恒溫隔絕式熒光PCR 檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸方法的建立

陳雪蓉，徐 林，王遠(yuǎn)微，湯 承，岳 華

（1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041；2.甘孜州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川康定 626000）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，對(duì)生豬致病率及致死率高[1]。該病2018 年傳入我國(guó)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失[2-3]。ASF 的臨床癥狀及病理變化與古典豬瘟（classical swine fever，CSF）和豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）相似，只能通過(guò)實(shí)驗(yàn)室才能確診。目前尚無(wú)有效預(yù)防ASF 的疫苗，及時(shí)準(zhǔn)確的診斷對(duì)ASF 防控至關(guān)重要[4]。PCR 現(xiàn)已廣泛用于多種動(dòng)物病原的檢測(cè)[5]。我國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部推薦使用傳統(tǒng)熒光定量PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行ASF 診斷，但該方法需要復(fù)雜的儀器，耗時(shí)較長(zhǎng)。恒溫隔絕式熒光PCR（insulated isothermal PCR，iiPCR）是一種基于Rayleigh-Benard 對(duì)流原理設(shè)計(jì)的新型熒光PCR 技術(shù)，在配好檢測(cè)體系后僅需將毛細(xì)管放入儀器內(nèi)，一鍵啟動(dòng)，無(wú)需設(shè)置擴(kuò)增程序和分析擴(kuò)增曲線，可自動(dòng)在顯示屏上顯示檢測(cè)結(jié)果。該方法對(duì)于DNA 和RNA 檢測(cè)都具有極好的靈敏度和特異性[6]。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR、瓊脂糖凝膠電泳鑒定的傳統(tǒng)PCR 或熱循環(huán)式PCR 技術(shù)不同，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了核酸分析儀的小型化，讓PCR 檢測(cè)走出實(shí)驗(yàn)室，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。目前，iiPCR 檢測(cè)技術(shù)已被廣泛用于多種動(dòng)物疫病的快速檢測(cè)[7-13]。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸和臨床樣本

豬細(xì)小病毒（PPV）WH-1株、豬瘟病毒（CSFV）兔化弱毒株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）GDr 株、豬偽狂犬病病毒（PRV）Bartha-k61 株、豬乙腦病毒（JEV）SA14-14-2 株，均購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬流行性腹瀉病毒（PEDV）分離株swun620、ASFV 核酸，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，用于特異性評(píng)價(jià)。

51 份ASFV 陽(yáng)性樣本核酸及49 份ASFV 陰性樣本，均由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室（四川省ASF 定點(diǎn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室）提供，用于檢測(cè)方法的比較。

1.2 主要試劑

pMD19-T 克隆載體、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、DL 500 DNA Marker、TPremix ExTaq（Probe qPCR Mix），購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒，購(gòu)于OMEGA BIOTEK 公司；PetNAD 核酸萃取試劑盒，由金瑞鴻捷（廈門(mén)）生物科技有限公司生產(chǎn)提供。

1.3 主要儀器

移液器，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司；核酸蛋白分析儀，購(gòu)自日本島津公司；電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自上海天能科技有限公司；熒光定量PCR儀（Quant Studio 3），購(gòu)自杭州博日公司；小型離心機(jī)（cubee?）、POCKIT Micro Plus 核酸八通道分析儀，購(gòu)自廈門(mén)金瑞鴻捷公司。

1.4 引物合成

采用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部172 號(hào)公告推薦的ASFV 熒光定量PCR 檢測(cè)方法的引物（F：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'；R：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'）和探針（5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'）。擴(kuò)增P72基因目的片段，長(zhǎng)度為63 bp。引物和探針，均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 核酸提取

用于特異性檢驗(yàn)的毒株，均采用酚-氯仿-異戊醇法和Trizol 法提取DNA 和RNA。DNA 于-20 ℃保存?zhèn)溆茫琑NA反轉(zhuǎn)錄成cDNA保存于-20 ℃。

1.6 ASFV 標(biāo)準(zhǔn)樣品準(zhǔn)備

采用1.4 中的引物對(duì)，以ASFV 陽(yáng)性的DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶用Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒回收并連接到pMD19-T 載體上，隨后轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒作為本研究的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，用核酸蛋白分析儀測(cè)定其質(zhì)量濃度（μg/mL），按照下述公式換算成copies/μL。

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品濃度（copies/μL）=陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度×10-9×6.02×1023/（660×質(zhì)?？傞L(zhǎng)度）。

1.7 反應(yīng)體系優(yōu)化

采用50.00 μL 反應(yīng)體系，對(duì)體系中的上下游引 物濃 度10 μmol/μL（0.50～5.00 μL）、探針 濃度10 μmol/μL（0.05～0.50 μL）、Taq預(yù)混酶5 U/μL（22.00～28.00 μL）進(jìn)行優(yōu)化。以PCR 檢測(cè)前讀取的熒光值（A520）與檢測(cè)后讀取的熒光值（B520）的比值R1 最大，為最佳體系的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.8 特異性評(píng)價(jià)

用本研究建立的檢測(cè)ASFV 核酸的 iiPCR 方法，對(duì)PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PEDV的核酸進(jìn)行檢測(cè)，以ASFV 核酸作為陽(yáng)性對(duì)照，去離子水作為陰性對(duì)照，對(duì)陽(yáng)性核酸擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，以評(píng)價(jià)ASFV iiPCR方法的特異性。

1.9 靈敏度測(cè)定

用本研究建立的檢測(cè)ASFV 核酸的 iiPCR 方法，對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋?zhuān)?0-1～10-14）后進(jìn)行檢測(cè)，以去離子水作為陰性對(duì)照，測(cè)定本研究建立的iiPCR 方法的檢測(cè)下限。

1.10 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

用本研究建立的 iiPCR 方法，對(duì)6 個(gè)稀釋度的ASFV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（10-6～10-11）進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，評(píng)價(jià)其批內(nèi)重復(fù)性；同時(shí)以這些陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每間隔1 d，進(jìn)行3 次獨(dú)立檢測(cè)，檢測(cè)其批間重復(fù)性。

1.11 與傳統(tǒng)熒光定量PCR 方法比較

采用本研究建立的iiPCR 方法和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部172 號(hào)公告推薦的熒光定量PCR 方法，同時(shí)對(duì)51份ASFV 陽(yáng)性樣本核酸及49 份ASFV 陰性樣本進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的檢出情況。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系優(yōu)化

本研究建立的檢測(cè)ASFV 的 iiPCR 方法的優(yōu)化反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 優(yōu)化的ASFV iiPCR 反應(yīng)體系

2.2 特異性

用本研究建立的檢測(cè)ASFV 的iiPCR 方法，從ASFV 陽(yáng)性樣本中擴(kuò)增目的片段，測(cè)序結(jié)果證明目的片段為63 bp，是ASFVP72基因的特異片段，而 對(duì)PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PEDV的核酸樣本擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，表明建立的ASFV iiPCR 檢測(cè)方法特異性良好（圖1）。

2.3 檢測(cè)限

用核酸蛋白分析儀測(cè)定ASFV 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為176 μg/mL，代入1.6 的公式換算核酸濃度為2.55×1012copies/μL。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?.55×1011～2.55×100copies/μL）后，iiPCR 方法靈敏度檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法對(duì)ASFV 核酸最低檢測(cè)限為2.55 copies/μL（圖2-A），與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的熒光定量PCR 方法靈敏度檢測(cè)下限一致（圖2-B），說(shuō)明本研究建立的方法具有較好的靈敏度。

2.4 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。該方法的批內(nèi)變異系數(shù)為0.61%～1.79%，批間變異系數(shù)為0.82%～1.86%。對(duì)6 個(gè)濃度陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的變異系數(shù)均小于2%，表明建立的ASFV iiPCR 方法穩(wěn)定性好。

表2 iiPCR 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

2.5 與傳統(tǒng)熒光定量PCR 的符合率

用本研究建立的iiPCR 與傳統(tǒng)熒光PCR 檢測(cè)的符合率見(jiàn)表3。計(jì)算公式：符合率=TN/（TN+FP）×100%（TN 為真陰性，F(xiàn)P 為假陽(yáng)性）。從表3 可見(jiàn)，本研究建立的iiPCR 方法和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的熒光定量PCR 方法，對(duì)ASFV 陽(yáng)性樣本和陰性樣本中核酸檢出結(jié)果一一對(duì)應(yīng)，完全一致，表明本研究建立的檢測(cè)ASFV 的iiPCR 方法準(zhǔn)確可靠。

表3 兩種檢測(cè)方法對(duì)ASFV 的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 實(shí)現(xiàn)了ASFV 的現(xiàn)場(chǎng)診斷

傳統(tǒng)的熒光定量PCR 測(cè)定需要大型、復(fù)雜、昂貴的儀器，這些儀器只能存放在實(shí)驗(yàn)室中，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)?，F(xiàn)場(chǎng)診斷技術(shù)可以解決這些問(wèn)題，并可避免運(yùn)輸傳染性材料導(dǎo)致的一些潛在危險(xiǎn)[14]。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一些便攜式分子檢測(cè)方法，用于快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)ASFV[15-20]。但國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)有ASFV iiPCR 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法的報(bào)道?；趇iPCR 原理研發(fā)的POCKIT? 智能型核酸分析儀，小巧便攜，自帶電源，PCR 檢測(cè)一鍵操作，檢測(cè)過(guò)程僅需42 min，且因檢測(cè)過(guò)程在閉管內(nèi)一次完成，避免氣溶膠的產(chǎn)生，已被廣泛運(yùn)用于牛輪狀病毒[9]、牛傳染性鼻氣管炎病毒[11]、豬輪狀病毒[10]、PEDV[21]、蝦白斑病病毒[22-23]、馬流感病毒[24]、犬瘟熱病毒[25]等動(dòng)物疫病病原的快速檢測(cè)，其中采用該技術(shù)建立的對(duì)蝦白斑病病毒檢測(cè)方法已得到OIE 認(rèn)證[22-23]。本研究建立的iiPCR 方法配合現(xiàn)場(chǎng)使用的核酸提取試劑盒[21]即可實(shí)現(xiàn)ASFV 檢測(cè)的現(xiàn)場(chǎng)化，具有很大的應(yīng)用潛力。

3.2 實(shí)現(xiàn)了ASFV 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化

PCR 是目前我國(guó)ASFV 檢測(cè)的主要手段。關(guān)于該病毒的PCR 檢測(cè)方法很多，如普通PCR、熒光PCR 等，但這些PCR 檢測(cè)方法均需專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室，操作過(guò)程較為繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)[26-28]。且不同方法因檢測(cè)靶點(diǎn)、反應(yīng)體系和條件的不同，導(dǎo)致的特異性、通用性和敏感度等指標(biāo)有很大差異，對(duì)檢測(cè)結(jié)果具有很大影響。面對(duì)ASF 等需要封鎖、撲殺的一類(lèi)動(dòng)物疫病，診斷方法的標(biāo)準(zhǔn)化至關(guān)重要。本研究建立的ASFV iiPCR 檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限以及對(duì)ASFV 陰陽(yáng)性樣本的檢測(cè)結(jié)果，均與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部172 號(hào)公告推薦的熒光定量PCR 方法一致，說(shuō)明本方法能替代推薦的熒光定量PCR 方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣本的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，且速度更快，操作更簡(jiǎn)捷，為ASF 診斷提供了可靠的現(xiàn)場(chǎng)診斷新方法。