RNA藥物非病毒遞送系統(tǒng)研究進展

陳歡，魏利軍

（哈藥集團股份有限公司產(chǎn)品立項部 北京 100023）

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以及中心法則被發(fā)現(xiàn)后，人類就設(shè)想著通過對遺傳信息的干預(yù)來治療疾病。隨著遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，尤其是人類基因組測序工作完成后，疾病與基因之間的關(guān)系逐漸清晰，將遺傳物質(zhì)作為治療靶點已成為現(xiàn)實[1]。目前已上市核酸治療產(chǎn)品包括針對DNA的藥物或療法（含體外改變基因的細胞療法）、針對RNA的藥物以及核酸適配體。核酸藥物中與DNA有關(guān)的藥物分類眾多，涉及的技術(shù)領(lǐng)域龐雜?；贒NA的療法需要對遺傳物質(zhì)產(chǎn)生永久性變化，存在將外源性基因整合入患者基因組的風(fēng)險；另外，其需要進入細胞核才能發(fā)揮作用，提高了應(yīng)用難度。相對而言，RNA類藥物易于生產(chǎn)和遞送、具有較高的安全性，20余年來已取得了引人矚目的成果。本文主要針對RNA，包括反義寡核苷酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）、信使RNA（mRNA）以及微小RNA（miRNA）[2]的藥物遞送系統(tǒng)研究進展進行綜述。核酸適配體和CpG寡聚核苷酸通過特定結(jié)構(gòu)特征而非本身序列特征進行識別，不納入本綜述范圍。

自福米韋生于1998年上市以來，迄今共有15款針對RNA的藥物上市。近年來，隨著技術(shù)日趨成熟，此類藥物的發(fā)展明顯有加速趨勢。2015年前僅有3款藥物上市，而2018年至今不足4年時間，已先后有12款藥物上市。

RNA藥物的發(fā)展不限于技術(shù)的進步，其市場表現(xiàn)也相當亮眼。2016年上市的用于治療脊髓性肌萎縮的藥物諾西那生鈉（商品名：Spinraza）的年銷售額自2018年起已連續(xù)4年超過10億美元，成為本領(lǐng)域首個“重磅炸彈”級藥物。2020年，新冠病毒導(dǎo)致的全球疫情促使輝瑞/BioNTech合作開發(fā)的疫苗BNT162b2（商品名：Comirnaty）和Moderna開發(fā)的疫苗mRNA-1273（商品名：Spikevax）于當年12月相繼獲得FDA緊急使用授權(quán)，用于預(yù)防新冠病毒感染。財報顯示，Comirnaty和Spikevax在2021年全球總銷售額分別高達368億美元[3]和177億美元[4]。

根據(jù)沃森-克里克堿基配對規(guī)則，核酸藥物只需針對目標基因適當?shù)刂匦屡帕泻怂岬膲A基序列，就有望開發(fā)成具有生物特異性的藥物，避免了研發(fā)過程中的盲目性。在確定靶標序列后，優(yōu)化設(shè)計核酸藥物的序列篩選耗時也遠低于小分子化合物和抗體的篩選。相較于抗體藥物，核酸藥物不僅候選靶點更豐富，100個堿基以下的核酸藥物通?？梢赃M行化學(xué)合成，更容易保證批次間穩(wěn)定性和進行質(zhì)量控制。核酸藥物的獨特優(yōu)勢使其有望成為繼小分子和抗體之后的第三大類型藥物。

然而，核酸要進入體內(nèi)發(fā)揮作用卻要面對多重障礙：首先，核酸藥物易被血漿和組織中RNase酶降解，并易被腎臟快速清除；其次，核酸具有天然的免疫原性，進入體內(nèi)后易引起免疫反應(yīng)；另外，核酸藥物的相對分子質(zhì)量和負電荷讓其不能自由通過細胞膜；最后，核酸藥物進入細胞后易被“卡”在內(nèi)吞小體中無法發(fā)揮功能。所以，自核酸藥物誕生以來，其開發(fā)過程中的主要問題一直是如何有效地對其進行遞送[5]。

解決核酸藥物的遞送有2種思路，一種是對核酸結(jié)構(gòu)進行改造，使其性質(zhì)穩(wěn)定并躲避免疫系統(tǒng)的識別；另一種是利用藥物遞送系統(tǒng)。

不同于小分子化合物其藥理學(xué)和藥動學(xué)性質(zhì)均由分子結(jié)構(gòu)決定，核酸藥物的藥理學(xué)性質(zhì)更多地由核酸序列決定，而藥動學(xué)性質(zhì)更多地由化學(xué)修飾的骨架和配體決定。這使得可以在不改變核苷酸序列的前提下，對核酸藥物進行化學(xué)改造，從而對其藥動學(xué)性質(zhì)單獨進行優(yōu)化[6]。目前已有多種成功的修飾方案，如磷酸連接基團中的一個氧換成硫和糖環(huán)2位修飾等。改造核酸分子需要從多方面進行考慮，主要包括分子穩(wěn)定性、藥動學(xué)性質(zhì)、堿基配位親和力，以及避開免疫系統(tǒng)等。因為ASO、siRNA和mRNA等藥物都需要在各種酶[如核糖核酸酶（RNase）、Argonaute 2蛋白（Ago 2）和RNA聚合酶]的作用下才能發(fā)揮作用，還必須確保修飾后能夠被相關(guān)的功能酶所識別[7]。

化學(xué)修飾可以在一定程度上提高核酸藥物的化學(xué)穩(wěn)定性、降低免疫原性，但并不能完全解決其跨膜問題，多種針對核酸藥物的遞送系統(tǒng)應(yīng)運而生。遞送系統(tǒng)可以分為病毒載體和非病毒載體兩類，病毒載體一般使用基因修飾的病毒，如慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等，其遞送效率高并可以產(chǎn)生持續(xù)性的治療效果，而且可以將核酸藥物遞送至細胞核，這對于以DNA為靶點的藥物至關(guān)重要。病毒載體的主要劣勢在于其可能將病毒的基因組插入患者染色體，安全性存在爭議。另外，免疫原性、較小的包裝容量、高生產(chǎn)難度均在一定程度上限制了其使用[8]，目前大部分獲批上市的核酸治療藥物均采用非病毒載體。其中，使用度較高的有脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)、生物偶聯(lián)遞送系統(tǒng)以及外泌體（exosome）載體幾類。

1 脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)

基于脂質(zhì)的納米載體是核酸藥物遞送領(lǐng)域的研究熱點。脂質(zhì)本身即是細胞膜的主要成分，其易于與細胞膜的磷脂雙分子層相融合，可以提高納米載體的細胞攝入。而且，脂質(zhì)易于購買、生物相容性好、可生物降解，還可以通過化學(xué)修飾提高載體靶向性。目前研究涉及的脂質(zhì)納米載體包括脂質(zhì)復(fù)合物（lipoplex）、脂質(zhì)聚合物復(fù)合物（lipopolyplex）、層狀納米顆粒（layer-by-layer nanoparticle，LbLNP）、固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carrier，NLC），以及穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)粒子（stable nucleic acid-lipid particle，SNALP）等。

1.1 脂質(zhì)復(fù)合物

通過電性吸引將核酸藥物與陽離子脂質(zhì)[如溴化三甲基-2，3-二油酰氧基丙基銨（DOTAP）、氯化三甲基-2，3-二油烯氧基丙基銨（DOTMA）等]混合后直接形成脂質(zhì)復(fù)合物是最簡單的遞送思路。脂質(zhì)復(fù)合物的表面帶正電荷，便于結(jié)合帶負電荷的細胞膜繼而進入細胞[9]，但其在體內(nèi)環(huán)境中會不可避免地與帶負電荷生物大分子發(fā)生作用，導(dǎo)致帶負電荷的核酸藥物被置換從而發(fā)生泄漏，同時產(chǎn)生電荷相關(guān)的生理毒性[10]。另外，脂質(zhì)復(fù)合物劑型穩(wěn)定性不理想，需要在使用前即時配制。

1.2 脂質(zhì)聚合物復(fù)合物

脂質(zhì)聚合物復(fù)合物系將陽離子聚合物[如聚乙烯亞胺（PEI）、聚賴氨酸（PLL）、聚精氨酸、聚酰胺-胺樹形分子（PAMAM dendrimer）等]與核酸藥物形成的表面帶正電的聚合物復(fù)合物通過電性吸引包裹脂質(zhì)雙分子層得到，形成的納米顆粒表面基本不帶正電荷。相較于脂質(zhì)復(fù)合物，脂質(zhì)體聚合物復(fù)合物可以顯著提高遞送效率，且穩(wěn)定性明顯提高[11]。通過加入透明質(zhì)酸或肝素對復(fù)合物表面進行修飾，其免疫刺激性可進一步降低[12]。

1.3 層狀納米顆粒

層狀納米顆粒通過序列的電性作用將核酸藥物包裹進多層的納米顆粒。中心穩(wěn)定的納米核心及各層材料的選擇對相鄰層之間的吸附至關(guān)重要。Choi等[13]使用電負性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）顆粒作為核心，首先將聚精氨酸（poly-L-Arg）吸附至核心表面以產(chǎn)生帶正電荷的表面，再以電負性的siRNA進行覆蓋，再覆蓋一層帶正電荷的聚精氨酸，最后用偶聯(lián)了CD20抗體的帶負電荷的透明質(zhì)酸覆層。該多層納米顆粒最外層的負電荷層可以避免產(chǎn)生正電荷相關(guān)毒性，其在動物實驗中未見明顯的毒性。但層狀納米顆粒的材料選擇要求較高且制備工藝復(fù)雜、重現(xiàn)性差，限制了其應(yīng)用。

1.4 固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體

固體脂質(zhì)納米粒具有低熔點的固體陽離子脂質(zhì)核心，核酸藥物吸附于載體基質(zhì)表面，通過外圍的表面活性劑使之穩(wěn)定。但研究發(fā)現(xiàn)，SLN可能會隨著內(nèi)部固體脂質(zhì)晶體的逐漸生長導(dǎo)致藥物泄漏[14]。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體為其升級版本，在基質(zhì)中摻入少量的液體脂質(zhì)，降低了脂質(zhì)核心的結(jié)晶程度，不僅提高了載藥量，還具有更好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性[15]。由于固態(tài)脂質(zhì)核也可進行載藥，固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體可以對親脂性藥物進行遞送。使用固體脂質(zhì)納米粒對Bcl-2 siRNA和紫杉醇同時包載，體外結(jié)果顯示這2種藥物可以同時釋放[16]。

1.5 穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)粒子

SNALP是一種含有可離子化陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)納米粒（LNP），由可離子化脂質(zhì)、結(jié)構(gòu)脂質(zhì)、PEG脂質(zhì)及膽固醇組成，可有效阻止核酸藥物在內(nèi)源性環(huán)境中的降解，將藥物遞送至細胞內(nèi)[17]?；谄浼夹g(shù)和商業(yè)上的成功導(dǎo)致的巨大影響，許多文獻中的LNP均特指SNALP。目前，已有3個使用此類遞送系統(tǒng)的產(chǎn)品獲批上市，分別為阿尼拉姆公司開發(fā)的治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）的siRNA藥物patisiran（商品名：Onpattro），以及用于預(yù)防新冠病毒感染的mRNA疫苗Comirnaty和Spikevax。

可離子化陽離子脂質(zhì)的使用和微流控混合技術(shù)[18]的出現(xiàn)使得載藥顆粒的表面基本不帶電?？呻x子化陽離子脂質(zhì)在酸性條件下帶正電荷，而在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的環(huán)境中幾乎不帶電。脂質(zhì)納米粒制備時，在pH約4的條件下，通過快速混合脂質(zhì)的乙醇溶液和核酸的水溶液，可形成實心的脂質(zhì)顆粒。將其透析除去乙醇后，于近中性的水溶液中保存?zhèn)溆?，脂質(zhì)顆粒表面近中性[19]。

SNALP對肝細胞的高親和力通過載脂蛋白E（ApoE）實現(xiàn)。PEG脂質(zhì)解離后，ApoE可吸附在SNALP表面，形成高效靶向的配體，與肝細胞表面的脂蛋白受體結(jié)合，觸發(fā)胞飲而被內(nèi)攝[20]。SNALP通過胞飲進入靶細胞后，內(nèi)涵體膜上內(nèi)向的質(zhì)子泵作用導(dǎo)致內(nèi)涵體中的pH值降低?？呻x子化的陽離子脂質(zhì)逐漸被質(zhì)子化而帶正電荷，內(nèi)源性的陰離子脂質(zhì)與陽離子脂質(zhì)結(jié)合，形成錐形結(jié)構(gòu)，破壞雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致核酸藥物被釋放入胞質(zhì)，繼而發(fā)揮作用[21]。但研究顯示，內(nèi)涵體逃逸的時間窗口很短，只有很少一部分SNALP可以從內(nèi)涵體中逃逸，從而影響了藥效的發(fā)揮[22]。

目前，可離子化陽離子脂質(zhì)是SNALP研究的熱點。對其優(yōu)化可以獲得更好的治療效果。在Onpattro的研發(fā)過程中，通過不斷的優(yōu)化，在合成了300多種陽離子脂質(zhì)并進行試驗后，可離子化陽離子脂質(zhì)的優(yōu)選解離常數(shù)（pKa）為6.2 ～ 6.5左右。該pKa范圍既可以保證在內(nèi)涵體pH值下，大部分脂質(zhì)可被質(zhì)子化而與內(nèi)源的陰離子脂質(zhì)作用，導(dǎo)致內(nèi)涵體的破裂；同時又可以保證在循環(huán)系統(tǒng)中LNP表面基本不帶電荷，不被免疫系統(tǒng)清除。最終，Onpattro制劑中使用了DLinMC3DMA，其結(jié)構(gòu)與DLin-KC2-DMA接近，且pKa均為6.4，可以使治療效果提高10倍[19]。Spikevax和Comirnaty制劑中使用的可離子化陽離子脂質(zhì)分別為SM-102和ALC-0315。不同于DLinMC3DMA，二者在脂質(zhì)疏水性尾部中摻入了酯基結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的引入使脂質(zhì)能更快地在體內(nèi)代謝清除，提高了產(chǎn)品的耐受性。同時，二者分枝狀尾部的結(jié)構(gòu)設(shè)計使得在內(nèi)涵體逃逸過程中更易于形成錐形結(jié)構(gòu)，便于核酸藥物進入胞質(zhì)[23]。

在脂質(zhì)納米粒中加入PEG脂質(zhì)，可使SNALP大小在100 nm以下，其粒徑可進一步通過調(diào)整PEG脂質(zhì)和結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的比例實現(xiàn)。使用PEG脂質(zhì)的一個問題是其會抑制SNALP與ApoE的結(jié)合，從而影響其跨膜轉(zhuǎn)運。使用含有肉豆蔻基的PEG脂質(zhì)解決了該問題：在顆粒的形成和藥品儲存期間，此類脂質(zhì)會聚合于LNP表面；而在生理狀態(tài)下，其可以逐漸解離，從而形成無包裹的顆粒被細胞攝取[24]。目前已上市產(chǎn)品中，Onpattro使用的PEG脂質(zhì)為PEG2000-C-DMG，Spikevax和Comirnaty中使用的則分別是PEG2000-DMG和PEG2000-DTA（ALC-0159）。上述3個LNP產(chǎn)品由基本相同比例的4種脂質(zhì)組成，但含siRNA和mRNA的LNP中可電離脂質(zhì)氮與寡核苷酸磷酸的物質(zhì)的量的比值分別為3和6。由于含mRNA的LNP的上述比值明顯大于siRNA，二者形成的SNALP在結(jié)構(gòu)上存在一定差異。研究顯示，mRNA在SNALP中更靠近中心，而siRNA更靠近表面。而且，載mRNA的SNALP中會形成含有溶劑的小泡，且mRNA在小泡中可能會與帶正電荷的脂質(zhì)分離[25]。

SNALP通過一系列巧妙的設(shè)計獲得了商業(yè)上的成功，但其存在的問題也比較明顯。首先，其遞送效率有限，為達到治療效果需要較高的給藥劑量。但是，作為一種使用了多種脂質(zhì)輔料的注射劑，輔料的毒性不可忽視。另外，PEG脂質(zhì)被報道可引起超敏反應(yīng)，陽離子脂質(zhì)也具有一定的促炎性。例如，Onpattro在注射之前需要使用抗組胺藥和激素藥物控制[26]。隨著同樣靶向肝臟的更高效遞送系統(tǒng)——N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的出現(xiàn)，SNALP已逐漸退出siRNA遞送領(lǐng)域。但對于生物利用度更差、荷電更高的mRNA及CRISPR基因編輯藥物，LNP遞送系統(tǒng)目前仍是解決其遞送難題最有效的方式。

本文所述脂質(zhì)納米載體中，SNALP不論在技術(shù)還是商業(yè)上均最為成熟。脂質(zhì)聚合物復(fù)合物協(xié)同了脂質(zhì)復(fù)合物的高穩(wěn)定性、可接受的細胞攝入以及聚合物復(fù)合物粒徑均勻可控、高轉(zhuǎn)染效率、內(nèi)涵體逃逸的優(yōu)勢，也是目前研究較為集中的一類載體，但由其聚合物低生物相容性引發(fā)的細胞毒性仍是阻礙其進一步發(fā)展的主要原因。隨著對脂質(zhì)納米載體生物學(xué)功能、其發(fā)揮作用關(guān)鍵限速步驟的深入研究和逐步理解，很有可能會出現(xiàn)進一步完善的藥用材料或納米顆粒形式[11,27]。

2 生物偶聯(lián)遞送系統(tǒng)

目前已上市的基于生物偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的產(chǎn)品使用的均為GalNAc偶聯(lián)遞送系統(tǒng)。人類去唾液酸糖蛋 白 受 體（aslaloglyeoprotein receptor，ASGPR）主要表達在肝實質(zhì)細胞中，人體肝實質(zhì)細胞表達的ASGPR數(shù)量約為50萬個。GalNAc可與ASGPR發(fā)生特異性結(jié)合，利用此特性可以將GalNAc與核酸藥物偶聯(lián)并進行肝臟靶向遞送。GalNAc偶聯(lián)物與ASGPR結(jié)合后，通過細胞內(nèi)吞作用進入內(nèi)涵體，隨著內(nèi)涵體成熟過程中伴隨的酸化，GalNAc偶聯(lián)物與ASGPR解離，GalNAc在溶酶體中降解從而將核酸藥物帶入細胞內(nèi)，ASGPR重新循環(huán)至肝細胞表面。GalNAc偶聯(lián)物的遞送非常高效，ASGPR單次循環(huán)時間約15 min，1個ASGPR可以循環(huán)使用約200次[5,28-29]。由于肝臟的血流量大且含有有孔內(nèi)皮，注射1次偶聯(lián)藥物后可以充分攝取并維持數(shù)月的效果。

GalNAc-siRNA通過細胞表面的ASGPR被網(wǎng)格蛋白包被小泡攝入，轉(zhuǎn)運至內(nèi)涵體。隨著核內(nèi)涵體pH值 降 低，GalNAc-siRNA從ASGPR釋 放，ASGPR循環(huán)至細胞表面。GalNAc-siRNA一直存在于成熟的內(nèi)涵體中。盡管攝取和遞送至內(nèi)涵體較快，但研究顯示，在內(nèi)涵體中只有不到0.01%的GalNAc-siRNA進入胞質(zhì)[5]。因此，內(nèi)涵體逃逸是此種遞送方式的限速步驟。

目前主要有2種策略用于多價GalNAc共軛物的合成。一種是在固相載體上預(yù)組裝一個多價GalNAc配體，而后與核酸藥物連接，阿尼拉姆的產(chǎn)品開發(fā)即基于此種策略[30]?；跇渲罘肿庸羌艿腉alNAc配體與ASGR的親和力取決于糖基的結(jié)構(gòu)、數(shù)量，以及糖基和樹枝狀結(jié)構(gòu)分支點之間間隔子的疏水性和長度。ASGPR對末端GalNAc的親和力比半乳糖高大約50倍；當間隔子長度為2 nm時，共軛物對核酸的轉(zhuǎn)運效果最好；三觸角和四觸角GalNAc設(shè)計相對于其他設(shè)計更加有效[31]。另一種則是在固相合成寡聚核苷酸的過程中基于單價GalNAc亞磷酰胺的多步摻入。該方法允許更靈活的設(shè)計和價位，而且合成步驟更少，其可以快速驗證不同設(shè)計策略及連接子[32]。使用線性多價聚合策略，Dicerna公司開發(fā)了基于GalXC平臺的siRNA藥物。在該獨特平臺上，折疊的四核苷酸環(huán)結(jié)構(gòu)用于連接siRNA的2條鏈。每個核苷酸上通過2'位連接1個GalNAc，可最多接4個GalNAc。

使用LNP遞送系統(tǒng)的第1個核酸藥物Onpattro上市后，阿尼拉姆公司卻并沒有將其已相對成熟的LNP技術(shù)用于其他核酸藥物的遞送，而是將研發(fā)重點轉(zhuǎn)向GalNAc偶聯(lián)遞送系統(tǒng)。一方面，這是由于阿尼拉姆并不獨立擁有LNP遞送平臺的知識產(chǎn)權(quán)，該平臺的大部分專利技術(shù)由外部授權(quán)獲得。但更主要的原因在于GalNAc偶聯(lián)核酸藥物更好的市場前景。以治療hATTR的藥物vutrisiran（商品名：Amvuttra）為例，其相較于Onpattro的靜脈注射，使用皮下注射的給藥方式；相較于Onpattro每3周1次的給藥頻率，vutrisiran給藥頻率降至每3個月1次，具有明顯的優(yōu)勢。在一項名為HELIOS-A的Ⅲ期臨床研究中，與安慰劑組相比，vutrisiran組患者主要評價指標呈統(tǒng)計學(xué)顯著性改善。相對于patisiran對照組，vutrisiran組實現(xiàn)了血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）水平的快速和持續(xù)降低，較基線平均降低88%，達到非劣效性標準[33]。目前，全球已有5個使用GalNAc偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的siRNA藥物上市，均由阿尼拉姆公司開發(fā)，分別為治療急性肝卟啉癥（AHP）的givosiran（商品名：Givlaari）、治療原發(fā)性高膽固醇血癥的inclisiran（商品名：Leqvio）、治療原發(fā)性高草酸尿癥1型（PH1）的lumasiran（商品名：Oxlumo），以及上述治療hATTR的藥物vutrisiran。

由于GalNAc偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的高靶向性，此前使用直接給藥的ASO類產(chǎn)品目前亦開始使用此類技術(shù)遞送。研究顯示，未偶聯(lián)的ASO主要（高于70%）被肝臟的非實質(zhì)細胞攝取，而使用三觸角GalNAc樹枝狀結(jié)構(gòu)偶聯(lián)的ASO則大部分被遞送至肝實質(zhì)細胞。此種遞送結(jié)果的變化導(dǎo)致體內(nèi)藥效提升約60倍[34]。目前Ionis公司已有多個使用GalNAc偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的ASO類藥物進入臨床。

不同于LNP由藥用輔料引起的毒性，GalNAc偶聯(lián)藥物的主要副作用在于其肝毒性。這主要來源于其寡聚核苷酸及代謝物在細胞內(nèi)的積聚以及其引發(fā)的脫靶效應(yīng)[35]。隨著GalNAc偶聯(lián)物有效性的提高，如何降低其副作用已成為近期的研究熱點。

研究人員通過鎖核酸（LNA）技術(shù)修飾的寡核苷酸來控制GalNAc-siRNA的作用持續(xù)時間。REVERSIR是一種與siRNA種子區(qū)互補的LNA修飾的寡核苷酸，與GalNAc-siRNA具有高結(jié)合力，1次皮下注射TTR-siRNA對應(yīng)的REVERSIR后可在小鼠中逆轉(zhuǎn)TTR-siRNA引起的反應(yīng)，從而控制TTR-siRNA作用的時間[36]。乙二醇核酸（glycol nucleic acid，GNA）是一種非環(huán)核酸，采用GNA修飾的核酸結(jié)合力明顯低于天然核酸。在siRNA的反義鏈的7位和8位（種子區(qū)）進行GNA修飾可以在不削弱活性的基礎(chǔ)上降低脫靶效應(yīng)[37]?；旌瞎羌埽╩ixed backbone，MBB）即將硫代磷酸骨架部分替換回正常的磷酸骨架。MBB-ASO的設(shè)計具有降低ASO與特定細胞蛋白結(jié)合引起的不依賴于雜交的毒性的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，相對于全PS設(shè)計，GalNAc共軛的MBB-ASO表現(xiàn)出相似或提升的活性，這為同時降低毒性和提升活性的化學(xué)設(shè)計提供了另一種思路[38]。

目前，生物偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的研究已擴展到了肝臟外的其他組織，偶聯(lián)配體包括脂質(zhì)、多肽、抗體，以及核酸適配體，多項研究已取得令人鼓舞的結(jié)果。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體（GLP-1R）在胰腺β細胞上表達，使用GLP-1R偶聯(lián)ASO在體內(nèi)和體外均能成功地將ASO遞送到胰腺β細胞，且沒有影響肝臟和其他組織中相關(guān)的基因的表達，具有較好的組織和細胞選擇性[39]。轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種可結(jié)合鐵離子的糖蛋白，其通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR，也稱CD71，顯著表達于骨骼肌和心肌中）將鐵離子轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)。將抗CD71抗體的Fab段直接與修飾后的靶向肌肉生長抑制素的siRNA偶聯(lián)，對小鼠靜脈注射給藥后，其在心肌和骨骼肌中均顯示出沉默效果[40]。膽固醇偶聯(lián)的siRNA已被用于沉默肝臟中編碼Apolipoprotein B的mRNA[41]以及小鼠骨骼肌中編碼myostatin的mRNA[42]。HIV轉(zhuǎn) 錄 激 活 蛋 白（trans-activator protein，Tat）是一種細胞穿透肽，可運載外源性物質(zhì)進入細胞，其與siRNA偶聯(lián)后可顯著提高siRNA的遞送能力[43]。

3 外泌體載體

外泌體是細胞外囊泡中最小的一類，大小約40 ～ 150 nm，是由細胞內(nèi)多泡體（multivesicular body，MVB）與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質(zhì)中的膜性囊泡。研究發(fā)現(xiàn)，機體內(nèi)大多數(shù)細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。外泌體攜帶有宿主細胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等物質(zhì)，可以被目標細胞自然吸收，是細胞間信息交換和物質(zhì)運輸?shù)拿浇?。外泌體結(jié)構(gòu)類似于單層脂質(zhì)體，含有圍繞于水性核的兩親性脂質(zhì)雙分子層。目前已在外泌體中發(fā)現(xiàn)的核酸類物質(zhì)包括mRNA、miRNA及病毒RNA、tRNA等多種RNA[44]。

作為天然的細胞間信息載體，外泌體較人工遞送載體具有明顯的優(yōu)勢。首先，外泌體的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)和較小的尺寸使其可以跨過包括血腦屏障在內(nèi)的主要的生物屏障。其次，外泌體生物相容性好，不會引起免疫反應(yīng)。再次，相比于脂質(zhì)對親水性物質(zhì)較低的包封率，外泌體的包裝效率顯著提升。最后，不同來源的外泌體對受體細胞的選擇性不同，通過選擇合適來源的外泌體，可使其成為高選擇性的遞送工具。相比于目前已較為成熟的LNP和GalNAc偶聯(lián)遞送系統(tǒng)，外泌體在非肝靶向的核酸藥物遞送方面具有良好的應(yīng)用潛力[45]。

目前尚無上市的外泌體產(chǎn)品，但許多關(guān)于核酸藥物外泌體遞送的研究已取得令人鼓舞的成績，其遞送的核酸藥物包括siRNA、miRNA、mRNA等。Wahlgren等[46]將外源性絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）siRNA導(dǎo)入不同的人源血漿外泌體中，發(fā)現(xiàn)外泌體可將siRNA遞送至人單核細胞，并引發(fā)MAPK-1基因沉默。Munoz等[47]發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞的方法，使外泌體載有抗miRNA-9寡核苷酸（anti-miR-9）后，可通過外泌體向多形性膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）細胞傳遞anti-miR-9。Tsai等[48]將編碼SARS-CoV-2刺突蛋白和核殼體蛋白的mRNA載入外泌體，進行肌肉注射后，發(fā)現(xiàn)該外泌體可誘導(dǎo)小鼠對二者持久的體液和細胞免疫。

目前，已有多個外泌體產(chǎn)品進入臨床研究階段[49]。在一項臨床試驗（NCT03608631）中，含有靶向KrasG12D突變基因的siRNA的間充質(zhì)干細胞外泌體正被用于治療胰腺癌。而伊斯法罕醫(yī)科大學(xué)的臨床研究（NCT03384433）正在探索攜帶miR-124的間充質(zhì)干細胞外泌體對缺血性心臟病的治療作用。Codiak BioSciences發(fā)現(xiàn)了2種高度豐富的外泌體蛋白PTGFRN和BASP1，使用這些蛋白質(zhì)作為支架可將感興趣的治療性分子引導(dǎo)到外泌體的表面或內(nèi)腔。其表面荷載ASO的外泌體療法exoASOSTAT6可選擇性靶向腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）并精確破壞STAT6信號傳導(dǎo)，在癌癥模型動物中產(chǎn)生顯著的抗腫瘤活性[50]。目前在該領(lǐng)域已涌現(xiàn)出一批創(chuàng)新型公司，如Codiak BioSciences、EVOX Therapeutics、Tavec Pharmaceuticals、Carmine Therapeutics、Anjarium and Micromedmark Biotech等；而如羅氏、禮來、武田等大型跨國藥企則通過與之合作，進入了這條賽道。

將核酸藥物載入外泌體的方法主要分為2類。一類先通過適當手段對外泌體進行純化，再將核酸藥物負載到純化后的外泌體，如電穿孔法、孵育法、超聲法等。此類方法相對簡單，但裝載效率低且不易控制。由于母細胞及外泌體類型的不同，即使相同裝載方法的裝載效率也會存在較大的差異，而且載入過程中可能會破壞膜蛋白的天然生理功能。據(jù)報道，電穿孔法可能會引起外泌體及siRNA的聚集。另一類則通過對產(chǎn)生外泌體的母細胞進行轉(zhuǎn)染，使其直接產(chǎn)生包含核酸藥物的外泌體。使用該方法除裝載目標藥物外，還可以對外泌體表面結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，使其具有更好的靶向性。已有多項研究成功使用該方法將母細胞中的miRNA高表達后轉(zhuǎn)染至外泌體，未來該方法可能成為外泌體裝載核酸藥物的主流選擇[51]。

盡管外泌體作為藥物遞送載體優(yōu)勢明顯，其臨床應(yīng)用目前仍存在諸多需要克服的障礙，如外泌體的純化、分析、規(guī)?；a(chǎn)，以及核酸藥物（尤其是相對分子質(zhì)量較大的mRNA）的載入、外泌體進入靶細胞后如何避免溶酶體降解等[52]。

4 結(jié)語

經(jīng)過近半個世紀的積累，遞送技術(shù)逐漸成熟，使核酸藥物進入了快速增長期。核酸藥物在治療遺傳性疾病方面具有天然優(yōu)勢，為眾多罕見病患者提供了寶貴的治療機會。用于治療成人原發(fā)性高膽固醇血癥或混合性血脂異常的siRNA藥物inclisiran的獲批標志著核酸藥物在技術(shù)上已逐漸獲得了監(jiān)管機構(gòu)的進一步認可，進入了對安全性要求高但市場更為廣闊的慢病領(lǐng)域。核酸藥物遞送技術(shù)的發(fā)展呈現(xiàn)出平臺化的特點，在遞送技術(shù)相對成熟后，基于相同技術(shù)平臺開發(fā)類似藥物的速度會明顯加快。借助前期脂質(zhì)納米粒的技術(shù)沉淀，Moderna公司的mRNA新冠疫苗從疫苗序列選擇設(shè)計完成到首次人體給藥，合計僅耗時63 d，展現(xiàn)了超乎以往想象的效率[53]?？梢灶A(yù)見，已有的技術(shù)平臺未來也非常有希望應(yīng)用于體內(nèi)基因編輯等新的治療領(lǐng)域。

同時，核酸藥物的遞送仍面臨眾多技術(shù)挑戰(zhàn)。如何進一步提高遞送效率、降低遞送系統(tǒng)的毒性、實現(xiàn)對其他肝臟外組織和器官的特異性遞送將是該領(lǐng)域的研究熱點。伴隨著對核酸體內(nèi)作用機制和相關(guān)疾病認識的進一步深入，核酸藥物遞送系統(tǒng)必將迎來新的突破和發(fā)展，助力于提供安全有效的個性化治療方案，使更多患者受益。