環(huán)黃芪醇對端粒功能障礙疾病的藥理作用及其機制研究進展

何夢婷，車浩潔，王惠芳，李婷，李綠洲，王進欣

（中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 211198）

中藥材黃芪最早被記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，黃芪甲苷Ⅳ（astragaloside IV，AS-IV，1）是黃芪的主要活性成分之一，且作為黃芪的質(zhì)量控制指標被列入中國和歐洲藥典。皂苷元環(huán)黃芪醇（cycloastragenol，CAG，2）由AS-IV水解得到，也可從豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根中直接提取分離，CAG和AS-IV具有類似的藥理作用[1]。

CAG是目前天然產(chǎn)物中唯一被報道的端粒酶激活劑，能有效對抗端?？s短，具有抗衰老、抗凋亡、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)、促進細胞增殖和傷口愈合等藥理作用，從而對端粒功能障礙相關(guān)疾病具有潛在治療效果（見圖1）[2]。本文重點總結(jié)CAG治療端粒功能障礙相關(guān)疾病的藥理作用及相關(guān)機制研 究進展。

圖1 環(huán)黃芪醇治療端粒功能障礙相關(guān)疾病的機制Figure 1 Mechanism of cycloastragenol in the treatment of telomere dysfunction related diseases

1 環(huán)黃芪醇的相關(guān)特性及其活性

1.1 環(huán)黃芪醇的理化性質(zhì)

CAG是四環(huán)三萜類中的環(huán)阿屯烷型，由AS-IV的2個糖苷鍵斷裂得到。相比于AS-IV，CAG的脂溶性增強，更易透過細胞膜而被吸收；但其水溶性較差，口服生物利用度較低[3]。此外，CAG的結(jié)構(gòu)中含有環(huán)丙烷基團，其耐酸性較差，在酸性條件下可轉(zhuǎn)化為黃芪醇（astragenol，AG，3）[4]。

1.2 環(huán)黃芪醇的藥代動力學

2010年，Zhu等[5]使用Caco-2細胞模型和肝微粒體對CAG的腸道吸收和代謝進行了初步研究，結(jié)果顯示：CAG以被動擴散的運輸方式快速通過Caco-2細胞單層，同時檢測到CAG的4種不同葡糖苷酸結(jié)合物和2種氧化的代謝產(chǎn)物，提示CAG通過腸上皮時可能發(fā)生首過代謝；此外，CAG在大鼠和人肝微粒體中孵育30 min后分別僅剩17.4%和8.2%，由此可見，CAG會在體內(nèi)發(fā)生快速代謝。

Ma等[6]通過大鼠經(jīng)口給藥或靜脈注射實驗對CAG的藥代動力學、代謝和排泄進行了進一步的研究，結(jié)果表明，以10 mg · kg-1劑量口服給予CAG時，生物利用度僅為25.7%；課題組通過LC-MS方法鑒定CAG代謝產(chǎn)物，僅發(fā)現(xiàn)CAG的肝Ⅰ期代謝產(chǎn)物，并無Ⅱ期代謝產(chǎn)物。雖然CAG可以有效通過腸上皮吸收，但由于廣泛的肝Ⅰ期代謝，CAG口服生物利用度較低。

1.3 環(huán)黃芪醇的生物活性

CAG具有抗衰老、抗炎、抗菌、抗氧化應激、肝臟保護和內(nèi)皮保護等良好的生物活性[2]。近年來，研究者們通過體內(nèi)外實驗對CAG的藥理作用進行了廣泛研究。研究發(fā)現(xiàn)，CAG對銀屑病樣皮膚炎癥、肺纖維化、腹主動脈瘤、胃癌、非酒精性脂肪肝等疾病具有一定的治療潛力[7-11]。在心血管系統(tǒng)疾病治療中，CAG被發(fā)現(xiàn)對心力衰竭、心肌纖維化、心肌梗死等有預防和治療作用[12-14]。此外，CAG對神經(jīng)與精神類疾病同樣有較好的療效，例如抑郁癥、阿爾茨海默病、缺血性腦損傷等[15-17]。

基于多種生物活性，CAG有望成為眾多疾病的潛在治療藥物。值得一提的是，CAG與紫杉醇聯(lián)合給藥可以減輕紫杉醇治療胃癌時產(chǎn)生的毒副作用[10]。聯(lián)合用藥可以在維持藥效作用的同時降低毒性，已成為天然產(chǎn)物相關(guān)新藥研發(fā)的新方向。

2 端粒、端粒酶與端粒功能障礙相關(guān)疾病

2.1 端粒和端粒酶

1938年，Muller[18]首先發(fā)現(xiàn)染色體末端存在的獨特結(jié)構(gòu)，并以希臘語“telos”將這段特殊染色體結(jié)構(gòu)命名為“端?！?。1941年，McClintock[19]發(fā)現(xiàn)有絲分裂時部分染色體出現(xiàn)丟失，導致染色體復制不完全，從而推斷端粒的存在可以保護染色體末端不被降解或融合。隨著研究的深入，人們對端粒的認知越來越明確：端粒位于真核生物染色體末端，由一段TTAGGG重復堿基序列和相關(guān)蛋白組成[20]。

端粒酶的發(fā)現(xiàn)比端粒晚了近50年。1985年，Greider等[21]首次發(fā)現(xiàn)了端粒酶，且這種新發(fā)現(xiàn)的酶能將DNA重復序列添加到染色體末端，以此來維持端粒長度。端粒酶是一種核糖核蛋白復合物，其催化核心包括TERT和TERC，其中TERT是調(diào)節(jié)端粒酶活性的關(guān)鍵[22]。

端粒長度隨著細胞分裂而不斷縮短，當達到臨界值時，會誘發(fā)DNA損傷信號，導致細胞周期縮短并引發(fā)一系列以短端粒為特征的組織衰竭疾病[23-24]。而端粒酶的活性隨著年齡的增長出現(xiàn)降低，因此迫切需要研發(fā)具有端粒酶激活作用的新型藥物[25]。

2.2 端粒功能障礙相關(guān)疾病

通常在人類血液淋巴細胞中測量的平均端粒長度被認為是衰老、存活和死亡率的生物標志物[25]。端粒酶活性在延長體細胞壽命方面發(fā)揮著重要作用，極短的端粒會引發(fā)衰老最終導致細胞死亡[26]。越來越多的研究者對端粒與相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)進行了深入研究。

第一種被發(fā)現(xiàn)與人類端粒酶突變相關(guān)的疾病是先天性角化不良[27]。1999年，Mitchell等[28]在患有罕見的多系統(tǒng)疾病即先天性角化不良的患者中，觀察到短端粒。根據(jù)這項發(fā)現(xiàn)，Vulliamy等[29]進一步提出，先天性角化不良患者的TERC和TERT發(fā)生突變。此外，Vulliamy等[30-31]還在再生障礙性貧血和其他骨髓衰竭癥患者中發(fā)現(xiàn)TERC和TERT突變。

2007年的流行病學調(diào)查表明，短端粒長度與心血管疾病及其死亡率密切相關(guān)[32]。2011年，Huzen等[33]在內(nèi)皮細胞和動脈粥樣硬化的動脈壁中觀察到較短的端粒。2012年，Armanios[34]總結(jié)了短端粒誘發(fā)的特發(fā)性肺纖維化和肝纖維化等多種疾病。2016年，Yeh等[26]發(fā)現(xiàn)端粒酶的活性受到抑制時會導致卒中、急性心肌梗死、心力衰竭以及心臟性猝死等心血管疾病。同年，Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)慢性炎癥與端?？s短相關(guān)，而炎癥和氧化應激會進一步加速神經(jīng)退行性疾病以及心血管疾病的進展。

2011年，Saeed等[36]通過實驗發(fā)現(xiàn)，端粒酶缺失的小鼠會出現(xiàn)成骨細胞分化缺陷，從而促進破骨細胞形成，導致年齡相關(guān)的骨量減少，表現(xiàn)出骨質(zhì)疏松等癥狀。此外，多項研究發(fā)現(xiàn)，端?？s短與自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、斯耶格倫綜合征、肉芽腫病、硬皮病、脊椎關(guān)節(jié)炎以及類風濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)[37-38]。

端粒和端粒酶對人類來說至關(guān)重要，端粒的缺失或端粒酶活性的降低都會引發(fā)一系列疾病，開發(fā)以端粒酶為靶標的藥物對于端粒功能障礙相關(guān)疾病的預防或治療有著重要意義。

3 環(huán)黃芪醇激活端粒酶的機制

研究表明，多種信號通路參與了端粒酶活性的調(diào)節(jié)，例如，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路和磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，PKB）級聯(lián)反應信號通路等[39-41]。PKB通過催化TERT的磷酸化參與端粒酶的激活，可增強組織修復和再生過程[40]。此外，表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）通過激活Ras/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）激酶（ERK kinase，MEK）/ERK通路和Ets因子，從而上調(diào)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）表達，hTERT通過在端粒DNA 3'端添加短的重復TTAGGG序列來擴展DNA，進而延長端粒長度[41]。

Yung等[42]研究了CAG和參與端粒酶活性調(diào)節(jié)的信號通路之間的關(guān)系，從而明確CAG激活端粒酶的信號轉(zhuǎn)導機制：CAG可以增強人胚胎腎HEK293成纖維細胞中的端粒酶活性，但未在細胞中檢測到Ca2+、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、肌醇磷酸（PI3）表達水平和AKT磷酸化的變化，推測CAG對端粒酶作用的影響與經(jīng)典的第二信使途徑或PI3K/AKT信號通路無關(guān)；在對MAPK信號通路進行研究時，發(fā)現(xiàn)CAG可以誘導ERK磷酸化。

該課題組使用不同抑制劑進行藥理實驗，進一步探討CAG誘導ERK磷酸化的機制，結(jié)果顯示，MEK1/2抑 制 劑PD98059和U0126、EGF受體（EGFR）抑 制 劑AG1478和c-Src抑 制 劑PP2顯著減弱了CAG誘導的ERK磷酸化；CAG可使c-Src蛋白的845位酪氨酸發(fā)生磷酸化，進而激活EGFR，隨后激活Ras/MEK/ERK信號通路；CAG通過誘導ERK磷酸化激活Ets轉(zhuǎn)錄因子（Ets2和ER81），進而上調(diào)hTERT基因表達，起到激活端粒酶的作用（見圖2）[42]。

圖2 環(huán)黃芪醇激活端粒酶的作用機制Figure 2 Mechanism of telomerase activation by cycloastragenol

然而，CAG對各類疾病的潛在作用機制稍有不同，以下將具體介紹CAG在端粒功能障礙相關(guān)疾病中激活端粒酶的作用機制以及CAG激活端粒酶產(chǎn)生的藥理作用。

4 環(huán)黃芪醇在端粒功能障礙相關(guān)疾病中的作用 研究

4.1 細胞衰老相關(guān)疾病

DNA損傷和端粒磨損的積累會導致組織和器官中衰老細胞的增加，導致細胞功能退化，進而引發(fā)一系列與細胞衰老相關(guān)的疾病，例如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、常染色體顯性角化不良癥、X連鎖型先天性角化不良癥等[43-47]。CAG被發(fā)現(xiàn)具有抗細胞衰老及抗細胞凋亡的作用[1]。

2013年，Molgora等[48]評估了CAG延緩人T細胞衰老的功能。課題組通過CAG刺激健康供體純化的T細胞，觀察到CAG處理后細胞的端粒酶活性明顯增強且T細胞顯著增殖，而具有衰老表型的T細胞比例出現(xiàn)下降；且他們通過實驗發(fā)現(xiàn)，MAPK抑制劑減弱了CAG誘導的端粒酶活性，表明CAG激活端粒酶有可能通過MAPK途徑介導。2016年，Dow等[49]評估了CAG對早期年齡相關(guān)性黃斑變性的治療作用。38名患者口服CAG后黃斑功能顯著改善；在顯微視野觀察到CAG通過激活端粒酶，將端粒DNA添加到視網(wǎng)膜色素上皮染色體末端，延緩相應的細胞衰老，起到治療黃斑變性的作用。2021年，Xu等[50]發(fā)現(xiàn)CAG通過激活培養(yǎng)的牛顆粒細胞中的TERT，顯著抑制D-半乳糖誘導的細胞衰老和凋亡，且增強β-Klotho蛋白表達，從而抑制與年齡相關(guān)的卵母細胞質(zhì)量下降，具有改善低生育率的潛在作用。

4.2 糖尿病并發(fā)癥

難治性傷口愈合是糖尿病的并發(fā)癥，傷口愈合過程涉及炎癥反應、凝血、上皮再生、新生血管形成以及傷口閉合，表皮干細胞（epidermal stem cell，EpSC）被認為是傷口愈合的重要組成部分，而端粒功能障礙會導致EpSC增殖和遷移能力下降，從而延遲傷口愈合[51-52]。Cao等[53]于2019年通過人表皮干細胞實驗，證實CAG通過上調(diào)TERT的表達促進EpSC的增殖和遷移能力，且進一步發(fā)現(xiàn)CAG可以通過激活Wnt/β-catenin通路協(xié)同TERT表達，最終發(fā)揮對糖尿病傷口愈合的促進作用。

糖尿病患者體內(nèi)的高葡萄糖（high-glucose，HG）濃度可能誘導椎間盤細胞衰老、凋亡和異常的基質(zhì)代謝[54]。端粒的縮短會惡化椎間盤，研究發(fā)現(xiàn)端粒酶是椎間盤退行性變的潛在治療靶點[55]。2021年，Hong等[56]通過HG誘導的大鼠原發(fā)性髓核細胞（nucleus pulposus cell，NPC）應激模型觀察了CAG對衰老、凋亡、端粒和端粒酶的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，CAG減緩了HG誘導的細胞活力下降趨勢，明顯提高了NPC的生存能力；研究還發(fā)現(xiàn)，CAG通過抑制凋亡相關(guān)蛋白和活性氧的生成增強TERT表達，抑制NPC細胞衰老和凋亡，進而在預防HG介導的椎間盤退行性病變方面發(fā)揮作用。

4.3 神經(jīng)退行性疾病

端粒酶在大腦發(fā)育中具有重要作用，與神經(jīng)退行性疾病也有密切關(guān)聯(lián)，端粒長度被作為抑郁癥、精神分裂癥、阿爾茨海默病以及癡呆癥中認知能力下降等的生物標志[57-59]。

新生兒缺氧缺血性腦病造成遠期神經(jīng)系統(tǒng)損害，是新生兒期常見的疾病。Meng等[60]選用氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）的大鼠神經(jīng)干細胞模型，探討了端粒酶激活對缺血缺氧神經(jīng)干細胞狀態(tài)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，CAG通過上調(diào)TERT表達水平，減少活化后的caspase-3和凋亡相關(guān)蛋白表達，從而促進細胞增殖、減少細胞死亡且增加神經(jīng)干細胞數(shù)目和存活率，對缺氧缺血后腦損傷具有潛在治療效果。

Ip等[15]首次證明CAG表現(xiàn)出抗抑郁作用。該課題組發(fā)現(xiàn)，CAG通過激活神經(jīng)元細胞中的CREB信號通路誘導TERT表達，發(fā)揮端粒酶激活功能，并且促進細胞存活和調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的TERT和bcl2基因表達，提示CAG對抑郁癥具有潛在治療作用。

4.4 特發(fā)性肺纖維化

特發(fā)性肺纖維化是復發(fā)性肺泡損傷后異常的傷口愈合反應，成為肺端粒功能障礙最常見的表現(xiàn)[34,61]。2013年，Le Saux等[62]通過博來霉素誘導的特發(fā)性肺纖維化小鼠模型，發(fā)現(xiàn)CAG通過激活肺組織中的端粒酶和延長端粒長度，減緩博來霉素損傷肺的肺泡上皮細胞的衰老，從而減弱肺部纖維化表型的發(fā)展；端粒酶抑制劑GRN163L可減弱CAG的作用，提示CAG抑制特發(fā)性肺纖維化的活性取決于其激活端粒酶的能力。

4.5 骨質(zhì)疏松癥

長期使用糖皮質(zhì)激素會對骨骼產(chǎn)生嚴重的副作用，最終誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥[63]。端粒酶活性降低和端?？s短會導致骨形成障礙，加速骨細胞受損和骨量減少，而端粒酶的激活可以促進成骨細胞分 化[36,64]。2020年，Wu等[65]通 過 在 地 塞 米 松（dexamethasone，DEX）處 理 的MC3T3-E1細 胞中進行的實驗發(fā)現(xiàn)，CAG可以上調(diào)骨損傷細胞的TERT表達水平，增加堿性磷酸酶活性，從而促進成骨細胞分化，同時可以緩解DEX對成骨細胞分化的抑制作用；此外，課題組發(fā)現(xiàn)端粒酶抑制劑TMPyP4會抑制CAG作用的發(fā)揮，進一步證明CAG對骨質(zhì)疏松癥的作用靶點是端粒酶。

4.6 慢性HIV-1感染

在慢性HIV-1感染者中，CD8+T淋巴細胞的比例增加，端?？s短且增殖能力降低[66]。Fauce等[67]研究發(fā)現(xiàn)，21名受試者（包括健康受試者和HIV-1感染者）在接受CAG后，其T淋巴細胞中的端粒酶活性顯著提高，進而增強了細胞的抗病毒能力，改善了受試者的免疫力，潛在信號通路是MAPK途徑；更為重要的是，課題組觀察到CAG對端粒酶活性的上調(diào)作用是短期且可逆的，不會對細胞活力產(chǎn)生不良影響。

5 結(jié)語

CAG是目前天然產(chǎn)物中唯一被報道的端粒酶激活劑，具有抗衰老、抗凋亡、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)、促進細胞增殖和傷口愈合等良好的藥理作用，且療效溫和，安全性較高。CAG通過Src/MEK/ERK等信號通路激活端粒酶，從而對端粒功能障礙相關(guān)的疾病具有潛在的治療作用。然而CAG和端粒酶的結(jié)合位點尚未明確，需開展更多的研究。

目前CAG單體來源昂貴，且存在水溶性較差、代謝時間短、口服生物利用度較低等問題，使CAG的臨床應用受到限制。因此，基于CAG良好的藥理作用與研究價值，迫切需要開展對CAG的化學結(jié)構(gòu)改造以及全合成、生物合成等研究。從未來發(fā)展趨勢看，CAG有望為衰老、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病并發(fā)癥、骨質(zhì)疏松癥、特發(fā)性肺纖維化等疾病的臨床治療提供有價值的選擇。