百香果莖基腐病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性

黃艷花，寧 平，黃遠(yuǎn)光，歐善生，張燕杏，覃潮妮，蒙 成

(1. 廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，南寧 530007；2.廣西梧州市長(zhǎng)洲區(qū)倒水鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 梧州 543006)

【研究意義】百香果(PassifloraedulisSims)學(xué)名西番蓮，為西番蓮科西番蓮屬熱帶、亞熱帶多年生常綠藤本漿果類果樹，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。近年來，隨著百香果種植年限的延長(zhǎng)和規(guī)模的不斷擴(kuò)大，百香果莖基腐病也在逐年蔓延，個(gè)別果園發(fā)病率、死亡率達(dá)80%～90%，造成果園缺株嚴(yán)重、園相零亂、掛果面少、產(chǎn)量低[3]。筆者于2020年4—8月深入廣西5個(gè)生態(tài)區(qū)10個(gè)百香果種植基地開展田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病發(fā)病率較重，部分一年生果園發(fā)病率在30%以上，連作果園病株死亡率達(dá)50%～60%，多地已出現(xiàn)因該病蔓延而導(dǎo)致荒廢的果園。百香果莖基腐病的病原菌研究目前雖有相關(guān)報(bào)道，但研究結(jié)果不一致，不同地區(qū)病原菌種類存在差異。因此，鑒定百香果莖基腐病病原菌及分析其生物學(xué)特性，對(duì)百香果莖基腐病的科學(xué)防控及廣西百香果產(chǎn)業(yè)持續(xù)快速發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，我國(guó)已有不少研究人員開展百香果莖基腐病病原菌鑒定研究，但研究結(jié)果不盡相同。黃盈等[4]、陳星等[5]分別進(jìn)行福建和廣西防城港西番蓮莖基腐病病原菌鑒定，并確定該病原菌為尖孢鐮孢菌(FusariumoxysporumSchlecht)。李德福等[6]將福建、宋曉兵等[7]將廣東的西番蓮莖基腐病病原菌鑒定為腐皮鐮孢菌[F.solani(Mart) Sacc]。詹儒林等[8]將海南瓊海西番蓮莖基腐病病原菌鑒定為煙草疫霉菌(PhytophthoranicotianaeBreda de Haan)。邱金忠[9]研究認(rèn)為，百香果莖基腐病病原菌單獨(dú)或與多種病原菌聯(lián)合侵染導(dǎo)致植株莖基部和根部腐爛，其中鐮刀菌(Fusarium)和腐霉菌(Pythium)為主要病原菌。林泗海等[10]、黎靜[11]研究發(fā)現(xiàn)，百香果莖基腐病的病原菌為茄鐮刀菌。在發(fā)病規(guī)律研究方面，林泗海等[10]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，百香果莖基腐病在3—12月均可發(fā)生為害，發(fā)病高峰期在5—7月，該時(shí)期的高溫高濕為病菌繁殖提供了有利氣候條件。李德富等[12]調(diào)查認(rèn)為，高溫、高濕季節(jié)加上不良環(huán)境條件、不適栽培管理措施及種植感病品種是百香果莖基腐病發(fā)生的主要因素。黃志巧等[13]研究發(fā)現(xiàn)，65%代森鋅和80%多菌靈對(duì)西番蓮莖基腐病防控均具有顯著效果；林泗海等[10]研究表明，于百香果莖基腐病發(fā)病高峰期，在植株根頸部涂抹或淋施70%甲基托布津可濕性粉劑500倍液，每10～15 d防治1次，連續(xù)防治3次，可有效預(yù)防和控制百香果莖基腐病的發(fā)生和蔓延為害；黎靜[11]研究提出，百香果莖基腐病的綜合防治技術(shù)包括正確選擇種植地、進(jìn)行科學(xué)化管理、科學(xué)選擇種植品種、及時(shí)清理病死植株和及時(shí)進(jìn)行藥劑防治等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，在廣西不同生態(tài)區(qū)開展百香果莖基腐病病原菌及生物學(xué)特性鑒定研究鮮見報(bào)道，對(duì)引致百香果莖基腐病的主要病原菌仍未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過百香果莖基腐病病原菌分離、形態(tài)特征觀察、致病性測(cè)定和rDNA-ITS序列分析，對(duì)百香果莖基腐病病原菌及其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，以明確引致百香果莖基腐病的病原菌及其生物學(xué)特性，為百香果莖基腐病的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年4—8月在廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)進(jìn)行。于廣西百香果莖基腐病發(fā)生高峰期，分別從廣西梧州市、來賓市、上林縣、都安縣和南寧市郊區(qū)等百香果種植基地采集癥狀典型、病斑新鮮的臺(tái)農(nóng)1號(hào)百香果莖基腐病病株帶回實(shí)驗(yàn)室，用于病原菌分離。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離與純化 采用植物病原真菌常規(guī)分離法進(jìn)行病原菌分離[14]。切取百香果病株莖基部病健交界處的組織塊，經(jīng)75%酒精消毒1 min、5%次氯酸鈉消毒3 min、無菌水漂洗4次后接種至PDA培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)1～2 d長(zhǎng)出菌絲后，挑取菌落邊緣接種至PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化，獲得的純培養(yǎng)物保存于PDA斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌致病性測(cè)定 莖節(jié)離體接種：將純化保存的病原菌活化后接種至PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3 d，用直徑6 mm的打孔器打取菌絲塊。剪取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康百香果莖節(jié)，先用無菌水清洗干凈，75%酒精浸泡2 min濾干，待表面殘留的水分干后，用一次性醫(yī)用針頭輕扎3個(gè)距離小于1 cm孔，然后挑取制備好的菌絲塊置于刺傷部位，帶菌絲的面接觸枝條，置于鋪有3層紗布保濕的瓷盆，用保鮮膜密封后28 ℃恒溫培養(yǎng)。接種發(fā)病后從病斑上再次分離病原菌。

植株活體接種：分別選擇在苗圃扦插培育的3月齡健康小杯苗及6月齡健康盆栽苗(品種均為紫香)，將純化保存的病原菌活化后接種至PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3 d，用一次性醫(yī)用針頭刺傷莖基部的表皮數(shù)處，以直徑6 mm的打孔器打取菌絲塊接種至傷口處，用醫(yī)用脫脂棉浸泡無菌水后纏繞接種部位，外包保鮮膜保濕，接種后每天淋水保濕7 d。設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)接種5株植株，以不帶菌的PDA培養(yǎng)基塊為對(duì)照組，待發(fā)病后重新分離病原物，進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.2.3 病原菌鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：將直徑5 mm的菌絲塊接種在PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，觀察、描述菌落顏色和形態(tài)，定期觀察菌落生長(zhǎng)情況，在光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌的菌絲和孢子形態(tài)，查閱真菌分類鑒定工具書，初步確定病原菌分類地位。

分子生物學(xué)檢測(cè)：提取病原菌基因組DNA、PCR擴(kuò)增、測(cè)序及比對(duì)委托廣西南寧國(guó)拓生物科技有限公司完成。病原菌DNA采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取，采用真菌生物核糖體DNA通用引物ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′對(duì)rDNA-ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 15 s，56 ℃15 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將測(cè)序及拼接結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，用DNA序列檢索其匹配序列，進(jìn)行同源性比較。以近緣菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，確定病原菌的分類地位。

1.2.4 病原菌生物學(xué)特性觀測(cè) 溫度、光照和pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：參考朱迎迎等[15]的方法，將病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35和40 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)40 h，以十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)量；將病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行全黑暗(0 lx)、半光半暗(200 lx 12 h/0 lx 12 h)和全光照(200 lx)3種光照環(huán)境處理，全黑暗處理使用4層錫箔紙包裹遮光，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)40 h，測(cè)定菌落直徑；用鹽酸和氫氧化鈉溶液將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)配為3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00和11.00，將病原菌接種其上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)40 h，測(cè)定菌落直徑。每處理均為4次重復(fù)。

培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：參考梁萍等[16]的方法并略加修改，制備PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、水1000.0 mL)、Czapek培養(yǎng)基(硝酸鈉3.0 g、磷酸氫二鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.0 g、瓊脂20.0 g、水1000.0 mL)、OA培養(yǎng)基(燕麥片30.0 g、瓊脂20.0 g、水1000.0 mL)、CMA培養(yǎng)基(玉米粉30.0 g、瓊脂20.0 g、水1000.0 mL)、汁液培養(yǎng)基(健康新鮮百香果枝葉200.0 g，水熬煮30 min，瓊脂20.0 g，水1000.0 mL)和WA培養(yǎng)基(瓊脂15.0 g，補(bǔ)足水至1000.0 mL)。上述6種培養(yǎng)基的pH自然。將病原菌分別接種于上述培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)40 h，測(cè)定菌落直徑。每處理4次重復(fù)。

碳和氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：參考胡美姣等[17]的方法并略加修改，以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(硝酸鈉3.0 g、磷酸氫二鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.0 g、瓊脂20.0 g、水1000.0 mL)，分別用等質(zhì)量的麥芽糖、乳糖、葡萄糖、D-果糖、D-木糖、木糖醇、甘露醇、山梨醇、甘油和淀粉置換蔗糖，配制成10種含不同碳源的培養(yǎng)基；用等質(zhì)量的L-精氨酸、DL-丙氨酸、L-賴氨酸、甘氨酸、氯化銨、磷酸二氫銨、牛肉膏、酵母粉、蛋白胨和尿素置換硝酸鈉，配制成10種氮源的培養(yǎng)基，并設(shè)無碳源、無氮源培養(yǎng)基為對(duì)照。挑取直徑為6 mm的菌餅接種至上述不同碳、氮源培養(yǎng)基平板中央，置于30 ℃恒溫暗培養(yǎng)40 h，采用十字交叉法同時(shí)測(cè)定各處理的菌落直徑。每處理4次重復(fù)。

致死溫度測(cè)定：預(yù)備試驗(yàn)取菌餅置于含5.0 mL滅菌水的離心管中，分別于40、45、50、55、60和65 ℃恒溫水浴10 min，取出菌餅置于PDA培養(yǎng)基上30 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察有無菌絲生長(zhǎng)。按相差1 ℃再試驗(yàn)，最終確定致死溫度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理，以Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果莖基腐病病害癥狀及發(fā)病情況

受莖基腐病病原菌為害的百香果植株初期莖基部皮層呈暗黑色、水漬狀、腐爛，后逐漸擴(kuò)展至韌皮部和木質(zhì)部，病部組織易與木質(zhì)部分離，剝開皮層后木質(zhì)部也有濕腐現(xiàn)象。為害輕時(shí)植株仍能正常生長(zhǎng)，當(dāng)形成腐爛圈時(shí)，葉片失水萎蔫，此時(shí)葉片仍為綠色，根系完好，最后病斑逐步在莖部向上、向下擴(kuò)展，導(dǎo)致整株植株莖枝褐色干腐，萎蔫死亡。在病部看到明顯的黑色小顆粒即為病原菌分生孢子器。

2.2 百香果莖基腐病病原菌致病性測(cè)定結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)室對(duì)采自廣西各百香果種植基地的典型百香果莖基腐病癥狀植株病部進(jìn)行分離，均分離到同一形態(tài)真菌，命名為32-WUB3菌株。菌株離體接種致病性測(cè)定結(jié)果(圖1-A，1-C)顯示，接種1 d后，百香果接種部位開始出現(xiàn)水漬狀病斑，隨后病斑沿莖部呈條形擴(kuò)展，最后整條枝條腐爛，而對(duì)照百香果枝條的莖節(jié)無發(fā)病癥狀；發(fā)病后從病斑上再次分離獲得與接種病原菌相同的菌株；菌株活體3月齡小杯苗和盆栽6月齡大苗接種致病性測(cè)定結(jié)果(圖1-D～G)顯示，接種3 d后，接種部位開始出現(xiàn)暗黑色、水漬狀腐爛，接種5～7 d植株葉片失水萎蔫，10～15 d后整株萎蔫枯死，在病部看到明顯的黑色小顆粒即為病原菌分生孢子器，而對(duì)照組植株健康，無感病癥狀出現(xiàn)(圖1-H)；植株發(fā)病后從病斑上再次分離獲得的病原菌其菌落形態(tài)及菌體特征與接種病原菌完全一致。

2.3 百香果莖基腐病病原菌的形態(tài)特征及分類地位

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征 32-WUB3菌株在PDA培養(yǎng)基上于28 ℃條件下培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)迅速，36～48 h可鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿(d=90.00 mm)，初期生長(zhǎng)稀疏，呈白色至灰白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)呈放射狀，菌落圓形或近圓形，邊緣整齊，背面白色(圖2-A)，后期菌絲逐漸變?yōu)榛液谏梁谏?，背面黑?圖2-B)，有時(shí)呈束狀直立生長(zhǎng)(圖2-C)；在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢極少，在OA培養(yǎng)基(圖2-D)、田間和回接病原菌的發(fā)病植株(圖1-G)上肉眼可見黑色粒狀小點(diǎn)，在顯微鏡下可見分生孢子器；分生孢子器近球形或不規(guī)則形，黑色，分生孢子橢圓形或卵形，初期單胞無色，老熟后呈褐色，近中部有一個(gè)橫隔膜(圖2-E，2-F)，其大小為(21.28～28.50)μm×(12.30～16.10)μm，平均為25.23 μm×14.01 μm。根據(jù)菌落及分生孢子形態(tài)學(xué)特征，參考現(xiàn)有的文獻(xiàn)[21]初步將32-WUB3菌株鑒定為子囊菌門座囊菌綱葡萄座腔菌目葡萄座腔菌科毛色二孢屬(Lasiodiplodia)。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 對(duì)32-WUB3菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用雙向測(cè)序并進(jìn)行拼接，將病菌的rDNA-ITS序列測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測(cè)序列與可可毛色二孢菌(L.theobromae)相關(guān)序列的相似性達(dá)99%。查找相似物種的同一基因序列，使用MEGA 6.0對(duì)相似性較高的菌株及同屬不同種菌株進(jìn)行聚類，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果(圖3)表明，32-WUB3菌株與L.theobromaeIRNBS73(MN634044.1)菌株聚在同一分枝上，進(jìn)一步證實(shí)可可毛色二孢菌是百香果莖基腐病的病原菌。

2.4 百香果莖基腐病病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1 不同溫度、光照和pH下的菌絲生長(zhǎng)特性 從圖4可看出，菌絲在10～35 ℃均可生長(zhǎng)，在10～28 ℃的生長(zhǎng)速度隨著溫度的升高而提高，在28～35 ℃的生長(zhǎng)速度隨著溫度的升高而降低，低于10 ℃和高于35 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)均受到嚴(yán)重抑制，溫度為5和40 ℃時(shí)菌絲不生長(zhǎng)。其中，菌絲在28和30 ℃時(shí)生長(zhǎng)較快，菌落直徑分別為8.27和8.31 cm，二者差異不顯著(P>0.05，下同)，但均極顯著高于其他溫度條件下的菌落直徑(P<0.01，下同)；在25 ℃條件下菌絲生長(zhǎng)也較快，其菌落直徑極顯著高于除28和30 ℃條件外其他溫度條件下的菌落直徑。說明32-WUB3菌株的菌絲生長(zhǎng)最佳溫度為28～30 ℃。

圖3 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的32-WUB3菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 32-WUB3 strain constructed based on rDNA-ITS sequence

從圖5可看出，32-WUB3菌株對(duì)光照條件敏感，其中，在全光照條件下生長(zhǎng)最快，菌落直徑達(dá)8.49 cm，極顯著高于全黑暗條件下的菌落直徑，顯著高于半光半暗條件下的菌落直徑(P<0.05，下同)；在半光半暗條件下的菌落直徑為8.13 cm，顯著高于全黑暗條件下的菌落直徑；在全黑暗條件下生長(zhǎng)最慢，菌落直徑僅6.97 cm。說明全光照是最適宜32-WUB3菌株菌絲生長(zhǎng)的光照條件。

從圖6可看出，32-WUB3菌株對(duì)pH的適應(yīng)范圍較廣，其中，在pH 3.00～11.00時(shí)菌絲均可生長(zhǎng)，在pH 3.00～8.00時(shí)菌絲生長(zhǎng)較快，菌落直徑達(dá)8.10～8.44 cm，各pH處理間差異不顯著，但均顯著或極顯著高于pH 9.00～11.00處理的菌落直徑；pH 9.00和pH 10.00條件下的菌落直徑分別為7.17和7.09 cm，二者間無顯著差異，但均極顯著高于pH 11.00時(shí)的菌落直徑(2.83 cm)。說明最適宜32-WUB3菌株菌絲生長(zhǎng)的pH為3.00～8.00。

圖4 不同溫度對(duì)32-WUB3菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of different temperature on mycelial growth of 32-WUB3 strain

圖5 光照條件對(duì)32-WUB3菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of light condition on mycelial growth of 32-WUB3 strain

2.4.2 菌絲在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性 從圖7可看出，32-WUB3菌株在6種培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，其中，在PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，菌落直徑達(dá)9.00 cm，極顯著高于其他培養(yǎng)基的菌落直徑；其次為OA培養(yǎng)基，其菌落直徑極顯著高于除PDA培養(yǎng)基外的其他培養(yǎng)基；在CMA培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)最慢，其菌落直徑均極顯著小于其他培養(yǎng)基。說明PDA培養(yǎng)基是最適宜32-WUB3菌株菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。

2.4.3 菌絲在不同碳和氮源中的生長(zhǎng)特性 從圖8可看出，32-WUB3菌株在10種碳源上均可生長(zhǎng)，但菌絲生長(zhǎng)速度在不同碳源間存在差異。其中，以葡萄糖為碳源時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑達(dá)7.78 cm，顯著高于其他碳源的菌落直徑；菌絲生長(zhǎng)較快的碳源依次有D-果糖、甘油和山梨醇，其菌絲生長(zhǎng)狀況較佳，菌落直徑在4.98～6.39 cm，相互間無顯著差異；以D-木糖、乳糖、木糖醇和麥芽糖為碳源時(shí)

圖6 不同pH對(duì)32-WUB3菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of different pH on mycelial growth of 32-WUB3 strain

圖7 不同培養(yǎng)基對(duì)32-WUB3菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of different medium on mycelial growth of 32-WUB3 strain

圖8 不同碳源對(duì)32-WUB3菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effects of different carbon source on mycelial growth of 32-WUB3 strain

菌絲生長(zhǎng)較慢，菌落直徑均低于4.60 cm，相互間無顯著差異，但均與以D-果糖、甘油和山梨醇為碳源的菌落直徑存在顯著或極顯著差異。說明葡萄糖是最適宜32-WUB3菌株菌絲生長(zhǎng)的碳源。

從圖9可看出，菌株32-WUB3在10種氮源上均可生長(zhǎng)，但菌絲在不同氮源上的生長(zhǎng)速度存在差異。其中，菌絲在以酵母粉、蛋白胨、DL-丙氨酸、L-精氨酸和甘氨酸為氮源時(shí)菌落生長(zhǎng)較快，菌落直徑均高于6.00 cm(尤其以酵母粉為氮源的菌落直徑達(dá)7.13 cm)，且相互間無顯著差異，但均顯著或極顯著高于以牛肉膏為氮源的菌落直徑，極顯著高于以尿素、磷酸二氫銨、氯化銨、L-賴氨酸和CK為氮源的菌落直徑；在以牛肉膏為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)也較好，菌落直徑為5.13 cm，顯著高于以尿素、磷酸二氫銨、氯化銨、L-賴氨酸和CK為氮源的菌落直徑；在以尿素、磷酸二氫銨、氯化銨、L-賴氨酸和CK為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)較慢，菌落直徑均小于3.50 cm，且相互間無顯著差異。說明酵母粉是最適宜32-WUB3菌株菌絲生長(zhǎng)的氮源，其次為蛋白胨、DL-丙氨酸、L-精氨酸和甘氨酸。

2.4.4 病原菌的致死溫度測(cè)定結(jié)果 菌株32-WUB3的病原菌分別經(jīng)40、45和50 ℃處理10 min仍能在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在55 ℃及以上溫度時(shí)不能生長(zhǎng)。再以50、51、52、53和54 ℃進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在52、53和54 ℃時(shí)培養(yǎng)皿中未見長(zhǎng)出菌絲。因此，確定該病原菌的致死條件為52 ℃處理10 min。

3 討 論

本研究對(duì)采自廣西不同生態(tài)區(qū)百香果種植基地的百香果莖基腐病病株的病菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察、致病性測(cè)定和分子鑒定等，首次發(fā)現(xiàn)可可毛色二孢菌是百香果莖基腐病的病原菌。該病原菌主要為害百香果成株期莖基部，嚴(yán)重時(shí)從莖基部向莖稈上部擴(kuò)展蔓延；人工接種可侵染百香果苗莖基部，導(dǎo)致百香果苗整株葉片在短期內(nèi)失水萎蔫、下垂，莖基部皮層呈暗黑色、水漬狀腐爛，后逐漸擴(kuò)展至韌皮部和木質(zhì)部，最后病斑逐漸從莖部向上擴(kuò)展，導(dǎo)致整株植株莖枝褐色干腐，最后整株徹底枯死?？煽擅呔且环N重要的植物病原菌，可導(dǎo)致熱帶、亞熱帶地區(qū)植物發(fā)生病害，包括茶樹、橡膠樹、獼猴桃和春芋葉斑病[18-21]，桉樹、白木香、肉桂枝枯病[22-24]、南洋楹潰瘍病[25]、欒樹裂皮病[26]和毛葡萄穗軸褐腐病[27]，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

圖9 不同氮源對(duì)32-WUB3菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth of 32-WUB3 strain

本研究結(jié)果表明，百香果可可毛色二孢莖基腐病病原菌喜高溫不喜低溫，溫度低于10 ℃難以生長(zhǎng)，在35 ℃時(shí)仍然生長(zhǎng)良好，最適宜生長(zhǎng)溫度為28～30 ℃，與戴利銘等[19]報(bào)道的橡膠樹葉斑病可可毛色二孢菌相似，與該病易在5—7月大發(fā)生的發(fā)病規(guī)律[10]相符，說明該菌是一種高溫適生菌，容易造成百香果發(fā)病急、發(fā)病重，防治難度大，因此，生產(chǎn)上應(yīng)采取預(yù)防為主、綜合防治的防控措施；該菌生長(zhǎng)的pH范圍與薛振南等[24]的報(bào)道相似，適宜生長(zhǎng)的pH范圍較廣，pH為3.00～8.00時(shí)均能良好生長(zhǎng)，土壤和雨水的pH均不會(huì)阻礙其侵染和傳播；該病菌菌絲生長(zhǎng)的最適合光照條件為全光照，在半光半暗條件下也能生長(zhǎng)良好，全黑暗環(huán)境不利于其病原菌侵染，與石金巧等[20]報(bào)道的獼猴桃葉斑病致病病原菌可可毛色二孢菌最適光照條件一致；可可毛色二孢莖基腐病病原菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，很多能培養(yǎng)真菌的培養(yǎng)基和碳、氮源均能滿足其生長(zhǎng)需求，其中，菌絲生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，最適碳源為葡萄糖，與戴利銘等[19]報(bào)道的橡膠樹葉斑病可可毛色二孢菌相似，其次為D-果糖、甘油和山梨醇，以D-木糖、乳糖、木糖醇和麥芽糖為碳源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較緩慢；最適氮源為酵母粉，與石金巧等[20]對(duì)獼猴桃葉斑病致病病原菌可可毛色二孢菌的研究結(jié)果一致，其次是蛋白胨、DL-丙氨酸、L-精氨酸和甘氨酸，以尿素、磷酸二氫銨、氯化銨和L-賴氨酸為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)較緩慢；百香果可可毛色二孢莖基腐病病原菌菌絲致死溫度條件為52 ℃處理10 min，與戴利銘等[19]報(bào)道的橡膠樹葉斑病可可毛色二孢菌相似。

本研究明確可可毛色二孢菌為百香果莖基腐病的病原菌，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了探究，但可可毛色二孢菌在百香果上的發(fā)生規(guī)律和防治技術(shù)還需進(jìn)一步觀察分析。

4 結(jié) 論

可可毛色二孢菌是百香果莖基腐病的病原菌，適宜其菌絲生長(zhǎng)的溫度為28～30 ℃，pH為3.00～8.00，光照條件為全光照，最佳培養(yǎng)基為PDA，最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母粉，其致死條件為52 ℃處理10 min。