混合模式色譜介質(zhì)的制備及其在蛋白分離純化中的應(yīng)用

＊王仕杰 薛彥曉 靳海波 何廣湘 潘天予 柏張傲 張榮月

（北京石油化工學院 新材料與化工學院/燃料清潔化及高效催化減排技術(shù)北京市重點實驗室 北京 102617）

前言

近年來，生物技術(shù)發(fā)展迅猛，越來越多具有生物活性的蛋白質(zhì)被研究和應(yīng)用。蛋白質(zhì)是一種具有特殊性質(zhì)的生物大分子，它的特殊性體現(xiàn)在其結(jié)構(gòu)復雜、難分離、易失活等方面。所以蛋白質(zhì)的分離純化與傳統(tǒng)的化學分離有所不同，需要在分離純化的過程中既要保證蛋白質(zhì)的生物活性，同時又要考慮選擇性，回收率以及成本問題，這些因素增加了蛋白質(zhì)分離純化的難度，成為了生物制品規(guī)模制備的瓶頸技術(shù)問題，為了提高該類制品的分離效率，各種蛋白分離純化技術(shù)應(yīng)運而生。

高效液相色譜因其出色的分離性能被廣泛的用于復雜樣品的分析[1]。其利用蛋白質(zhì)與固定相之間的作用力使蛋白質(zhì)得到分離，不同類型的固定相與蛋白質(zhì)之間的相互作用是不同的，因此分離純化效果也有所不同。傳統(tǒng)的色譜固定相常為單一分離機理，然而在實際樣品的分離純化過程中，單一的色譜模式已經(jīng)無法滿足現(xiàn)今復雜樣品分離分析的要求。而混合模式色譜（Mixed-mode Chromatography，MMC）與單一色譜模式相比體現(xiàn)出的獨特優(yōu)勢，引發(fā)了研究者極大的興趣。

MMC起源于“detergent”型疏水層析[2]，最初只是研究介質(zhì)中疏水和靜電作用共同存在時對層析過程的影響。在20世紀80年代，Regnier[2]等首先提出了幾種可以同時提供陰離子交換和疏水相互作用的MMC填料，并成功的應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化。從此，MMC技術(shù)迅速發(fā)展。

目前已有多篇綜述類文章涉及MMC在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用，其重點介紹了MMC用于分離純化蛋白質(zhì)的配基的選擇原理和設(shè)計原則以及MMC在抗體和某些特殊蛋白分離中的應(yīng)用[3-5]。近年來該項技術(shù)發(fā)展迅速，并且涌現(xiàn)了更多的應(yīng)用領(lǐng)域，為了進一步對該項技術(shù)進行總結(jié)，本文將主要介紹混合模式色譜的分離機理、基質(zhì)、配基以及不同組合模式的混合模式色譜的最新進展，并對MMC在抗體和病毒類疫苗中的應(yīng)用前景進行展望。

1.混合模式色譜技術(shù)

MMC技術(shù)是指利用固定相與溶質(zhì)之間存在著的多種相互作用力，使溶質(zhì)實現(xiàn)更好分離的色譜技術(shù)[4]。與其他類型的色譜法相比，MMC技術(shù)的優(yōu)勢在于可以使目標物在較寬的離子強度范圍內(nèi)被吸附，通過電荷的排斥以及獨特的選擇性，可以減少許多預(yù)處理步驟，并且可以高效快速地結(jié)合目標物，又能簡捷地實現(xiàn)目標物的解吸，從而減少分離時間，降低成本[5]。此外，相較于傳統(tǒng)的單一作用機理的色譜模式，MMC具有更好的選擇性[6]和更高的負載量[7]，是對傳統(tǒng)的單模式色譜很好的補充。

2.混合模式色譜固定相

MMC固定相通常由基質(zhì)和功能團兩部分構(gòu)成，其中，MMC介質(zhì)的性能是決定蛋白能否分離成功的關(guān)鍵。其影響因素主要包括：形狀、粒徑及其分布、孔徑及其分布、配基密度等參數(shù)。從一定意義上說，MMC介質(zhì)是整個層析過程的核心。

(1)混合模式色譜介質(zhì)基質(zhì)

對于MMC介質(zhì)來說，選擇合適的基質(zhì)對于提高蛋白質(zhì)的分離純化效率具有重要意義。為了更好地使目標物與介質(zhì)發(fā)生作用，理想的基質(zhì)需要具備的基本條件[8]：①良好的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；②粒徑均一；③良好的機械強度；④良好的化學穩(wěn)定性；⑤可提供大量的吸附位點；⑥廉價易得。目前，混合模式固定相所用基質(zhì)材料主要分為以下幾種類型。

①天然多糖類

以瓊脂糖為代表的天然多糖類介質(zhì)，其特點主要是其表面含有豐富的羥基，便于化學衍生；瓊脂糖由于具有開孔性基質(zhì)骨架，生物分子可以自由進入；親水性強，洗脫條件溫和，不易對生物分子造成破壞失活；由于是多孔結(jié)構(gòu)，比表面積大，蛋白動態(tài)結(jié)合載量高。雖然瓊脂糖的生物相容性好，但機械強度低，為了提高其強度，可以對瓊脂糖微球進行交聯(lián)[8-9]。Cytiva公司開發(fā)的Capto Adhere是典型的疏水/強陰離子交換層析介質(zhì)，其基質(zhì)是由高度交聯(lián)的瓊脂糖制成，配基為N-芐基-N-甲基乙醇胺。該介質(zhì)對于抗體具有良好的吸附能力，在高流速下仍然保持較好的傳質(zhì)性能[6]。

②無機物類

以多孔硅膠為代表的無機物類介質(zhì)，除了具有很強的剛性，能夠承受很高的壓力之外，其表面還富含硅羥基，可以在其表面進行化學改性，但硅膠在堿性條件下不穩(wěn)定，其適用pH范圍較窄，該特點限制了其在蛋白分離純化領(lǐng)域中的應(yīng)用。為改善這一問題，目前主要通過對表面硅羥基化學修飾進行硅膠改性，以高反應(yīng)活性的烷基化試劑將殘余硅羥基反應(yīng)掉，從而消除部分影響，提高蛋白質(zhì)的回收率[10]。如郭志謀[11]等人使用硅膠基質(zhì)合成了以辛基和氨基為配基的混合模式反相/陰離子交換固定相C8PN，成功的分離了人生長激素降解物。

③合成高聚物類

人工合成高聚物微球按聚合物基質(zhì)種類不同，主要分為聚丙烯酰胺類、聚丙烯酸酯類、聚苯乙烯類等[12]。當前用于MMC填料的高聚物類基質(zhì)主要以聚丙烯酸酯類為主，該類介質(zhì)同時具有雙鍵與環(huán)氧基兩種功能基團，雙鍵可以實現(xiàn)與其他功能單體的接枝化，另外，由于環(huán)氧基的反應(yīng)活性高，可以在較溫和的條件下實現(xiàn)基質(zhì)的改性，獲得具有多功能性的介質(zhì)。楊帆[13]等以甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯（GMA）為單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，采用一步種子溶脹聚合法制備聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯（PGMA/EDMA）聚合物微球。并以PGMA/EDMA聚合物微球為基質(zhì)，采用“巰基-烯烴”點擊反應(yīng)，將馬來酸酐鍵合到微球表面，制備成陽離子交換/疏水作用型MMC介質(zhì)，實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)樣品的有效分離。

以高聚物為基質(zhì)的MMC介質(zhì)，不僅克服了多糖類介質(zhì)易受微生物侵蝕，機械強度弱的不足，又能實現(xiàn)良好的親水性和生物相容性，適用于蛋白質(zhì)的分離純化。此外，聚合物表面具有豐富的可衍生基團，容易進行化學改性，是理想的MMC填料之一。

(2)混合模式色譜介質(zhì)配基

混合模式配基的化學結(jié)構(gòu)決定了MMC的作用類型，MMC配基通常具有兩種或者兩種以上的作用模式，例如離子交換、疏水相互作用、氫鍵作用等，且MMC配基密度較高，具有良好的耐鹽吸附性能[14]。因此，在較寬的鹽濃度范圍內(nèi)，MMC介質(zhì)均能夠保持較高的吸附容量，可以減少對料液的預(yù)處理，比如稀釋、過濾、脫鹽等，從而提高分離效率。

高性能的MMC配基根據(jù)其用途不同可進行按需設(shè)計，并通過實驗來優(yōu)化組合。通過改變流動相的組成和性質(zhì)，進而表現(xiàn)出不同的分離模式，很多在單一色譜模式用到的功能基團都可作為MMC中的相應(yīng)基團來進行恰當組合。表1列舉了目前典型的用于蛋白質(zhì)分離純化的混合模式配基，并詳細介紹了相應(yīng)的配基結(jié)構(gòu)和功能位點，這些配基通常是由脂肪族或芳香族基團作為疏水部分；氨基，羧基或磺酸基團作為離子交換部分；雜環(huán)基團也因其獨特的疏水性和解離特性而成為良好的候選配基。在配基的篩選和設(shè)計時應(yīng)考慮這些原則，確定配基的性能，同時要求配基的分子結(jié)構(gòu)相對簡單，容易合成和制備，且價格較低。通過分子動力學模擬，可在微觀層面對配體與蛋白質(zhì)之間的相互作用進行研究，可以更好的了解分離機理，從而設(shè)計和篩選合適的配基[15]。

表1 典型混合模式配基

(3)混合模式色譜種類

目前應(yīng)用于蛋白分離純化的混合模式色譜類型主要有：離子交換/疏水模式（IEC/HIC）、反相色譜/離子交換模式（RPLC/IEC）、體積排阻/離子交換/疏水模式（SEC/IEC/HIC）等。這些不同類型的混合模式色譜具有良好的分離性能，顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。

①離子交換/疏水模式（IEC/HIC）

IEC和HIC是分離純化生物大分子最常用的色譜模式，主要是因為其流動相大多為鹽水體系，與生理條件較為接近，能更好地保持生物大分子的活性，因此，許多用于活性蛋白純化的MMC配基是基于這兩種作用類型設(shè)計的[4]。當溶液離子強度較低時，靜電力起主要作用，目標蛋白與吸附劑之間發(fā)生離子交換實現(xiàn)吸附，隨著離子強度的增大，靜電作用逐漸被屏蔽，疏水作用增強，目標蛋白通過疏水結(jié)合被吸附。對目標蛋白的洗脫，則可通過調(diào)整目標蛋白與吸附劑之間的帶電性，依靠靜電排斥來實現(xiàn)。

根據(jù)介質(zhì)所帶電荷的不同，該類型MMC介質(zhì)可以分為陽離子交換/疏水層析介質(zhì)和陰離子交換/疏水層析介質(zhì)。趙開樓[26]等以硅膠為基質(zhì)，以磺酸基和苯甲基為配基合成了陽離子交換/疏水相互作用MMC固定相，該介質(zhì)可分別用于在IEC和HIC模式下分離蛋白質(zhì)，高鹽濃度時可體現(xiàn)出HIC的分離機理，低鹽濃度時可體現(xiàn)出IEC的分離機理，實驗表明，模型蛋白在兩種模式下的質(zhì)量與活性回收率均高于96%，同時，測試了其在復雜樣品中分離蛋白質(zhì)的能力，成功地從雞蛋清中分離出包括卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶、卵清蛋白在內(nèi)的多種活性蛋白。

于嫄[27]等通過活性聚合方法，制備了以GMA與EDMA共聚的超大孔聚合物微球（PGMA-EDMA），以該聚合物材料為基質(zhì)，利用聚乙烯亞胺（PEI）和丁基縮水甘油醚（BGE）先后衍生微球的表面，制備成兼具陰離子交換與疏水相互作用的MMC介質(zhì)。蛋白載量最高可達40mg/ml，回收率高于90%。該介質(zhì)在大于2000cm/h的流速下依然能保持2MPa左右的柱背壓，在高流速下實現(xiàn)了對人血清中抗體的純化。

最常見的IEC/HIC型MMC介質(zhì)同時兼有疏水和靜電作用。MMC介質(zhì)偶聯(lián)離子交換基團的主要目的是促進洗脫，但在常規(guī)的吸附條件下，這些基團始終帶有電荷，而配基持久帶電會導致料液中的某些雜質(zhì)與介質(zhì)發(fā)生非專一的靜電吸附，從而干擾目標產(chǎn)物的純化[30]。為了解決這一問題，Burton[29]等提出了疏水電荷誘導色譜（HCIC）的概念。作為IEC/HIC型MMC的一種特殊形式，吸附劑的配基在不同條件下呈現(xiàn)不同的帶電形態(tài)。蛋白的吸附過程只依賴疏水作用，通過調(diào)節(jié)洗脫液pH值，改變介質(zhì)的帶電性質(zhì)，在溫和的環(huán)境下，通過靜電排斥就可以實現(xiàn)蛋白的分離。

目前典型的HCIC商品化介質(zhì)是Pall公司生產(chǎn)的MEP HyperCel，它以4-巰基乙基吡啶（MEP）為配基，以纖維素材料為基質(zhì)，其結(jié)構(gòu)含有硫原子、吡啶雜環(huán)和疏水鏈，在中性條件下可以通過疏水作用和親硫作用對蛋白質(zhì)產(chǎn)生吸附[30]。

②反相色譜/離子交換模式（RPLC/IEC）

疏水和靜電作用力是具有高度正交性的兩種作用力，RPLC的分離原理是基于溶質(zhì)與固定相間的疏水作用力，這種色譜較適用于分離非極性或極性較弱的溶質(zhì)。若是給配基中引入離子交換基團，利用其靜電作用則可以發(fā)揮離子交換色譜的優(yōu)勢，固定相能同時對極性或電離性的溶質(zhì)有更充分的保留能力，RPLC/IEC就是利用這一特點，實現(xiàn)了單一反相模式下無法達到的分離效果[34]。

白泉[32]等通過非均相合成法將N-甲基咪唑鍵合到硅膠表面，制備了RPLC/IEC型MMC介質(zhì)，由于咪唑環(huán)具有大П鍵，可利用其疏水性表現(xiàn)出反相色譜的特點，并且，由于引入了正電荷，固定相能表現(xiàn)出強陰離子交換的作用。通過對蛋白質(zhì)在十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（ODS）和MMC固定相上色譜行為的比較，發(fā)現(xiàn)在該模式下，堿性蛋白由于存在靜電斥力而不保留，而對酸性蛋白卻表現(xiàn)出了較好的選擇性，且分離效果優(yōu)于ODS柱。該介質(zhì)可實現(xiàn)對蛋清中溶菌酶、卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的分離純化。

③體積排阻/離子交換/疏水模式（SEC/IEC/HIC）

理想的體積排阻色譜法主要根據(jù)溶質(zhì)分子的體積來分離目標物，但在實際分離過程中，溶質(zhì)的保留不可避免地會受到靜電作用和疏水作用的影響[36]。

該類型混合模式介質(zhì)多見報道的是Cytiva的Capto core系列，包括Capto core 700和Capto core 400兩種介質(zhì)。該系列介質(zhì)采用核殼結(jié)構(gòu)微球技術(shù)，微球殼層孔徑小于核心孔徑，同時殼層為惰性層而其核心被配基激活，惰性殼層可阻止大分子進入殼層孔道（Capto core 700排阻相對分子質(zhì)量為700kDa，Capto core 400排阻相對分子質(zhì)量為400kDa），以辛胺為配基的核心部分可使其具有離子交換和疏水相互作用復合模式，該介質(zhì)實現(xiàn)了尺寸排阻和吸附層析的雙重功能。較大分子在流穿部分被收集，而較小的雜質(zhì)會與微球內(nèi)部配基結(jié)合。微球的MMC配基，可使介質(zhì)在較寬范圍的pH值和鹽濃度中與大多數(shù)雜質(zhì)進行強有力的結(jié)合。用NaOH或其它溶劑進行洗脫，可將結(jié)合的雜質(zhì)從微球上除去。相較于單一體積排阻模式，其流速更高，上樣量可以提高10-100倍，操作靈活，適合工藝放大，主要應(yīng)用于病毒等大分子的分離 純化[37]。

3.MMC在蛋白分離純化中的應(yīng)用

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷進步，利用細胞作為生物工廠來獲取生物活性蛋白已成為發(fā)展的主要趨勢。通過微生物發(fā)酵或細胞培養(yǎng)表達是獲取蛋白質(zhì)的第一步，而這一過程常伴有內(nèi)毒素、聚集體和宿主細胞蛋白等多種雜質(zhì)成分[38]。MMC技術(shù)由于其獨特的分離機制和簡便的操作步驟，在該領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注，并成功應(yīng)用于抗體、疫苗等藥用蛋白的分離純化。

(1)MMC在抗體分離純化中的應(yīng)用

自1986年美國食品和藥物管理局（US FDA）批準首個抗體藥物以來，抗體工程技術(shù)在過去30多年中取得了跨越式的發(fā)展。作為一種特殊的蛋白質(zhì)分子，抗體廣泛應(yīng)用于生物科學研究、生物科技和醫(yī)療領(lǐng)域，目前的抗體藥物因其高度的特異性，副作用越來越小。因此，治療性抗體已成為近年來新藥研發(fā)的主要方向之一。截至2019年12月，美國FDA已批準了79種治療性抗體的生產(chǎn)，但仍有上百種抗體藥物在開 發(fā)中[36]。

經(jīng)典的抗體分離工藝可分為捕獲階段和精純階段，其中抗體捕獲階段通常使用Protein A親和層析，其對Ig G具有高度的特異性，一步純化可得到90%以上純度。但是，Protein A親和層析也存在著諸如價格高昂，洗脫條件苛刻，只能與Fc片段相結(jié)合等問題[37]，因此，開發(fā)具有與Protein A同等優(yōu)勢的層析工藝成為當下的研究熱點之一。Follman等分別利用經(jīng)典的抗體純化工藝和使用包括MMC介質(zhì)（IEC/HIC）在內(nèi)的無Protein A親和步驟的多步純化工藝，對中國倉鼠卵巢細胞（CHO）表達的抗體進行了分離純化，結(jié)果顯示，在抗體回收率和純度方面，不同類型介質(zhì)的組合可以像傳統(tǒng)方法一樣有效，表明了低成本條件下MMC介質(zhì)應(yīng)用于抗體分離純化的可能性。

Maria[38]等開發(fā)了一種從CHO細胞培養(yǎng)液中純化單克隆抗體（mAb）的創(chuàng)新工藝：首先利用MMC介質(zhì)HEA HyperCel捕獲，Capto MMC進行中間純化，最后使用Sartobind Q陰離子交換介質(zhì)精制。該方法中兩個混合模式步驟對單抗有較好的選擇性，通過這些步驟除去了上清液中的主要雜質(zhì)。最后，使用陰離子交換膜對殘余的DNA和宿主細胞蛋白等雜質(zhì)蛋白進行了去除。該工藝的總產(chǎn)率和單抗的純度分別為88%和99.9%，雜質(zhì)含量符合治療型抗體的要求，與基于使用蛋白A捕獲步驟的常規(guī)方法相當。

此外，對于某些基因工程抗體、抗體片段或者親和力較弱的鼠抗、兔抗等Protein A分離性能較差的抗體，MMC也表現(xiàn)出了良好的分離效果。如林東強等以2-巰基-1-甲基咪唑為配基，將其與二乙烯基砜活化的瓊脂糖基質(zhì)偶聯(lián)，制備了HCIC型混合模式層析介質(zhì)，對鵝血漿進行預(yù)處理后，利用該HCIC色譜材料對血漿中的鵝免疫球蛋白IgY(ΔFc)進行分離。并且研究了在不同pH條件下IgY(ΔFc)的吸附情況，最終純度為98.6%，產(chǎn)率為85.0%。Bangaru等利用MMC介質(zhì)Capto MMC對大腸桿菌表達的Fab片段進行了分離，其總回收率達到了97%，純度為73%。除此之外，該介質(zhì)也被用于對鼠單抗和兔單抗的分離純化，Arakawa等使用Capto MMC對人源胚胎腎細胞（HEK）表達的兔單抗和鼠單抗進行了分離純化，在中性條件下，使用精氨酸協(xié)助洗脫，單抗收率分別為80%和90%。

MMC廣泛應(yīng)用于抗體的分離純化，在此過程中，體現(xiàn)了其較好的選擇性，具有載量高、操作簡單、洗脫條件溫和等優(yōu)點[39]。但不可否認的是，MMC選擇性與Protein A親和層析相比仍有一定的差距，對于抗體與MMC之間結(jié)合的作用機理以及影響因素等，還不夠明了。因此，如何提高MMC對于抗體的選擇性，合理的設(shè)計分離過程，仍是目前的熱點問題。

(2)MMC在病毒類疫苗分離純化中的應(yīng)用

迄今為止，由病毒引起的傳染病仍然威脅著人類和動物的生命健康，疫苗作為預(yù)防和阻擊病毒的有效方法，一時間再次成為全球科研人員關(guān)注的焦點。病毒類疫苗主要包括減毒病毒疫苗、滅活病毒疫苗、類病毒顆粒（VLP）等類型。當前，MMC技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病毒或類病毒顆粒的分離純化中，在規(guī)?；a(chǎn)高純度病毒原種和生產(chǎn)用于基因治療的病毒載體方面擁有巨大潛力[40]。

與分離純化抗體不同的是，病毒類疫苗分子量高，體積較大，在分離純化過程中，難以進入介質(zhì)內(nèi)部，造成載量普遍較低，并且在狹窄的介質(zhì)孔徑內(nèi)部易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，造成其變性失活。目前，在病毒類疫苗的分離純化中應(yīng)用較廣的為體積排阻型層析介質(zhì)，該類型介質(zhì)孔徑在一定范圍內(nèi)分布，雜質(zhì)蛋白等小分子物質(zhì)進入孔內(nèi)部，保留時間較長，而大尺寸病毒分子則被孔排除在外而直接流穿，利用該類型介質(zhì)可以簡便實現(xiàn)病毒類疫苗的分離純化，并且操作條件溫和，對疫苗的生物活性影響較小[41]，但是，傳統(tǒng)的用于純化疫苗的常規(guī)分子篩層析介質(zhì)由于上樣量小和流速低的限制，產(chǎn)量和收率相對較低。MMC型介質(zhì)Capto core 700，其上樣量高、處理量大、縮短了工藝時間，尤其是在大分子蛋白的分離純化方面，該介質(zhì)以其獨特的分離性能廣受好評。Muddle等[42]通過以Capto core 700介質(zhì)為核心的多步純化方法，對減毒呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗進行純化。該純化過程首先進行了澄清、濃縮以及用核酸內(nèi)切酶進行降解等前處理步驟，然后使用MMC介質(zhì)進行分離純化，最后使用中空纖維切向流過濾技術(shù)進行病毒濃縮、去雜。結(jié)果表明Capto core 700在純化該病毒時，去除了大約99%的殘余Vero細胞宿主蛋白和約95%的殘余Vero細胞DNA，病毒滴度沒有明顯下降，并且在大鼠體內(nèi)進行了測試，所得疫苗顯示出了針對RSV攻擊的免疫原性和保護性。

還有許多學者設(shè)計了MMC與其他單模式色譜技術(shù)相結(jié)合的方法對整個病毒或VLP進行純化，如Zhao等設(shè)計了以混合模式層析介質(zhì)為主的多步層析純化工藝，純化由昆蟲細胞培養(yǎng)的人腸道病毒71型（EV 71）類病毒顆粒。該工藝首先利用Capto core 700對EV 71型VLP樣品進行初步純化，目標物通過流穿模式被純化分離。為避免初步純化中的高鹽影響，將初步分離得到的含有EV 71型VLP的流穿液通過Capto Adhere層析柱進行中度純化，除了離子交換作用外，該介質(zhì)還與目標生物分子之間存在疏水和氫鍵相互作用，有效地去除了宿主細胞蛋白和宿主細胞DNA，經(jīng)洗脫后大部分雜質(zhì)蛋白被去除。最后選用弱疏水性色譜層析介質(zhì)Capto butyl對EV 71型VLP進行精度純化，經(jīng)過濾器濾菌過濾和ELISA試劑盒檢測后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用多步色譜層析方法對EV71型VLP 純化的回收率為31.52%，其純度可達95%以上。

當前MMC介質(zhì)在分離純化病毒類疫苗中的應(yīng)用日益廣泛，顯著提升了分離效率，降低了操作成本。但在實際應(yīng)用過程中出現(xiàn)了回收率較低且純度不高的問題，需要根據(jù)不同的病毒選擇合適的分離介質(zhì)，設(shè)計合理的純化工藝，同時，目前適用于病毒體系的MMC介質(zhì)種類較少，需要研發(fā)新型MMC介質(zhì)，以滿足不同尺寸病毒類疫苗分離純化的需求。

4.展望

最大限度地減少下游分離純化步驟，提高單元操作效率是實現(xiàn)生物產(chǎn)品規(guī)模制備的主要研究方向。采用常規(guī)單模式色譜法分離時，常需要對樣品進行前處理，包括稀釋、脫鹽等操作，這些都會明顯提高生產(chǎn)成本。對于解決上述問題，MMC技術(shù)體現(xiàn)出很大的優(yōu)勢。目前，大多數(shù)學者對于MMC技術(shù)的探索主要集中于應(yīng)用研究，對于蛋白質(zhì)與MMC介質(zhì)之間的作用機理以及影響因素等研究較少。此外，在層析過程中，由于多種作用力共同存在，相互影響，也會造成MMC介質(zhì)性能的變化。因此，利用先進的分子模擬技術(shù)，加強對其作用機理的探究，將是解決問題的關(guān)鍵。隨著MMC技術(shù)的不斷發(fā)展，相信在不久的將來，其應(yīng)用領(lǐng)域必將更為廣闊。