山東省青島市貓病毒性鼻氣管炎流行情況調(diào)查

孫厚民，李陸梅，祝洪偉，陳玉霞，孫 鵬，楚電峰，范根成

（青島易邦生物工程有限公司，動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266100）

貓病毒性鼻氣管炎（feline viral rhinotracheitis，F(xiàn)VR）是由貓皰疹病毒Ⅰ型（feline herpesvirus-1，F(xiàn)HV-1）引起貓的一種急性、高度接觸性上呼吸道疾病，以打噴嚏、流淚以及結(jié)膜炎和鼻炎為主要臨床特征[1]，主要侵害幼貓，引起的發(fā)病率達(dá)100%，死亡率約為50%，對(duì)成年貓的病死率達(dá)20%～30%，是目前已知的重要貓呼吸道疾病之一[2]。FHV-1 是皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科水痘病毒屬成員，具有皰疹病毒的一般特性，病毒粒子直徑為126～167 nm，病毒粒子中心致密，外有囊膜，為雙股DNA 病毒，基因組大小為126～134 kb，立體對(duì)稱的核衣殼上分布有162 個(gè)殼粒[3]。FHV-1 于1958 年首次在美國(guó)被分離到[4]，現(xiàn)在世界范圍內(nèi)廣泛流行[5-10]。為了解山東省青島市FVR 的流行情況，開(kāi)展了FHV-1 感染情況篩查，并對(duì)篩查結(jié)果進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本信息 218 份貓拭子樣本編號(hào)為1～218號(hào)，來(lái)源于青島市市區(qū)及所轄的膠州市、平度市和萊西市，其中1～80 號(hào)在寵物貓主人家里采集，81～154 號(hào)采集于寵物醫(yī)院，155～194 號(hào)采集于寵物市場(chǎng)，195～218 號(hào)采集于寵物救助站；60 份貓血清樣本編號(hào)為1～60 號(hào)，其中1～40 號(hào)來(lái)源于寵物醫(yī)院，41～60 號(hào)來(lái)源于寵物救助站。

1.1.2 主要試劑及儀器 FHV-1 毒株和貓腎傳代細(xì)胞（F81），由動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；DMEM 培養(yǎng)基和胰酶，均購(gòu)自Hyclone公司；DNA 快速提取試劑盒，購(gòu)自杭州博日科技股份有限公司；離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司；PremixTaq及2 000 bp DNA Marker，均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；PCR 儀，購(gòu)自德國(guó)Biometra 公司；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀，購(gòu)自北京市六一儀器廠；凝膠成像分析儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD 公司；倒置生物顯微鏡，購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司；CO2培養(yǎng)箱，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與處理

1.2.1.1 拭子樣本 用無(wú)菌棉拭子采集被檢貓眼鼻拭子，將拭子懸浮于無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中，漩渦振蕩1 min，除菌過(guò)濾后，取200 μL 按DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，將處理后的DNA樣品直接使用或于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 血清樣本 前肢靜脈采血1～2 mL，37 ℃放置1 h，4 ℃放置30 min 凝固后，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清直接使用或于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拭子樣本檢測(cè)

1.2.2.1 基因擴(kuò)增 利用針對(duì)FHV-1gD基因建立的PCR 方法，對(duì)樣本進(jìn)行基因序列檢測(cè)。檢測(cè)用上游引物FHV（gD）-F：atgatgacacgtctacattt；下游引物FHV（gD）-R：ttaaggatggtgagttgtat。擴(kuò)增片段大小為1 125 bp。反應(yīng)體系組成（25.0 μL）：PremixTaq12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，提取的DNA 樣本2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸5 min。

1.2.2.2 PCR 產(chǎn)物檢測(cè) 取10 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB）進(jìn)行電泳鑒定。電泳緩沖液為1×TAE，130 V 電泳25 min，在凝膠成像分析儀下觀察PCR 產(chǎn)物條帶在凝膠中的位置，以2 000 bp DNA Marker 為參照物，判定結(jié)果。將PCR 陽(yáng)性擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，然后與GenBank中FHV-1 序列進(jìn)行比對(duì)[11]。

1.2.2.3 陽(yáng)性樣本復(fù)測(cè) 將所有PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本進(jìn)行復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)仍為陽(yáng)性的樣本判為陽(yáng)性。

1.2.3 TCID50測(cè)定 將FHV-1 病毒液用含2%FBS 的DMEM 進(jìn)行10 倍倍比稀釋，共稀釋12 個(gè)梯度，取長(zhǎng)滿單層F81 細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，倒出生長(zhǎng)液，將稀釋好的病毒液加入到96 孔板中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度重復(fù)5 個(gè)孔；輕微搖動(dòng)混勻后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞病變（CPE）觀察，連續(xù)觀察5 d；出現(xiàn)CPE 的孔記為“+”，未出現(xiàn)的記為“-”，按照Reed-Muench 法[12]計(jì)算該病毒懸液的TCID50。

1.2.4 血清樣品中和抗體效價(jià)測(cè)定 根據(jù)測(cè)定的TCID50值，將FHV-1 病毒液稀釋成2 00 個(gè)TCID50/0.1 mL；將待測(cè)血清樣品56 ℃滅活30 min，然后用含2% FBS 的DMEM 作2 倍倍比稀釋至1:1 024；吸取各稀釋度血清500 μL 加入到1.5 mL 離心管中，同時(shí)加入500 μL 已稀釋好的FHV-1 病毒液，輕輕搖晃混合后于37 ℃孵育1 h；取長(zhǎng)滿單層F81 細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，倒出生長(zhǎng)液，將血清病毒混合液加入到96 孔板中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度重復(fù)5 個(gè)孔，同時(shí)設(shè)置陰性血清對(duì)照、病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照；于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，顯微鏡下觀察CPE。按照Reed-Muench法，計(jì)算待測(cè)血清樣品的中和抗體效價(jià)。

1.2.5 檢測(cè)結(jié)果分析 統(tǒng)計(jì)所有被調(diào)查貓的病毒攜帶率，對(duì)不同來(lái)源、年齡和性別貓的檢測(cè)結(jié)果，采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，比較組間差異，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；以中和抗體效價(jià)大于1:8 為陽(yáng)性，等于1:8為可疑，小于1:8 為陰性[13]，統(tǒng)計(jì)不同來(lái)源血清樣本的抗體陽(yáng)性率。

2 結(jié)果

2.1 PCR 檢測(cè) 電泳結(jié)果（圖1）顯示，218 份貓樣本中有22 份樣本擴(kuò)增到約1 125 bp 的陽(yáng)性目的條帶，對(duì)該22 份樣品進(jìn)行復(fù)檢，仍均為FHV-1陽(yáng)性，陽(yáng)性率為10.1%（22/218）。

2.2 不同來(lái)源貓樣品檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

22 份FHV-1 陽(yáng)性樣品中，來(lái)自寵物救助站的4 份，陽(yáng)性率為16.7%，檢出率最高，來(lái)自寵物貓主人家的6 份，檢出率為7.5%，但各組間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同來(lái)源樣品的FHV-1 檢測(cè)結(jié)果

2.3 不同年齡和性別貓樣品檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

從年齡來(lái)看，2～6 月齡幼貓的FHV-1 陽(yáng)性率為13.6%，略高于成年貓（7.0%），但兩組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；從性別來(lái)看，成年公貓陽(yáng)性率（7.3%）稍高于成年母貓（6.7%），兩者亦無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 不同性別和年齡貓的FHV-1 檢測(cè)結(jié)果

2.4 血清樣品抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì) 按照1.2.3 的方法計(jì)算出病毒懸液的TCID50為10-6.5/0.1 mL。在40份寵物醫(yī)院提供的血清樣本中，檢出陽(yáng)性26 份，檢出率為65.0%（26/40）。20 份寵物救助站提供的血清樣本中，檢出陽(yáng)性14 份，檢出率為70.0%（14/20）。血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)詳見(jiàn)表3～4。

表3 寵物醫(yī)院40 份血清中和抗體檢測(cè)結(jié)果

表4 寵物救助站20 份血清中和抗體檢測(cè)結(jié)果

3 討論

Gourkow 等[14]在2013 年對(duì)加拿大西部一家動(dòng)物收容所的250 只患有上呼吸道感染的流浪貓進(jìn)行了FHV-1 qPCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不高于3%的貓感染了FHV-1。2017 年Fernandez 等[15]對(duì)從西班牙多家動(dòng)物醫(yī)院收集的358 只出現(xiàn)結(jié)膜炎和上呼吸道疾病的家養(yǎng)貓眼鼻口拭子進(jìn)行了qPCR 檢測(cè)，結(jié)果FHV-1 陽(yáng)性檢出率為15.1%。Nguyen 等[16]2019 年對(duì)從澳大利亞多家動(dòng)物醫(yī)院收集的3 142 只出現(xiàn)上呼吸道疾病的家貓進(jìn)行了PCR 檢測(cè)，結(jié)果FHV-1陽(yáng)性檢出率為7%。FHV-1 呈間歇性排毒，多數(shù)情況下潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)，因此PCR 檢測(cè)結(jié)果與感染時(shí)間及排毒情況有關(guān)，呈一過(guò)性。本調(diào)查結(jié)果顯示，青島市FHV-1 的PCR 檢測(cè)陽(yáng)性率為10.1%，寵物救助站貓的陽(yáng)性率（16.7%）略高于其他來(lái)源貓，可能與來(lái)源復(fù)雜有關(guān)。2～6 月齡幼貓的FHV-1陽(yáng)性檢出率較高，可能因其斷奶后失去母源抗體保護(hù)，而自身免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育健全，所以應(yīng)加強(qiáng)對(duì)斷奶后幼貓的相關(guān)免疫。

2012 年Digangi 等[17]對(duì)進(jìn)入佛羅里達(dá)動(dòng)物收容所的貓，針對(duì)FHV-1 的血清抗體滴度進(jìn)行了流行率調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)347 只貓的血清陽(yáng)性率為11.0%。2019 年P(guān)aola 等[18]對(duì)意大利米蘭流浪貓中抗皰疹病毒的血清抗體滴度進(jìn)行了流行率調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該地區(qū)流浪貓中抗皰疹病毒的血清陽(yáng)性率為37.1%。本研究采用的中和抗體檢測(cè)方法，是抗體檢測(cè)的經(jīng)典方法，也是“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，既能定性也能準(zhǔn)確定量。檢測(cè)結(jié)果顯示，寵物醫(yī)院接診貓的FHV-1 中和抗體陽(yáng)性率為65.0%，雖然部分貓的抗體效價(jià)達(dá)到1:512，但抗體整齊度很差，且有35.0%貓的抗體滴度達(dá)不到最低保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，存在感染發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。跟蹤調(diào)查這40 份寵物醫(yī)院接診貓的免疫背景，有32 只貓免疫過(guò)FHV-1 疫苗，但有12只抗體呈陰性，表明抗體保護(hù)水平不高，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)寵物貓的免疫。寵物貓免疫FHV-1 疫苗后，有必要進(jìn)行中和抗體效價(jià)測(cè)定，中和抗體效價(jià)不合格的需要補(bǔ)免。救助站收容貓的FHV-1 中和抗體陽(yáng)性率高達(dá)70%，但抗體效價(jià)均較低，僅能達(dá)到1:16，有些可能是臨床發(fā)病康復(fù)后產(chǎn)生的抗體，然而救助站收容貓的抗原、抗體陽(yáng)性率均較高，說(shuō)明救助站收容貓的FHV-1 感染率很高，所以應(yīng)加強(qiáng)對(duì)救助站收容貓的相關(guān)免疫。

本研究的采樣范圍和樣本數(shù)量有限，調(diào)查樣本基本來(lái)自寵物醫(yī)院、寵物救助站、寵物貓主人家和寵物市場(chǎng)，缺乏城市流浪貓、郊區(qū)野貓和林區(qū)山貓等不同背景的數(shù)據(jù)，這些問(wèn)題有待于在更長(zhǎng)時(shí)間段、更大范圍的數(shù)據(jù)收集基礎(chǔ)上進(jìn)行探討，以便得出更加客觀真實(shí)的結(jié)果。FVR 作為貓的常見(jiàn)病，嚴(yán)重影響貓科動(dòng)物生活質(zhì)量，甚至有致死風(fēng)險(xiǎn)，然而目前尚無(wú)特效療法，僅以預(yù)防為主。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有疫苗數(shù)量很少，應(yīng)盡快研制國(guó)產(chǎn)FHV-1 相關(guān)疫苗，以解決疫苗短缺及免疫失敗問(wèn)題，更好地防控FHV-1 相關(guān)疾病。