新疆和靜縣羊源多殺性巴氏桿菌分離鑒定及耐藥性分析

張繼紅

（新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830011）

近年來隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，牛、羊、鹿等反芻動物的養(yǎng)殖數(shù)量呈現(xiàn)逐年增高的趨勢，其中羊養(yǎng)殖成為家畜養(yǎng)殖業(yè)的主要組成部分[1]，開始從完全放牧模式向規(guī)模化舍飼模式發(fā)展[2-3]。許多地區(qū)羊舍環(huán)境空間不足或受限制，導致羊飼養(yǎng)密度較大、羊舍衛(wèi)生條件較差，容易造成羊呼吸疾病的發(fā)生和流行[4]。多殺性巴氏桿菌是臨床中常見的典型人獸共患病病原菌之一，可以引起羊、牛、馬、豬、雞、鴨等多種動物和人發(fā)病，其感染不同種類動物引起的疫病名稱有所不同，如禽霍亂、豬肺疫、牛出血性敗血癥、兔出血性敗血癥等[5-6]。多殺性巴氏桿菌可引起感染動物的急性敗血癥癥狀或慢性癥狀，其中急性癥狀可導致死亡，慢性癥狀可使動物生長、生產(chǎn)性能下降[7]。國內(nèi)相關研究表明，近幾年來多殺性巴氏桿菌對羊、牛等反芻動物產(chǎn)生的危害較嚴重，尤其是對哺乳羔羊，具有發(fā)病急和死亡率高的特點，給羊養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[8-9]。

和靜縣為新疆地區(qū)的牛羊養(yǎng)殖大縣。據(jù)和靜縣畜牧局2020 年數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全縣牛羊年末存欄超過115 萬頭（只），年出欄超過98 萬頭（只），牛羊肉類總產(chǎn)量為2.48 萬t。因此，和靜縣的羊巴氏桿菌病防控對于保障養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。為了解和靜縣羊群中多殺性巴氏桿菌的致病性及耐藥情況，2019—2021 年采集規(guī)模場及散養(yǎng)戶中患呼吸道疾病病死羊的病料樣品進行多殺性巴氏桿菌分離鑒定，并檢測其致病性及耐藥性，以期為該地區(qū)羊群巴氏桿菌病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2019—2021 年采集和靜縣規(guī)模場及散養(yǎng)戶中患呼吸道疾病羊的咽拭子、病死羊的肺臟等病料組織樣品304 份，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

營養(yǎng)肉湯、腦心浸液培養(yǎng)基（BHI，含5%胎牛血清），均購自北京陸橋生物科技有限公司；瑞士染色液，購自南京建成科技有限公司；蔗糖、盧戈氏碘液、氯化鈉，均購自寶生物工程（大連）有限公司；高速離心機（5418 小型），博科（BIOBASE）公司產(chǎn)品；高清顯微鏡（YKT-8400 型），上海永科光學儀器有限公司產(chǎn)品。細菌生化檢測試劑盒、藥敏紙片，均購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司；7%綿羊血脫纖培養(yǎng)基，由本單位動物疫病檢測實驗室自制；22～25 g 昆明系小鼠，由新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所動物疫病檢測實驗室提供。

1.3 細菌分離鑒定與培養(yǎng)

將采集的病料組織樣品處理后，接種于7%綿羊血脫纖培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～24 h；挑取單個典型的菌落接種于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～24 h；挑取單個菌落進行瑞士染色鏡檢，觀察其形態(tài)學結(jié)構(gòu)。

1.4 生化試驗鑒定

挑取腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基典型的菌落，接種于營養(yǎng)肉湯中進行純化培養(yǎng)；取純化培養(yǎng)的分離菌株，按照細菌生化檢測試劑盒說明書進行分離菌株生化鑒定。

1.5 PCR 鑒定

根據(jù)GenBank 中登錄的多殺性巴氏桿菌基因序列，設計特異性鑒定Kmt1基因的引物序列（F：5'-CGCTATTTACCCAGTG-3'；R：5'-CGTTGAACACGAAGA-3'）進行PCR 鑒定。目的基因大小為460 bp。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。用水煮法制備分離菌株DNA模板，進行PCR 檢測。PCR 產(chǎn)物送上海生工進行基因測序，測序結(jié)果與GenBank 中登錄序列進行同源性對比。判定標準：同源性≥99.0%，定義到種的水平；97.0%～99.0%，定義到屬的水平；＜97.0%，定義到科的水平。

1.6 致病性試驗

參考文獻[10]的方法，將純化培養(yǎng)的分離菌株培養(yǎng)至對數(shù)期后計數(shù)，調(diào)整菌液濃度至107～108CFU/mL，每株分離菌株腹腔注射5只小鼠，劑量為0.2 mL/只，對照組接種等量的無菌營養(yǎng)肉湯。接種12 h 后，觀察小鼠的發(fā)病及死亡情況，并對死亡小鼠進行細菌分離鑒定，并統(tǒng)計致病菌株。

1.7 耐藥性試驗

參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）2017 推薦的標準K-B 紙片法進行藥敏試驗和藥敏結(jié)果判斷，分析耐藥性。耐藥率=耐藥菌株數(shù)/試驗菌株×100%。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離鑒定與培養(yǎng)

分離菌株在7%綿羊血脫纖培養(yǎng)基平板上生長良好，不呈現(xiàn)溶血；在腦心浸液瓊脂平板上長出濕潤的灰白色水滴樣菌落，且生長良好；瑞氏染色可見橢圓形桿狀、兩極濃染、中間不著色、單個或多個散在排列的菌落，培養(yǎng)特性和細菌形態(tài)與《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》報道的多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)特性與形態(tài)學基本一致。

2.2 細菌生化鑒定

用細菌生化檢測試劑盒，對分離菌株進行生化鑒定。結(jié)果顯示，分離菌株的生化鑒定特性與多殺性巴氏桿菌相符。經(jīng)統(tǒng)計，共有124 株分離菌株被鑒定為多殺性巴氏桿菌，分離率為 40.8%。

2.3 PCR 鑒定

對分離的124 株菌株，用多殺性巴氏桿菌特異性鑒定Kmt1基因引物，均擴增出約460 bp 的目的基因條帶（圖1），測序結(jié)果與GenBank 中登錄的參考株基因序列同源性在98.9%以上，參照判定標準，可以判定為多殺性巴氏桿菌。

2.4 致病性試驗

用分離的124 株分離菌株攻毒小鼠，2～5 d 內(nèi)小鼠出現(xiàn)精神沉郁、抽搐、扎堆、采食量減少等不同臨床癥狀，個別小鼠出現(xiàn)急性死亡。剖檢死亡小鼠發(fā)現(xiàn)，肺臟、脾臟、腎臟等實質(zhì)器官腫大、出血，個別肝臟上出現(xiàn)淺白色壞死點。對照組小鼠健康。經(jīng)統(tǒng)計，分離的124 株菌株中，有87 株可引起小鼠死亡，對小鼠的致死率為40%。

2.5 耐藥性分析

耐藥分析結(jié)果（表1～2）顯示：分離的87 株致病性多殺性巴氏桿菌耐藥嚴重，對阿莫西林、多西環(huán)素、鏈霉素、氨芐西林、紅霉素、大觀霉素、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶、新霉素等9 種藥物的耐藥率為44.8%～100%，對頭孢噻呋、頭孢噻肟、恩諾沙星、替米考星、環(huán)丙沙星、多黏菌素、氟苯尼考7 種藥物的耐藥率為2.3%～36.9%；87 株致病性多殺性巴氏桿菌均呈現(xiàn)多重耐藥，其中有1 株菌株對18 種藥物全部耐藥，其他菌株主要表現(xiàn)為耐9～11 種藥物（44.8%）。

表1 耐藥性分析結(jié)果

表2 多重耐藥性統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

相關研究[10-11]表明，多殺性巴氏桿菌是臨床中常見的條件致病菌之一。正常情況下，該菌主要存在于動物的口腔、咽部黏膜中，在轉(zhuǎn)群、換料、運輸、外界條件突然改變等應激因素刺激下，均可以引起感染動物發(fā)病，導致出現(xiàn)敗血癥和呼吸系統(tǒng)急性癥狀，嚴重者可以引起急性死亡。多殺性巴氏桿菌是引起羊呼吸道疾病的主要病原菌，在羊群中的感染率和引起的死亡率均較高，給羊養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失。馬雪等[9]從表現(xiàn)病癥的薩福克羊呼吸道中分離到6 株多殺性巴氏桿菌，魏詩謠等[12]從病死羊的肺臟組織中分離到3 株D 型多殺性巴氏桿菌，本研究也從患呼吸病的羊體內(nèi)分離到87 株致病性多殺性巴氏桿菌。上述研究表明，該菌是引起羊呼吸道疾病的重要病原菌，且在羊群中廣泛流行，危害較大，應該引起注意，需采取綜合性防控措施。

巴氏桿菌病目前沒有有效疫苗預防，主要使用抗菌藥物防治。但臨床中抗菌藥物的濫用導致臨床分離菌株對常用抗菌藥物的敏感性下降，使得該病的防治形勢更為嚴峻[13-14]。因此，在臨床中應該注意抗菌藥物的合理使用。本研究發(fā)現(xiàn)，分離的87 株致病性多殺性巴氏桿菌耐藥較嚴重，且呈現(xiàn)多重耐藥，應引起重視。吳同壘等[10]報道，從河北省部分地區(qū)肉牛群中分離的多殺性巴氏桿菌對復方新諾明、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和林可霉素等藥物耐藥性較高，馬雪等[9]報道從薩?？搜蛑蟹蛛x的多殺性巴氏桿菌對磺胺類藥物產(chǎn)生了較強耐藥性，魏詩謠等[12]報道分離的3 株D 型羊源多殺性巴氏桿菌對多黏菌素B、多西環(huán)素耐藥較嚴重。因此，在臨床中防控多殺性巴氏桿菌引起的相關疾病時，應該根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選擇敏感藥物合理使用。多殺性巴氏桿菌對消毒劑抵抗力不強，因此可以結(jié)合環(huán)境消毒進行綜合防控。