不同發(fā)育階段、不同質(zhì)量囊胚冷凍復(fù)蘇移植周期妊娠結(jié)局分析

李澎濤，殷晨星，王 娜，邢 鵬，孟娜娜，郭戰(zhàn)坤

(河北省保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，河北 保定 071000)

隨著囊胚培養(yǎng)及玻璃化冷凍技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展，明顯提高了患者凍融胚胎移植周期妊娠率及胚胎著床率[1]，因此囊胚凍融移植在很多生殖中心得到廣泛應(yīng)用。那么如何在凍融周期選擇更具有發(fā)育潛能的囊胚進(jìn)行移植是一個(gè)目前有待解決的問(wèn)題。依據(jù)Gardner囊胚分級(jí)法[2]囊胚擴(kuò)張程度及孵出程度分期為1～6期，依據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)、滋養(yǎng)層(trophoderm,TM)細(xì)胞數(shù)多少及緊密程度分級(jí)為A、B、C三級(jí)。大多生殖中心對(duì)3期以上，ICM或TM評(píng)級(jí)不同時(shí)為C的囊胚進(jìn)行冷凍或移植，而就選擇哪一時(shí)期，什么質(zhì)量的囊胚移植能夠獲得更好的妊娠結(jié)局目前具有爭(zhēng)議。有的研究認(rèn)為孵出囊胚缺乏透明帶的保護(hù)，在移植過(guò)程中容易造成滋養(yǎng)層連接斷裂致使囊胚腔液外流，導(dǎo)致妊娠率、著床率的降低[3]，也有研究認(rèn)為孵出囊胚更易著床[4]。高質(zhì)量囊胚能夠獲得更高的妊娠率、著床率[5-7]，然而就ICM及TM哪一個(gè)對(duì)胚胎的著床更重要，亦沒(méi)有定論。本研究回顧分析了2015年1月—2019年10月在保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科接受單囊胚FET周期的患者資料，比較相同質(zhì)量不同發(fā)育階段、相同發(fā)育階段不同質(zhì)量囊胚FET周期妊娠結(jié)局差異，探討囊胚的發(fā)育階段、囊胚質(zhì)量對(duì)單囊胚FET周期的著床率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率等指標(biāo)的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2015年1月—2019年10月在保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科接受單囊胚FET周期的患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①單囊胚FET周期；②女方年齡20～35歲；③女方體重指數(shù)(body imass index,BMI)18～25；④雙方均無(wú)遺傳性疾?。虎莶捎米匀恢芷诨蛉斯ぶ芷趦?nèi)膜準(zhǔn)備方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：①子宮畸形患者；②子宮內(nèi)膜異位癥患者。

1.2囊胚選擇及凍融移植 依據(jù)Gardner囊胚分級(jí)法[2]對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇3期以上且滋養(yǎng)層或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)級(jí)不同時(shí)為C的囊胚冷凍保存。

優(yōu)質(zhì)囊胚：根據(jù)Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，3期及3期以上且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評(píng)分不含C的囊胚；非優(yōu)質(zhì)囊胚：3期及3期以上內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層中含有一個(gè)C級(jí)評(píng)分的囊胚。

囊胚的冷凍及解凍試劑為日本Kitazato公司的冷凍/解凍套裝，冷凍載體為日本加藤冷凍載桿Cryotop。冷凍前對(duì)囊胚進(jìn)行激光打孔皺縮，在37 ℃、6%CO2培養(yǎng)箱放置5～10 min，待囊胚進(jìn)一步皺縮后，按照冷凍/解凍套裝說(shuō)明書(shū)操作步驟對(duì)囊胚進(jìn)行冷凍及解凍。復(fù)蘇后對(duì)3/4期囊胚進(jìn)行激光輔助孵化，在37 ℃、6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 h，觀察囊胚擴(kuò)張情況，部分或完全擴(kuò)張為存活胚胎。

使用PICC移植管一段式裝管后超聲引導(dǎo)下將復(fù)蘇囊胚移植至子宮腔中后部。移植后35 d腹部超聲下見(jiàn)孕囊及胎心為臨床妊娠。

1.3內(nèi)膜準(zhǔn)備 采用人工周期、自然周期進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備。人工周期,在周期第2～4天開(kāi)始口服17β雌二醇或戊酸雌二醇4 mg，至第7天開(kāi)始陰道超聲監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜發(fā)育。當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm，且雌激素最少應(yīng)用14 d，開(kāi)始加用孕酮，第1天和第2天黃體酮針20 mg、地屈孕酮20 mg，第3天起一直應(yīng)用黃體酮40 mg、黃體酮膠囊400 mg、地屈孕酮20 mg。如內(nèi)膜準(zhǔn)備好后開(kāi)始進(jìn)行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，應(yīng)用孕激素內(nèi)膜轉(zhuǎn)化后第6天解凍移植囊胚期胚胎移植。自然周期,在自然周期第8～10天開(kāi)始超聲監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育。卵泡直徑<10 mm，隔2日超聲監(jiān)測(cè)一次，卵泡直徑10～14 mm時(shí)，隔日監(jiān)測(cè)一次，優(yōu)勢(shì)卵泡直徑>14 mm，每日監(jiān)測(cè)一次，并同時(shí)檢測(cè)血LH、E2、P及尿LH。連續(xù)血激素、尿LH檢測(cè)提示LH峰出現(xiàn)后24～36 h為排卵時(shí)間，超聲監(jiān)測(cè)至排卵，于排卵后4 d解凍囊胚期胚胎移植。

1.4研究分組 由于3期囊胚移植周期數(shù)據(jù)少，本研究?jī)H對(duì)4～6期囊胚進(jìn)行了分組研究。依據(jù)囊胚擴(kuò)張/孵出狀態(tài)及質(zhì)量將囊胚分為A1組(4期優(yōu)質(zhì)囊胚組)、A2(4期非優(yōu)質(zhì)囊胚組)、B1組(5期優(yōu)質(zhì)囊胚組)、B2組(5期非優(yōu)質(zhì)囊胚組)、C1組(6期優(yōu)質(zhì)囊胚)、C2組(6期非優(yōu)質(zhì)囊胚)。

1.5觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 臨床妊娠率=超聲下能檢測(cè)到孕囊的妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；著床率=超聲下檢測(cè)到的孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同發(fā)育階段優(yōu)質(zhì)囊胚FET周期妊娠結(jié)局比較 依據(jù)囊胚擴(kuò)張狀態(tài)不同，比較4～6期各階段優(yōu)質(zhì)囊胚324個(gè)FET周期妊娠結(jié)局的情況，其中A1組148周期、B1組66周期、C1組110周期。各組間患者年齡、不孕年限、BMI、既往周期數(shù)、FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和移植日子宮內(nèi)膜厚度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。臨床結(jié)局，優(yōu)質(zhì)胚胎組，A1組FET周期的妊娠率、著床率顯著高于B1組(P<0.05)，A1與C1組FET周期的妊娠率、著床率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但C1組的妊娠率、著床率有下降趨勢(shì)； A1、B1、C1 3組FET周期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、男/女比例、孕周及新生兒體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 優(yōu)質(zhì)囊胚FET周期各組患者基本情況比較Table 1 Comparison of basic condition of patients in each group with high quality blastocysts during FET cycle of

表2 優(yōu)質(zhì)囊胚FET周期患者妊娠結(jié)局情況比較Table 2 Comparison of pregnancy outcome in patients with high quality blastocysts during FET cycle

2.2不同發(fā)育階段非優(yōu)質(zhì)囊胚FET周期妊娠結(jié)局比較 依據(jù)囊胚擴(kuò)張狀態(tài)不同，比較4～6期各階段非優(yōu)質(zhì)囊胚組255個(gè)FET周期妊娠結(jié)局的情況，其中A2組141周期、B2組52周期、C2組62周期。各組間患者年齡、不孕年限、BMI、既往周期數(shù)、FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和移植日子宮內(nèi)膜厚度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。臨床結(jié)局，A2、B2、C2三組FET周期妊娠率、著床率，流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、男/女比例、孕周及新生兒體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表3 非優(yōu)質(zhì)囊胚FET周期各組患者基本情況比較Table 3 Comparison of basic conditions of patients with non-high-quality blastocysts in each group during FET cycle

表4 非優(yōu)質(zhì)囊胚FET周期患者妊娠結(jié)局情況比較Table 4 Comparison of pregnancy outcome in patients with non-high-quality blastocyst during FET cycle

2.3相同發(fā)育階段不同質(zhì)量囊胚FET周期妊娠結(jié)局比較 依據(jù)囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層質(zhì)量的不同，比較4～6期相同發(fā)育階段優(yōu)質(zhì)囊胚與非優(yōu)質(zhì)囊胚臨床結(jié)局的差異?；颊呋厩闆r，各組間患者年齡、不孕年限、BMI、既往周期數(shù)、FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和移植日子宮內(nèi)膜厚度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。臨床結(jié)局，A1組FET的臨床妊娠率、著床率、活產(chǎn)率高于A2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而流產(chǎn)率、孕周數(shù)及新生兒體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B1組與B2組、C1組與C2組FET的臨床妊娠率、著床率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、男/女比例、孕周數(shù)、新生兒出生體重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表6。

表5 相同發(fā)育階段不同質(zhì)量囊胚FET周期患者基本情況比較Table 5 Comparison of basic conditions of patients with blastocysts of different quality and at the same developmental stage during FET cycle

表6 相同發(fā)育階段不同質(zhì)量囊胚FET周期患者妊娠結(jié)局情況比較Table 6 Comparison of pregnancy outcomes of patients with blastocysts of different quality and at the same developmental stage during FET cycles

3 討 論

目前囊胚的冷凍大多數(shù)中心采用玻璃化冷凍，但胚胎的冷凍過(guò)程會(huì)造成透明帶的硬化，導(dǎo)致囊胚的孵化障礙，影響胚胎的著床。輔助孵化技術(shù)的應(yīng)用使凍融周期移植前的70%囊胚處于正在孵出或已經(jīng)孵出狀態(tài)[4]，能夠顯著改善凍融胚胎移植后的妊娠率及著床率[8]，尤其對(duì)于質(zhì)量差、發(fā)育速度慢的囊胚，輔助孵化能夠顯著提高胚胎移植后的著床率[9]。薛林濤等[10]利用Time-lapse系統(tǒng)觀察比較輔助孵化和未輔助孵化凍融囊胚發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了輔助孵化的囊胚的囊胚孵出率、完全孵出率及 U 型孵出率均顯著高于未輔助孵化的囊胚，同時(shí)后者8字型孵出率顯著升高。目前用于冷凍的囊胚多為3～6期，至于哪個(gè)階段凍融后能夠獲得更好的妊娠結(jié)局，仍存在一定的爭(zhēng)議。筆者回顧分析了2015—2019年間在我院接受FET治療579周期患者資料，通過(guò)比較相同質(zhì)量不同發(fā)育階段囊胚FET周期妊娠結(jié)局差異及相同發(fā)育階段不同質(zhì)量囊胚FET周期妊娠結(jié)局的差異，分別探討囊胚的發(fā)育階段及質(zhì)量對(duì)囊胚FET周期妊娠結(jié)局的影響。

Zhao等[9]通過(guò)將IVF-ET及FET周期單囊胚移植妊娠患者與未妊娠患者對(duì)比發(fā)現(xiàn)，妊娠組的囊胚擴(kuò)張程度顯著高于未妊娠組囊胚擴(kuò)張程度，因此研究認(rèn)為囊胚的擴(kuò)張程度是預(yù)測(cè)單囊胚移植妊娠結(jié)局的一項(xiàng)重要指標(biāo)尤其在FET周期。秦祖興等[11]比較新鮮單囊胚移植周期4～6期囊胚組與3期囊胚組的妊娠結(jié)局差異，發(fā)現(xiàn)前者的臨床妊娠率及著床率顯著高于后者，這與Marren等[12]的結(jié)果一致，此研究認(rèn)為擴(kuò)張期囊胚的臨床結(jié)局顯著優(yōu)于早期囊胚，同樣Du等[13]的研究亦證實(shí)相較于3囊胚，4/5期囊胚具有更強(qiáng)的著床潛能。但郭娜等[14]通過(guò)分析2 593例新鮮周期及復(fù)蘇周期的單囊胚移植妊娠結(jié)局的分析，發(fā)現(xiàn)3～6期各階段囊胚的臨床妊娠率、著床率、早期流產(chǎn)率及活產(chǎn)率各項(xiàng)參數(shù)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與朱序理等[15]的的結(jié)果相近，此研究通過(guò)回顧分析囊胚的擴(kuò)張程度、滋養(yǎng)層及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量對(duì)凍融周期妊娠結(jié)局的影響，建立優(yōu)選單囊胚順序的方案發(fā)現(xiàn)囊胚擴(kuò)張程度與臨床妊娠率沒(méi)有相關(guān)性。在本研究中非優(yōu)質(zhì)囊胚組不同擴(kuò)張程度囊胚間的妊娠結(jié)局各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著性差異，但優(yōu)質(zhì)囊胚組4期囊胚的妊娠率、著床率顯著高于其余各組囊胚的妊娠率、著床率，分析原因可能是由于孵出囊胚缺乏透明帶保護(hù)導(dǎo)致囊胚在凍融過(guò)程中易受到損傷，因此建議囊胚培養(yǎng)過(guò)程中增加囊胚的觀察次數(shù)，減少孵出囊胚的冷凍。

那么囊胚的發(fā)育階段是否為預(yù)測(cè)囊胚發(fā)育潛能獨(dú)立因素呢？在Zhao等[9]的研究中FET周期妊娠組囊胚擴(kuò)張程度高于未妊娠組，而囊胚的滋養(yǎng)層及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)等級(jí)2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此研究認(rèn)為囊胚的擴(kuò)張程度是預(yù)測(cè)臨床妊娠結(jié)局的一項(xiàng)重要參數(shù)，而且囊胚的擴(kuò)張程度在一定程度上反映了細(xì)胞數(shù)的多少，擴(kuò)張程度越大細(xì)胞數(shù)也越多，因此在FET周期胚胎選擇時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮囊胚的擴(kuò)張狀態(tài)。但在張建瑞等[16]的最新研究中無(wú)論是在新鮮移植周期還是復(fù)蘇移植周期，優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠率、著床率均顯著高于非優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠率及著床率，而囊胚的質(zhì)量對(duì)妊娠后不良產(chǎn)科及圍產(chǎn)期結(jié)局沒(méi)有影響。有研究[17]表明非優(yōu)質(zhì)囊胚的非整倍體率顯著高于優(yōu)質(zhì)囊胚，孫慶云等[18]認(rèn)為囊胚的非整倍體率與囊胚的發(fā)育天數(shù)及擴(kuò)張程度顯著相關(guān)，而與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層的評(píng)級(jí)無(wú)顯著相關(guān)性，但亦有報(bào)道[19]不同質(zhì)量外滋養(yǎng)層囊胚的整倍體率間無(wú)顯著差異，而囊胚的分期和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)級(jí)是囊胚整倍體率影響因素。Stephenson等[20]對(duì)285對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦的420份標(biāo)本進(jìn)行核型分析發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)率與胚胎的非整倍體率密切相關(guān)。Subira等[21]的報(bào)道顯示C級(jí)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)囊胚移植活產(chǎn)率比A級(jí)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)囊胚移植活產(chǎn)率下降了55%，而且C級(jí)囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)囊胚移植的流產(chǎn)率顯著高于A/B級(jí)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)囊胚移植的流產(chǎn)率，而滋養(yǎng)層的質(zhì)量對(duì)妊娠結(jié)局沒(méi)有影響。但亦有報(bào)道[22-24]認(rèn)為滋養(yǎng)層在胚胎著床的過(guò)程中更重要，Chen等[22]分析了263個(gè)單囊胚移植復(fù)蘇周期的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)A/B級(jí)滋養(yǎng)層囊胚的妊娠率、著床率及活產(chǎn)率顯著高于C級(jí)滋養(yǎng)層囊胚的妊娠率、著床率及活產(chǎn)率，而不同質(zhì)量?jī)?nèi)細(xì)胞團(tuán)的囊胚間并無(wú)這些差異。本研究中就相同發(fā)育階段優(yōu)質(zhì)囊胚與非優(yōu)質(zhì)囊胚移植的妊娠結(jié)局進(jìn)行比較，以排除囊胚的擴(kuò)張及孵出狀態(tài)對(duì)結(jié)局造成的影響，結(jié)果顯示4期優(yōu)質(zhì)單囊胚移植的妊娠率、著床率顯著高于4期非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植的妊娠率、著床率、活產(chǎn)率，但兩者在流產(chǎn)率、孕周及新生兒體重等參數(shù)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，5、6期優(yōu)質(zhì)與非優(yōu)質(zhì)囊胚間的妊娠率、著床率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、孕周及新生兒體重等參數(shù)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與倪曉蓓等[25]的研究結(jié)果相似。由于目前的囊胚評(píng)級(jí)主要依據(jù)囊胚的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行判斷，具有很強(qiáng)的主觀性，造成在滋養(yǎng)層及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)級(jí)上可能存在一定的差異，對(duì)妊娠結(jié)局的影響也有所不同。

綜上所述，囊胚的發(fā)育階段及滋養(yǎng)層/內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量均都對(duì)復(fù)蘇周期單囊胚移植的妊娠結(jié)局有一定的影響，本研究中4期優(yōu)質(zhì)囊胚復(fù)蘇周期妊娠率、著床率顯著高于其余各組，因此在復(fù)蘇胚胎選擇時(shí)應(yīng)予以優(yōu)先考慮，從而提高移植效率，使患者利益最大化。但由于本研究數(shù)據(jù)量偏少，因此結(jié)論存在一定的局限性，有待更多數(shù)據(jù)的研究。