黑木耳液體發(fā)酵研究進展及應用現(xiàn)狀綜述

周 超 馬銀鵬 包旭翔 李春君 張介馳,2*

（1.黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150000；2.黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江 哈爾濱 150000）

黑木耳（Auricularia heimuer）又稱光耳、云耳等[1]，隸屬于擔子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬[2]。黑木耳食藥兼用，具有高營養(yǎng)價值，含有蛋白質、脂肪、維生素等營養(yǎng)物質，以及多糖、黑色素、多酚、黃酮等活性物質[3]和人體必需的7 種氨基酸[4]。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，2020 年全國黑木耳產量再創(chuàng)新高，達到706.43 萬噸，在食用菌產業(yè)中名列前茅[5]。

20 世紀40 年代二戰(zhàn)期間，由于抗生素生產的需要，產生了液體深層發(fā)酵技術，美國弗吉尼亞大學Elmer.L.及Gaden.Jr 設計出了培養(yǎng)微生物的生物反應器。1948 年Humfeld[6]用液體發(fā)酵法成功培養(yǎng)出蘑菇菌絲體，此后，食用菌液體發(fā)酵技術得到進一步應用，并帶動了多個食用菌品種的發(fā)酵技術研究。尤其對于部分無法人工栽培獲得子實體的食用菌品種，液體深層發(fā)酵是大量獲取菌絲體的重要方法，獲得更多高品質的菌絲體已經成為發(fā)酵技術研究的主攻方向。然而，作為食用菌產業(yè)中的重要種類，黑木耳有關液體發(fā)酵技術的研究并不多，發(fā)酵技術強化研究主要聚焦于富集培養(yǎng)菌絲體和獲得發(fā)酵活性物質。近年來，隨著黑木耳菌包工廠化生產規(guī)模的擴大，黑木耳液體菌種需求量顯著增加，推動了基于提升液體菌種生產能力和產品品質的研究工作。本文對黑木耳液體發(fā)酵的研究應用進展進行綜述分析，以期為擴大黑木耳液體發(fā)酵產物應用領域和生產規(guī)模提供參考。

1 黑木耳液體發(fā)酵主要研究方向

黑木耳可以通過人工栽培獲得充足的子實體，因此其液體發(fā)酵研究和應用相較于其他無法人工栽培的食用菌品種并不活躍。但隨著近年來黑木耳菌包工廠化生產規(guī)模的迅速擴大，液體菌種被大量使用，其液體發(fā)酵研究正在逐漸成為新的熱點。為了得到更多高活力的菌絲體，黑木耳液體發(fā)酵研究主要關注于營養(yǎng)基質優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化和外源物質影響方面，也有關于發(fā)酵活性產物的提取及液體飲品開發(fā)的研究。

1.1 營養(yǎng)基質優(yōu)化研究

營養(yǎng)基質優(yōu)化包括最佳原料篩選和基質配方優(yōu)化。在原料篩選方面，以液體發(fā)酵產物中菌絲生物量為評價指標，開展了大量的單因素比較試驗。如張恒銀等[7]研究發(fā)現(xiàn)最適碳源和氮源分別為葡萄糖和酵母膏；荊瑞勇等[8]研究發(fā)現(xiàn)最適碳源和氮源為蔗糖和豆粉；矯天育[9]研究發(fā)現(xiàn)最適碳源是紅糖，最適氮源是蛋白胨、酵母膏。也有研究表明最適碳氮源為一些農產品，如王慶武等[10]研究顯示碳源以玉米粉、淀粉為佳，氮源以酵母膏、麩皮為佳；王旭等[11]研究顯示最適碳氮源為黃豆粉和麥麩。綜上可見，當碳源為葡萄糖、蔗糖、紅糖、黃豆粉、玉米粉等，氮源為酵母膏、麩皮、豆粉、蛋白胨時，黑木耳液體發(fā)酵菌絲生物量較高。雖然不同實驗得出的最適碳氮源存在差異，但以上研究均認為有機碳氮源優(yōu)于無機碳氮源。且上述實驗配方中均有添加少量微量元素，可見微量元素也是不可或缺的。

在確定最適原料的基礎上，有多項基質配方優(yōu)化研究報道。李超等[12]和于海洋等[13]通過正交試驗優(yōu)化，分別得到最佳配方為葡萄糖2.00%、酵母膏1.00%、KH2PO40.30%、MgSO4·7H2O 0.15%和葡萄糖3.00%、酵母浸膏0.20%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.10%。錢雪婷等[14]和解修超等[15]則通過響應面法優(yōu)化配方，分別得到最佳配方為葡萄糖2.16%、牛肉粉0.48%、KH2PO40.33 %、MgSO4·7H2O 0.10%和葡萄糖5.027%、蛋白胨0.45%、麥麩1.50%、MgSO4·7H2O 0.10%、KH2PO40.493%。綜合分析以上基質優(yōu)化配方，其碳氮源濃度基本一致，碳源濃度范圍為2.00%～5.00%，氮源濃度范圍為0.20%～1.00%。針對不同試驗中最適碳氮源及濃度有所不同的情況，分析其原因可能與試驗菌種特性有關，不同菌種的菌絲利用碳氮源速度不同，而原料的不同理化性質也會對發(fā)酵培養(yǎng)基性狀造成影響。

1.2 發(fā)酵條件優(yōu)化研究

液體發(fā)酵生產受環(huán)境條件影響較大，適宜的發(fā)酵條件能使黑木耳菌絲迅速生長而縮短生產周期。然而，發(fā)酵條件優(yōu)化研究結果顯示差異較大。孟麗君等[16]研究認為溫度對菌絲生物量影響最大，其次為接種量、搖瓶轉速、裝液量。王謙等[17]報道初始pH 對菌絲生物量影響最大，其次為搖瓶轉速、接種量，而溫度對菌絲生物量影響則最小，該研究還發(fā)現(xiàn)當轉速過高時會形成很大的剪切力，雖然提高了溶氧量，但菌絲體遭到破壞，影響了菌絲體的正常生長和代謝。眾多研究結果顯示，液體發(fā)酵最適溫度在25～30 ℃之間，該溫度范圍與黑木耳菌絲固體培養(yǎng)一致。

此外，不同研究結果顯示的最優(yōu)裝液量、搖瓶轉速、培養(yǎng)時間和初始pH 均有差異，如李玉梅等[18]和錢雪婷[19]的研究結果表明，最佳裝液量分別為65 mL 和100 mL（均為250 mL 錐形瓶），最適pH 分別為5.0 和5.85；車星星等[20]和盛立柱等[21]的試驗結果顯示最佳培養(yǎng)時間分別為7 天和6 天。造成最優(yōu)發(fā)酵條件差異較大的原因可能是由于試驗菌株本身特性差異和培養(yǎng)基質特性差異。目前研究大都是利用搖瓶分批發(fā)酵，對規(guī)模化發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)的指導作用有限。張介馳等[22]利用20 L 發(fā)酵罐進行通氣培養(yǎng)，跟蹤發(fā)酵過程中多項指標的變化規(guī)律，并通過加大通氣量、提高溶氧濃度的調控手段，有效抑制了發(fā)酵液中期pH 下降，該試驗結果表明，在發(fā)酵過程中，針對發(fā)酵醪變化采取相關調控措施，可以提高液體發(fā)酵水平。

1.3 外源物質影響研究

除營養(yǎng)及發(fā)酵條件外，外源添加物質也會影響菌絲生物量，甚至在延緩液體菌種老化的問題上也有獨特意義。根據(jù)張穎等[23]研究結果，刺五加水提液可明顯提高黑木耳菌絲生物量，添加量在1%時菌絲生物量達到最大。潘琴等[24]報道不同濃度的麻櫟木醋液對黑木耳菌絲生物量均起抑制作用，隨著麻櫟木醋液濃度的增加，菌絲生物量會出現(xiàn)不同程度的減少。說明不同外源添加物質會對菌絲生物量造成不同的影響。作為菌種使用的黑木耳液體發(fā)酵，不僅要菌絲生產效率高，同時也需要有較好的生物活性。許修宏等[25]研究不同營養(yǎng)物質對黑木耳液體菌種老化的影響發(fā)現(xiàn)，KH2PO4和維生素B1均能在延緩菌絲老化的同時促進菌絲生長，MgSO4能延緩菌絲老化但抑制菌絲生長，而過量蛋白胨會促進菌絲的老化及生長。該研究還發(fā)現(xiàn)，清除活性氧自由基相關酶的活性與菌絲老化具有顯著相關性，酶活性的提高能延緩菌絲老化。液體菌種老化是困擾多年的問題，該實驗結果為延緩菌種老化指明了新的研究方向。

1.4 獲取特定發(fā)酵產物研究

除了用于生產液體菌種，獲取特定的發(fā)酵產物也是開展黑木耳液體發(fā)酵研究的重要目的。黑木耳中含有多糖、黑色素、多肽、多酚、黃酮等多種活性物質，具有抗氧化性[26]、抗腫瘤[27]、抑菌抗病毒[28]、抗輻射[29]、提高免疫力[30]、改善肝損傷[31]、降血脂[32]等多種功效。從黑木耳子實體中提取活性物質是目前的主要途徑，然而與之相比，從黑木耳液體發(fā)酵菌絲體及發(fā)酵液中提取活性物質具有自動化控制、規(guī)模化生產、成本低、速度快等優(yōu)點。在這一方面，研究人員同樣關注于對液體發(fā)酵技術進行營養(yǎng)、條件優(yōu)化，但相比于制備液體菌種主要關注菌絲生物量及活力，液體發(fā)酵獲取發(fā)酵產物則更注重于通過誘導或優(yōu)化等手段提高黑色素、多糖等活性物質含量。

研究表明，活性物質的產量高低不僅與液體發(fā)酵時的營養(yǎng)條件有關，而且與所使用的菌株有關。李洋等[33]通過單因素及響應面實驗優(yōu)化得到黑木耳液體發(fā)酵產胞外多糖的最佳基質配方為：可溶性淀粉3%、胰蛋白胨0.15%、莎白瓜皮4%、紅景天10%，此配方下胞外多糖含量為0.024 51 g/mL。范秀芝等[34]以菌絲生物量和多糖產量為指標從22 個國家審定黑木耳品種中篩選出黑木耳2 號（國家審定編號：2007018）高產多糖菌株，其多糖含量達到1.239 g/L，是其他菌株的2 倍以上。

大量研究表明，活性物質含量也受外源物質影響。如，Sun 等[35]研究發(fā)現(xiàn)酵母提取物、乳糖和酪氨酸對黑色素合成有顯著影響，并首次證實酪氨酸能促進黑色素的合成。為提高黑色素濃度，該研究還對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，與未優(yōu)化的培養(yǎng)基相比，黑色素濃度提高了2.14 倍，達到2.97 g/L，同時還降低了成本。Wu 等[36]研究發(fā)現(xiàn)：1%甲醇、0.25%花生油、1.0%硬脂酸、0.5%棕櫚酸均能促進黑色素的合成，而Tween 80 則顯著抑制黑色素的合成。許哲祥等[37]發(fā)現(xiàn)刺五加、五味子兩種中草藥的添加量分別為4 g/L、3 g/L 時，能顯著促進發(fā)酵液中多糖含量的提高。

綜上所述，黑木耳液體發(fā)酵活性物質的產量受到營養(yǎng)物質、環(huán)境條件、菌株自身特性等多種因素的共同影響，關于哪種因素對某種活性物質產量的影響最大等問題，目前仍缺乏相應的研究。

1.5 黑木耳發(fā)酵飲料研究

黑木耳液體發(fā)酵能實現(xiàn)對硒、鐵、鋅、碘等微量元素進行富集，可以開發(fā)成富含微量元素的飲料、口服液、食品等，有利于人們在日常生活中攝入每天所必需的微量元素，避免因缺乏微量元素而導致的疾病，擁有健康的身體。目前黑木耳飲料多數(shù)仍由黑木耳子實體制備[38-41]，采用發(fā)酵液制作飲料雖起步較晚但也取得了一定的進展。使用液體發(fā)酵制作飲料時在添加營養(yǎng)源及外源物質時不僅要考慮菌絲及發(fā)酵液營養(yǎng)成分，更需要考慮發(fā)酵液的口感及安全性。

靳發(fā)彬等[42]將黑木耳液體發(fā)酵菌絲體經破壁勻漿處理后與蘋果汁按照一定比例混合均勻，研究木耳果醋的發(fā)酵工藝參數(shù)和口味調配，結果發(fā)現(xiàn)酒精發(fā)酵的最適條件為溫度30 ℃，酵母接種量0.02%，發(fā)酵時間5 天；醋酸發(fā)酵的最適條件為溫度35 ℃，接種量10%，起始pH 5.5。此條件下生產的發(fā)酵液，與蘋果汁、蜂蜜調配后生產的成品黑木耳醋酸飲料同時具有醋酸飲料特有的風味和黑木耳的獨特營養(yǎng)和藥理作用。黃賢剛[43]以黑木耳發(fā)酵液和濃縮蘋果汁為主要原料，通過正交實驗和響應面試驗對黑木耳液體深層發(fā)酵、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵的工藝進行了研究與優(yōu)化，得到黑木耳蘋果醋產品的最佳配方為黑木耳蘋果醋10%、濃縮蘋果汁40%、蔗糖10%。此配方下黑木耳蘋果醋色澤金黃，澄清透明，清香醇郁，酸甜可口，口感柔和，同時具有醋香及果香。李穎躍等[44]通過正交試驗優(yōu)化配方開發(fā)黑木耳茶菌飲料，結果以配方紅茶菌液25%、黑木耳發(fā)酵液40%、白砂糖8%、CMC（羧甲基纖維素）0.15%最佳，生產的該飲料色澤橘黃，風味獨特，口感細膩，同時兼有黑木耳和紅茶菌液的營養(yǎng)及保健價值。

除以上研究外，黑木耳發(fā)酵液也被應用于藥物開發(fā)領域。其中，郝敏等[45]以黑木耳液體發(fā)酵液中的產物為材料進行研究的結果表明，黑木耳胞外多糖具有促進小鼠腸道有益菌群增殖、增加短鏈脂肪酸含量及上調血清抗炎因子水平的作用，對調節(jié)腸道微生態(tài)平衡和免疫反應有重要作用，具有替代抗生素的潛在價值。竇會娟等[46]通過實驗證明黑木耳發(fā)酵液提取產物具有群體感應抑制作用，但不能抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成。目前雖然液體發(fā)酵制作飲料、藥物等已經取得一定的研究進展，但仍有化妝品、膳食補充劑等較多領域等待探索。

2 黑木耳液體發(fā)酵技術應用

黑木耳液體菌種研究報道最早在1983 年，萬國昌等[47]對黑木耳、香菇等六種食用菌液體菌種進行初步探究，結果表明液體菌種具有周期短、成本低等優(yōu)點，同時發(fā)現(xiàn)液體粘度與菌絲體數(shù)量成正相關，與菌絲體大小呈負相關。與固體菌種相比，液體菌種用于黑木耳栽培具有明顯的優(yōu)勢。1989—2022 年期間，陳惠群[48]、劉永昶[49]、王玲[50]、葉曉菊[51]、馮偉林[52]等諸多科研工作者研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳液體菌種接種后萌發(fā)快、生長點多，接種后的原種和栽培種培養(yǎng)周期縮短、基內菌絲菌齡一致性好、栽培出耳表現(xiàn)好。趙厚坤等[53]研究發(fā)現(xiàn)液體菌種接種的菌包滿袋時間比固體菌種的縮短10～15 天，平均每袋產量提高10 g左右。據(jù)王慶武等[54]研究結果，黑木耳液體菌種比木屑和枝條菌種的制種周期分別縮短34 天和31 天，滿袋時間分別縮短18 天和15 天。使用黑木耳液體菌種有利于縮短生產周期和提高生產效率，從而實現(xiàn)黑木耳菌包工廠化、規(guī)?；a。

黑木耳液體發(fā)酵技術主要應用于黑木耳菌包生產企業(yè)的液體菌種生產。據(jù)黑龍江省食用菌協(xié)同創(chuàng)新推廣體系統(tǒng)計，2021 年在黑木耳主產區(qū)黑龍江省，日產萬袋以上的規(guī)?；谀径a企業(yè)超過300家，其中22 家日生產能力超過10 萬袋的企業(yè)都在使用黑木耳液體菌種，大部分新建小型菌包生產企業(yè)也在使用液體菌種。黑木耳液體菌種生產一般采用800～1 000 L 通氣發(fā)酵罐，絕大部分行分批發(fā)酵、極少使用連續(xù)發(fā)酵。其他黑木耳產區(qū)的大型菌包生產企業(yè)也在使用黑木耳液體種，生產應用日趨穩(wěn)定成熟。據(jù)此估計，全國全年黑木耳液體菌種生產量可達60 000 m3，應用生產黑木耳菌包約30 億袋。

由于我國黑木耳產量大、分布廣，不同產地、季節(jié)和栽培模式生產的黑木耳產品質量參差不齊，部分黑木耳子實體被用來提取多糖、蛋白等功效物質，或者粉碎后制備顆粒飲料和沖劑，這在一定程度上限制了黑木耳液體發(fā)酵醪液中菌絲體和代謝產物應用于產品。目前，很多黑木耳液體發(fā)酵生產制備菌絲體、提取代謝產物和綜合利用發(fā)酵醪液的技術成果還停留在中試水平，少見大規(guī)模生產應用。

3 展望

液體發(fā)酵技術發(fā)展距今雖不到百年歷史，但隨著社會與科技的快速發(fā)展進步，液體發(fā)酵技術得以飛速發(fā)展和日趨完善，逐漸應用于多個領域。隨著食用菌產業(yè)整體的提升，黑木耳也受到較大關注，關于黑木耳液體發(fā)酵的研究也逐漸深入寬泛，取得了較多突破性的進展，但也存在生產應用中迫切需要解決的問題。黑木耳液體發(fā)酵制備液體菌種的研究目前大多數(shù)以搖瓶實驗為主，基于發(fā)酵罐生物反應器的研究偏少，還鮮見對通氣條件下的深層發(fā)酵開展深入研究，導致在生產規(guī)模放大時出現(xiàn)較大偏差。搖瓶試驗結果在影響傾向上可以提供有益借鑒，但還需要開展通氣發(fā)酵條件的優(yōu)化和實踐應用檢驗。與此同時，黑木耳液體發(fā)酵醪液作為菌種應用的活性質量等評價指標還不夠完善和準確，需要強化其與接種應用后實際生產效果的有效關聯(lián)，并在此基礎上建立實用的評價體系和簡便的檢測方法。

與固體基質栽培生產黑木耳子實體相比，液體發(fā)酵黑木耳在特定領域具有明顯的優(yōu)勢。隨著工業(yè)化信息化進程加速，黑木耳液體發(fā)酵的生產能力、生產效率和生產可控性必將逐步增強，在營養(yǎng)物質和功效物質生產提取方面具有巨大的潛在生產能力和發(fā)展空間。因此，有必要加強固體栽培和液體發(fā)酵生產黑木耳產品之間差異特性的比較研究，探索差異形成的生理機制，為更好地規(guī)?；瘧煤谀径后w發(fā)酵技術奠定理論基礎。