長而增加，在高溫下隨著炮制時間延長而減少。

2.5.2 不同醋炙溫度和時間對醋乳香揮發(fā)油成分的影響 取乳香100 g，采用2.1項下方法醋炙?？疾觳煌谥茰囟群蜁r間對醋乳香揮發(fā)油成分的影響(見表2)。乳香揮發(fā)油得率為3.30%，在80 ℃溫度下炮制20 min、25 min及30 min后揮發(fā)油得率分別為3.05%、2.97%及2.75%，在100 ℃下炮制3 min、4 min及8 min后揮發(fā)油得率分別為2.86%、2.72%及2.65%，在120 ℃溫度下炮制2 min、3 min及5 min后揮發(fā)油得率分別為2.74%、2.53%和2.21%，表明揮發(fā)油得率在醋炙后減少，不同炮制條件醋乳香的揮發(fā)油得率證實了隨著炮制溫度的升高和時間的延長，揮發(fā)油得率逐漸減小。相同來源的乳香揮發(fā)油含量較醋乳香高。乳香和醋乳香的主要成分均為乙酸辛酯、正辛醇、α-蒎烯、檸檬烯，乳香中主要成分的相對含量范圍分別為51.92%～79.59%、2.09%～13.50%、0.16%～3.73%、0.10%～1.82%，醋乳香中主要成分的相對含量范圍分別為66.72%～80.94%、4.33%～12.2%、0.39%～2.43%、0.25%～4.15%。不同批次乳香揮發(fā)油化學(xué)成分種類及含量均存在一定差異，揮發(fā)油含量及其主成分相對含量也不同。乳香醋炙后，正辛醇與檸檬烯的含量逐漸增加，而乙酸辛酯與α-蒎烯含量逐漸降低。

表2 市售乳香、醋乳香及不同溫度和不同時間下醋乳香揮發(fā)油成分及其相對含量比較

乳香醋炙后揮發(fā)油組成成分類別包括萜類、醇類以及有機酸類成分，每種類型成分個數(shù)不同，數(shù)量最多的為有機酸酯類成分(如圖2)。研究表明，乳香經(jīng)不同醋炙條件醋炙后萜類成分相對含量升高(從10.2%提升至14.8%)，而醇類(從5.6%降低至3.2%)和有機酸酯類(從80%至65.8%)相對含量降低。同一溫度下隨著炮制時間的延長萜類成分的相對含量增加，而醇類和有機酸酯類均降低。大部分成分隨醋炙程度加深而含量增加(如圖2)。

注：80-20為80℃溫度下炮制20 min；120-5為100℃溫度下炮制5 min

3 討論

揮發(fā)油是乳香藥效物質(zhì)之一，約占3%～8%。現(xiàn)代研究表明，乳香揮發(fā)油具有抗炎、抗癌、陣痛、抑菌及促進中藥成分經(jīng)皮滲透的藥理作用[9-15]。當前，研究者們從乳香揮發(fā)油中鑒定到340余種揮發(fā)性成分[16]。Anjanette等[17]通過對不同品種乳香水蒸氣蒸餾法獲得的揮發(fā)油進行成分分析發(fā)現(xiàn)，α-蒎烯、α-月桂烯、對傘花烯和檸檬烯是揮發(fā)油的主要成分，而其中α-蒎烯和α-月桂烯是區(qū)分不同品種乳香的標志性成分。而另外研究表明，3種不同用藥品種的乳香中，B.dioscorides中含有豐富的單萜烴類化合物，主要成分為α-蒎烯和α-蒎烯，B.elongata中二萜含量以黃輪-4(20)-7,11-三烯、茚三酚和乙酸茚三酚含量最高。而B.socotrana以單萜(烴類和氧化類)為主，主要成分為對傘花烴、樟腦、萜烯-4-醇和2-羥基-5-甲氧基-苯乙酮[5]。2020版《中華人民共和國藥典》中，以揮發(fā)油作為鑒定乳香的依據(jù)，其中埃塞俄比亞乳香主要考察乙酸辛酯的含量，索馬里乳香主要考察α-蒎烯的含量[1]。本研究證實，20批乳香與醋乳香的主要成分均為乙酸辛酯、正辛醇、α-蒎烯、檸檬烯，而不同批次乳香揮發(fā)油化學(xué)成分種類及含量均存在一定差異，揮發(fā)油含量及其主要成分相對含量也不同。因此，除乙酸辛酯和α-蒎烯外，其余主要成分也可考慮作為乳香質(zhì)量控制的指標性成分。

相關(guān)研究報道顯示，乳香醋炙后胃腸刺激性減少，揮發(fā)油可能是刺激性成分的重要組成部分。有研究表明，乳香揮發(fā)油可對大鼠肝臟造成一定程度的損傷[18，19]?；谥嗅t(yī)“扶正祛邪”等治則，有學(xué)者提出扶正祛邪炮制可糾正藥物偏性并緩和藥性[20，21]。乳香揮發(fā)油成分隨炮制工藝條件的變化而改變，經(jīng)不同醋炙條件醋炙后萜類成分相對含量升高，而醇類和有機酸酯類相對含量降低。同一溫度下隨著炮制時間的延長，萜類成分的相對含量增加，而醇類和有機酸酯類均降低。揮發(fā)油作為乳香三大功效成分之一，應(yīng)進一步基于不同種類結(jié)構(gòu)的揮發(fā)油成分的毒性加以深入研究，以規(guī)范其炮制工藝。本研究揭示了乳香醋炙前后揮發(fā)油成分變化，以及不同醋炙過程中溫度和時間參數(shù)對揮發(fā)油的影響，為乳香的質(zhì)量控制標準及炮制工藝的確定提供了一定的借鑒。