上海市寵物貓杯狀病毒、皰疹病毒及流感病毒的分離與鑒定

白藝蘭，劉 健，桂亞萍，夏爐明，龔國(guó)華，朱曉英，常曉靜，陳偉鋒，鞠厚斌，王 建，趙洪進(jìn)

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

上呼吸道感染（upper respiratory tract disease，URTD）是貓常見的臨床疾病，是引起幼貓死亡的重要原因之一，通常由一種或多種病原感染引起，從而出現(xiàn)以呼吸道或眼部疾病為特征的貓呼吸道疾病癥候群[1]。引起URTD 的病原很多，但主要為貓杯狀病毒（feline calicivirus，F(xiàn)CV）、貓皰疹病毒1 型（feline herpesvirus type 1，F(xiàn)HV-1）和貓流感病毒（feline influenza virus，F(xiàn)IV）[2]。

FCV 在貓群中的感染率很高，常引起貓口腔潰瘍和上呼吸道癥狀，也可引起其他疾病，如跛行、流產(chǎn)、慢性胃腸炎、尿道感染等。該病毒既可單獨(dú)感染，也可與其他病原混合感染，嚴(yán)重危害貓及貓科動(dòng)物的健康[3]。FHV-1 是一種高度接觸性傳染病原，也可垂直傳播，引起的發(fā)病率很高，可達(dá)100%，但成年貓感染后病死率很低，幼貓感染后癥狀嚴(yán)重，病死率可達(dá)50%，未死亡的貓可終生帶毒排毒，危害很大[4]。貓及貓科動(dòng)物都對(duì)FIV十分易感，通過食入感染的動(dòng)物性食品或接觸感染的人和動(dòng)物都很容易被感染。目前在貓及貓科動(dòng)物身上已分離到多種亞型FIV，包括H1N1、H5N1、H5N6 及H7N2 等[5]。秋冬為貓呼吸道疾病高發(fā)季節(jié)，為此本研究對(duì)患有上呼吸道癥狀疾病的臨床貓病例進(jìn)行FCV、FHV-1 和FIV 的分離與鑒定，了解在該季節(jié)上海市貓上呼吸道疾病病例中FCV、FHV-1 和FIV 的感染比例，為貓上呼吸道疾病的防控和治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品及來源

2020 年11 月至2021 年3 月，以上海市中心城區(qū)寵物醫(yī)院接診的以及來自貓舍的具有上呼吸道感染癥狀的貓為研究對(duì)象，采集每只患病貓的眼結(jié)膜、口咽和鼻黏膜拭子53 份，其中寵物醫(yī)院30 份、貓舍23 份，每個(gè)病例樣品一式兩份。樣品采集好后立即送至上海獸醫(yī)疾病診斷中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離與鑒定。

1.2 主要試劑

F81 細(xì)胞（貓腎傳代細(xì)胞），由上海獸醫(yī)疾病診斷中心實(shí)驗(yàn)室保存；SPF 雞胚（批號(hào)11401000020754），購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液（批號(hào)2126865）、0.25% 的胰酶消化液（批號(hào)2042303），均購自GIBCO 公司；胎牛血清（批號(hào)2418），購自SIGMA 公司；核酸提取試劑盒（批號(hào)MDII14-01），購自Magen 公司；PrimeScriptTMRT-PCR Kit（批 號(hào)AJ62323A）、LA PCR? Kit Ver.2.1（批 號(hào)AK5301）、Prime Script? One Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）（批號(hào)AKE0559A），均購自寶生物工程（大連）公司。

1.3 病原分離、鑒定及同源性分析

1.3.1 FCV F81 細(xì)胞常規(guī)消化傳代，待長(zhǎng)成單層且貼壁率達(dá)到90%時(shí)，將細(xì)胞按照1:3 的比例消化傳代，同時(shí)將待測(cè)樣品經(jīng)過0.22 μm 濾膜過濾后同步接種到細(xì)胞中，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h 觀察細(xì)胞病變（CPE）1 次；待70%細(xì)胞出現(xiàn)CPE 時(shí)，將培養(yǎng)液凍融3 次，2 000 r/min離心5 min，收獲細(xì)胞上清；96 h 后將未出現(xiàn)CPE的細(xì)胞上清收獲，盲傳3 代，收獲第3 代細(xì)胞上清提取病毒RNA。根據(jù)文獻(xiàn)[6]合成FCVVP1基因檢測(cè)引物（上游：ATGTGCTCAACCTGCGC；下游：TCATAATTTAGTCATTGAGCTCCT），擴(kuò)增片段大小為2 007～2 010 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit 說明書進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后取5 μL RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性RT-PCR 產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用MEGA 6.0 軟件和DNAstar v7.1 軟件，對(duì)FCVVP1基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，比較其與GenBank 中參考序列核苷酸同源性差異，繪制基因進(jìn)化樹。

1.3.2 FHV-1 按照1.3.1 中的病毒分離步驟進(jìn)行病毒分離，將收獲的第3 代細(xì)胞上清提取病毒DNA。根據(jù)FHV-1gB基因保守序列（S49775.1）合成基因檢測(cè)引物（上游：GGGGTGGGTGGACGGTGAGTAA；下游：TAGGTCTCCAGGGTTCCAGTCT）。擴(kuò)增片段大小為1 798 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit 說明書進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性PCR 產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用MEGA 6.0 軟件和DNAstar v7.1 軟件，對(duì)FHV-1gB基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，比較其與GenBank 中參考序列核苷酸同源性差異。

1.3.3 FIV 將另外一份待檢樣品經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后尿囊腔接種到10 日齡SPF 雞胚中，37 ℃孵化箱中培養(yǎng)，每24 h 照胚1 次，并將死亡雞胚及時(shí)保存至4 ℃冰箱，96 h 后將所有雞胚放至4 ℃冰箱過夜，收獲雞胚尿囊液，測(cè)定其血凝性；如有血凝性則作進(jìn)一步鑒定，沒有血凝性則進(jìn)行盲傳，收獲第3 代雞胚尿囊液作進(jìn)一步鑒定；對(duì)雞胚尿囊液進(jìn)行HA 試驗(yàn)，根據(jù)文獻(xiàn)[7]合成引物對(duì)HA 和NA 編碼序列進(jìn)行測(cè)定（HA 上游：GGGGAATTTCACAACCACTCAAG；HA 下游：TTGAGTAGAAACAAGGGTGTTTC。NA 上游：AGCAAAAGCAGGAGTRAAAATGA；NA 下游：GGCAAGTAGAAACAAGGAGTT）。擴(kuò)增片段HA 為1 742 bp，NA 為1 457 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR 擴(kuò)增后經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞接種

將處理好的53 份貓眼、口、鼻拭子樣品接種F81 細(xì)胞，共有33 份樣品出現(xiàn)了CPE，細(xì)胞表現(xiàn)出聚集、圓縮、脫落、崩解等現(xiàn)象（圖1）。

2.2 FCV 分離及鑒定及VP1 基因同源性和遺傳進(jìn)化分析

2.2.1 分離及鑒定 將53 份樣品的細(xì)胞上清液進(jìn)行FCVVP1基因PCR 鑒定，發(fā)現(xiàn)共有31 份細(xì)胞上清出現(xiàn)2 010 bp 左右目的條帶（圖2），與預(yù)期片段大小相符。53 份樣品的FCV 分離率為58.49%（31/53），其中寵物醫(yī)院樣品分離率為46.67%（14/30），貓舍樣品分離率為73.91%（17/23）。

2.2.2VP1基因同源性和遺傳進(jìn)化分析 FCVVP1序列比對(duì)分析結(jié)果（表1）顯示：31 株分離株間的核苷酸同源性為75.3%～99.8%，與國(guó)內(nèi)FCV 疫苗株255 的同源性為74.8%～78.3%，與國(guó)外FCV 疫苗株F4 的同源性為73.7%～78.6%，與跛行綜合征株2280 的同源性為74.3%～79.0%，與2016 年發(fā)現(xiàn)的美國(guó)超強(qiáng)毒株VS-FCV-Ari 的同源性為73.9%～77.1%。同國(guó)際分離株相比，31 株分離株與美國(guó)3786 株的同源性較高，與美國(guó)超強(qiáng)毒株VS-FCV-Ari 的同源性最低。與國(guó)內(nèi)分離株相比，與國(guó)內(nèi)吉林株CH-JL4 的同源性最高，與湖北HB-S4 株的同源性最低，與2014 年上海SH2014 株的同源性為75.9%～80.3%。相應(yīng)的氨基酸序列分析表明，31 株分離株與255 疫苗株的同源性為85.5%～89.1%，與F4 疫苗株的同源性為83.1%～90.1%，與超強(qiáng)毒株VS-FCV-Ari 的同源性為82.3%～86.8%，與上海SH2014 株的同源性為83.7%～89.5%。FCVVP1基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果（圖3）顯示：31 個(gè)分離株總體上可以劃分為3 個(gè)分支。第一分支只包括FCV20-11 和FCV20-29，其與疫苗株、超強(qiáng)毒株和國(guó)內(nèi)外的一些分離株親緣關(guān)系較近，形成一個(gè)獨(dú)立分支，進(jìn)化關(guān)系最為復(fù)雜，來源也最為廣泛；第二分支只包含14 株分離株，遺傳進(jìn)化關(guān)系最為簡(jiǎn)單，已經(jīng)形成獨(dú)立的遺傳進(jìn)化譜系；第三分支包括15 株分離株及其他3 株國(guó)內(nèi)毒株。結(jié)果表明，F(xiàn)CV 進(jìn)化關(guān)系較為復(fù)雜，且本地分離株具有多樣性。

表1 31 株FCV 分離株與各參考毒株VP1 基因同源性比較結(jié)果 %

2.3 FHV-1 分離、鑒定及gB 基因同源性分析

2.3.1 分離與鑒定 將上述細(xì)胞上清液作為模板，進(jìn)行FHV-1gB基因PCR 檢測(cè)，結(jié)果有2 份細(xì)胞上清出現(xiàn)1 798 bp 左右目的條帶（圖4），與預(yù)期片段大小相符，F(xiàn)HV-1 的分離率為3.77%（2/53），2 份樣品均來自于寵物醫(yī)院。

2.3.2gB基因同源性分析 FHV-1gB基因序列比對(duì)分析結(jié)果（圖5）顯示，2 株分離株間的核苷酸同源性為100%，與國(guó)內(nèi)株（GD2018、CHB）、美國(guó)經(jīng)典株（C-27）、澳大利亞株（Feligen）及其他參考株的同源性均為100%。

2.4 FIV 鑒定

將53 份尿囊液進(jìn)行HA 檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，未分離到病原。將其第3 代尿囊液進(jìn)行HA 通用RT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果也均為陰性。

3 討論

近年來隨著人民生活水平的提高，貓作為伴侶動(dòng)物已逐漸成為城市生活的一部分。經(jīng)過初步統(tǒng)計(jì)，上海市家養(yǎng)寵物貓數(shù)量已達(dá)21 萬只，流浪貓數(shù)量更是達(dá)到了27 萬只。貓上呼吸道疾病在大量貓同居的環(huán)境中尤其嚴(yán)重，包括動(dòng)物收容所、貓舍和半野生動(dòng)物群落[7]。FCV 和FHV-1 被認(rèn)為是引起貓上呼吸道疾病的主要病原，常引起鼻氣管炎、結(jié)膜炎和鼻/面部潰瘍等[8]，雖然原發(fā)感染相對(duì)輕微，但繼發(fā)感染對(duì)幼貓或免疫功能低下的貓構(gòu)成較大威脅，并可能導(dǎo)致致命后果，而FIV 可能會(huì)對(duì)家養(yǎng)伴侶動(dòng)物及人類健康帶來重大影響[9]。

本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)和雞胚接種方法，對(duì)上海市秋冬季部分具有上呼吸道癥狀貓的眼、口、鼻拭子進(jìn)行FCV、FHV-1、FIV 分離鑒定，發(fā)現(xiàn)FCV分離率為58.49%（31/53），其中貓舍樣品的分離率高達(dá)73.91%（17/23），推測(cè)主要原因是貓舍為群居場(chǎng)所，貓間接觸頻繁，容易造成相互傳染，因此貓的頻繁接觸和混居是FCV 傳播和流行的重要因素。FHV-1 分離率不高，僅為3.77%（2/53）。FHV-1 是間歇排毒，并且大多數(shù)情況下潛伏在三叉神經(jīng)，所以病毒分離相對(duì)較為困難[10]。2 株分離株間的核苷酸同源性為100%，與其他參考株的同源性同樣均為100%。目前對(duì)FHV-1 分離株的研究相對(duì)較少。國(guó)內(nèi)王吉[11]等分離的5 株FCV 分離株的核苷酸與參考株同源性大于99%。同時(shí)有研究[12]表明，F(xiàn)HV-1 與其他水痘病毒的gB基因具有高度相似性。gB 蛋白作為免疫原性蛋白，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中究竟如何影響FHV-1 感染宿主及其在宿主體內(nèi)的增殖仍需進(jìn)一步研究證明。31 份FCV 陽性樣本中未同時(shí)分離得到FHV-1。雖然兩種病毒都能感染F81 細(xì)胞，但是兩者的CPE 和生長(zhǎng)曲線并不一致，可能導(dǎo)致兩者不能同時(shí)被分離到。采用雞胚接種方法未分離到FIV，可能是臨床貓F(tuán)IV 感染率較低，也可能與FIV 的一過性感染特性有關(guān)，或者是該病毒培養(yǎng)方法并不適用FIV 分離，具體原因有待進(jìn)一步研究。本研究采集臨床中具有呼吸道疾病癥狀貓的口鼻拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果為病毒核酸檢出率，不能代表貓的實(shí)際感染情況。

FCV 雖然只有1 個(gè)血清型，但抗原很容易變異。目前針對(duì)FCV 感染無特效藥，疫苗是控制該病的重要手段。在分離到FCV 的31 份臨床病例中，70.97%（22/31）的病例都免疫了進(jìn)口“妙三多”（FPV、FCV 和FHV-1）疫苗，但仍然感染FCV 并導(dǎo)致發(fā)病，說明目前的貓三聯(lián)疫苗并不能保護(hù)機(jī)體抵御所有FCV 毒株的感染，因此疫苗保護(hù)率差是造成FCV 感染的因素之一。國(guó)內(nèi)同樣有研究[13]顯示，該疫苗對(duì)FCV 保護(hù)力不佳。有研究[14]表明，使用滅活的FCV 顆粒進(jìn)行鼻內(nèi)免疫可對(duì)貓的同源和異源病毒提供強(qiáng)有力的保護(hù)。通過反向遺傳技術(shù)也使FCV 疫苗研究取得了一定進(jìn)展[15]。本研究中，F(xiàn)CV 分離株間的核苷酸同源性為75.3%～99.8%，與FCV 疫苗株255 和F4 的同源性都不高，與美國(guó)超強(qiáng)毒株VS-FCV-Ari 的同源性只有73.9%～77.1%。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究[16-17]同樣表明，F(xiàn)CV 感染比較普遍，且毒株相互間的同源性不高，來源復(fù)雜。因而，今后有必要繼續(xù)進(jìn)行FCV 等病毒的流行情況調(diào)查。

綜上所述，本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)分離獲得了31 株FCV 分離株和2 株FHV-1 分離株，并進(jìn)行了基因序列分析，初步了解了上海市貓上呼吸道疾病病例中FCV、FHV-1 和FIV 的感染比例以及病原的遺傳變化特點(diǎn)，為貓呼吸道病毒性疾病診斷試劑及疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。