mRNA檢測技術(shù)研究進(jìn)展

高芙涵，宋貞，王懷松，丁婭

（中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析系，江蘇 南京 210009）

mRNA是一類攜帶遺傳信息且能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的單鏈核糖核酸，滿足合成各種蛋白質(zhì)的所有遺傳信息的要求。自1989年起，以mRNA作為新型治療藥物的概念興起，由mRNA編碼出的抗原決定簇不僅數(shù)量眾多且類型豐富[1-3]。與DNA藥物相比，mRNA藥物不會(huì)插入基因組之中[2-8]，可通過正常代謝途徑分解，安全性更高[5-6]；mRNA藥物無需進(jìn)入細(xì)胞核便可發(fā)揮其功能，既可以通過體外轉(zhuǎn)錄，也能夠在患者體內(nèi)合成所需的治療性蛋白質(zhì)，設(shè)計(jì)和起效更加靈活快速，為個(gè)性化治療開辟了新的道路；mRNA疫苗編碼的蛋白可通過激活免疫細(xì)胞觸發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，可用于癌癥免疫治療、傳染病疫苗或蛋白質(zhì)替代等生物醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[7]。目前，針對(duì)晚期黑色素瘤的mRNA疫苗Ⅰ期臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成[8]。此外，新冠肺炎mRNA疫苗的開發(fā)與研究也成為近期研究的熱點(diǎn)[2]。

除了作為疫苗抗原的表達(dá)模板外，mRNA藥物還具有多種功能。首先，mRNA可以作為癌癥治療的生物標(biāo)志物[9]。mRNA直接或間接地影響體內(nèi)細(xì)胞變化，發(fā)生相應(yīng)的基因表達(dá)，反映組織的病理狀態(tài)。因此通過檢測細(xì)胞內(nèi)mRNA的變化，可以為早期疾病的檢測提供線索和生理依據(jù)。其次，mRNA動(dòng)態(tài)檢測可作為組織檢測的有效補(bǔ)充，且在無癥狀人群中的檢測效率較高，可以對(duì)多種疾病進(jìn)行診斷和評(píng)估，有潛力替代直接的組織取樣檢測[9-10]。

在上述mRNA藥物研究過程中，對(duì)體內(nèi)外mRNA水平的準(zhǔn)確檢測能反映基因的表達(dá)情況，時(shí)刻監(jiān)測mRNA藥物的療效和毒性。因此快速、靈敏、特異性強(qiáng)的mRNA檢測方法非常重要。常見的mRNA檢測方法有：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、細(xì)胞成像技術(shù)等（見圖1）。本文根據(jù)近期發(fā)表的主要相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)了mRNA檢測方法，并評(píng)價(jià)了各類方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

圖1 mRNA的主要檢測技術(shù)Figure 1 The main mRNA detection techniques

1 mRNA定量檢測方法

1.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

在mRNA的檢測中，最常用的是RT-PCR技術(shù)，其操作簡單、成本低廉、可快速、有選擇性地?cái)U(kuò)增核酸，是微量DNA或mRNA的高效檢測方法，已廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)、微生物和疾病診斷等領(lǐng)域[11-12]。RT-PCR的檢測原理是以mRNA為起始原料，采用逆轉(zhuǎn)錄引物與mRNA進(jìn)行互補(bǔ)雜交，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成總的cDNA文庫。隨后，利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（見圖2）。在PCR擴(kuò)增過程中，加入TaqMan探針或熒光染料，可以對(duì)產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測，結(jié)合計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析，能夠計(jì)算待測樣品的初始濃度[11-13]。例如，在新冠病毒的檢測中，利用RT-PCR技術(shù)，將病毒的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，然后通過熒光定量PCR儀檢測出熒光強(qiáng)度到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值），從而反映病毒核酸濃度[12]。

圖2 RT-PCR擴(kuò)增mRNA的示意圖Figure 2 Schematic diagram of mRNA amplification by RT-PCR

盡管RT-PCR具有較高的靈敏度和特異性，但其逆轉(zhuǎn)錄以及PCR時(shí)間較長。此外，由于擴(kuò)增過程中引物對(duì)單堿基的區(qū)分能力不足，不能有效分辨mRNA序列中的單堿基變異，容易出現(xiàn)假陽性[12-14]。

Zogchel等[14]將RT-PCR技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，研究出一種多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR），用于檢測神經(jīng)細(xì)胞瘤中的mRNA。課題組使用同一內(nèi)標(biāo)RNA結(jié)合特異性引物對(duì)多種mRNA進(jìn)行定量檢測。利用這種改進(jìn)的RT-qPCR技術(shù)可以同時(shí)檢測7種不同的mRNA，從而減少樣品的用量，克服腫瘤的異質(zhì)性，提高檢測的靈敏度，在節(jié)省資源和時(shí)間的同時(shí)也有助于引入臨床實(shí)踐。

1.2 基于恒溫?cái)U(kuò)增的檢測

恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)不需要快速頻繁的溫度變化，具有高特異性、高靈敏度、對(duì)儀器的要求較低等特點(diǎn)。目前常見的基于恒溫?cái)U(kuò)增的mRNA檢測方法有LAMP、HCR、RCA和恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)等。

LAMP相較于PCR具有更高的擴(kuò)增速率，可在恒溫下進(jìn)行，不需要熱循環(huán)儀。LAMP反應(yīng)可分為2個(gè)階段：非循環(huán)擴(kuò)增和循環(huán)擴(kuò)增。其原理較為復(fù)雜，基于靶基因的3'和5'端設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，包括一對(duì)外引物（上游外引物F3和下游外引物B3）、一對(duì)環(huán)狀引物（上游環(huán)引物和下游環(huán)引物）和一對(duì)內(nèi)引物（上游內(nèi)引物FIP和下游內(nèi)引物BIP），3種特異性引物在具有高度鏈置換活性的DNA（BstDNA）聚合酶的作用下，合成DNA并不斷自我循環(huán)[15]。在mRNA的檢測中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與靶mRNA互補(bǔ)的cDNA，并通過自退火在其兩端形成啞鈴結(jié)構(gòu)。非循環(huán)擴(kuò)增階段，啞鈴狀的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為模板，以F3和B3為引物進(jìn)行延伸擴(kuò)增，形成單莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在BstDNA聚合酶的作用下，單莖環(huán)結(jié)構(gòu)與內(nèi)引物結(jié)合轉(zhuǎn)換成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA，從而啟動(dòng)LAMP反應(yīng)的第2階段——循環(huán)擴(kuò)增階段。循環(huán)擴(kuò)增階段由環(huán)引物引導(dǎo)，經(jīng)過多次循環(huán)擴(kuò)增最終形成長度不一的莖環(huán)狀DNA[16-17]。

LAMP技術(shù)反應(yīng)時(shí)間短，操作簡單，Meng等[15]開發(fā)了一種新的單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（single-cell reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification，scRT-LAMP）的工作流程（見圖3），將LAMP技術(shù)和微流體系統(tǒng)相結(jié)合，確保反應(yīng)物的精準(zhǔn)添加，在1 h內(nèi)可以檢測到數(shù)百至數(shù)千個(gè)單細(xì)胞中的靶mRNA。

圖3 RT-LAMP的反應(yīng)原理及不同細(xì)胞中羥甲基膽素合酶mRNA的檢測[15]Figure 3 The reaction principle of RT-LAMP and the detection of hydroxymethylcholine synthase mRNA in different cells

HCR是一種基于自組裝的核酸擴(kuò)增方法，不需要酶的參與，可在溫和的條件下進(jìn)行快速的擴(kuò)增和檢測[18-20]。其原理如下：根據(jù)靶標(biāo)mRNA設(shè)計(jì)2個(gè)自催化的DNA發(fā)夾探針H1和H2。H1和H2發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的黏性末端分別與對(duì)方的環(huán)互補(bǔ)，并且兩者的莖序列一致。由于莖的結(jié)構(gòu)較長，在沒有靶標(biāo)mRNA時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)中黏性末端的序列較短，不足以打開發(fā)夾；而在靶mRNA存在的條件下，mRNA與H1的1-2部分結(jié)合，打開H1的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，H1結(jié)構(gòu)暴露出3-2'部分與H2的3'-2部分結(jié)合，使H2的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開。H2發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開暴露出1'-2'部分，與mRNA的序列相同，從而不斷地與H1、H2結(jié)合形成一條長缺口的雙鏈DNA（見圖4）[19]。通過設(shè)計(jì)具有不同熒光標(biāo)記的正交發(fā)夾放大器，可同時(shí)檢測不同的mRNA[20]。HCR相較于其他幾種恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)而言更為簡單和快速，不需要逆轉(zhuǎn)錄酶的參與，降低了實(shí)驗(yàn)成本。

圖4 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測mRNA的原理[19]Figure 4 Principle of hybridization chain reaction for mRNA detection

RCA廣泛地應(yīng)用于DNA、RNA與蛋白質(zhì)的檢測。該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)局部等溫?cái)U(kuò)增，能夠原位檢測靶分子，提供靶分子定位的相關(guān)信息，具有細(xì)胞水平原位檢測mRNA的優(yōu)勢，可作為單分子熒光原位雜交的替代檢測技術(shù)[21]。其原理為：以環(huán)狀DNA作為聚合模板，設(shè)計(jì)與之互補(bǔ)的短DNA或RNA引物，將引物與環(huán)形模板探針雜交，在無5'→3'端外切酶活性的聚合酶的作用下擴(kuò)增延伸。由于使用的是此種聚合酶，引物會(huì)沿著環(huán)形模板一直延伸，而先前生成的序列會(huì)被替換下來，最終生成一條長的重復(fù)序列（見圖5）[21-23]。

圖5 RCA檢測mRNA的原理圖[21]Figure 5 Principle of RCA for mRNA detection

然而，RCA的特異性和檢測效率并不理想。為此，研究人員將RCA與納米材料進(jìn)行結(jié)合來提高反應(yīng)的靈敏度。Liu等[24]引入苯胺修飾的金納米顆粒（Au-TPP）和“C”形靶向特異性寡核苷酸探針，由于Au-TPP的光熱效應(yīng)，當(dāng)探針、功能化的金納米粒子與相同的靶mRNA結(jié)合時(shí)會(huì)啟動(dòng)光熱介導(dǎo)的RCA，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)并進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，從而可以獲得更可靠、更具體的mRNA表達(dá)信息，并且此過程無需逆轉(zhuǎn)錄酶，提高了RCA的特異性，可以更容易應(yīng)用到常規(guī)的病理診斷中。

1.3 Northern印跡雜交

Northern印跡雜交是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上建立的，其特點(diǎn)是簡單易行，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。該方法通過放射性的P32標(biāo)記的RNA與寡核苷酸探針雜交，檢測固定在尼龍膜上的RNA分子，也可用來檢測參與真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的RNA的數(shù)量和大小。根據(jù)RNA樣本的大小，將總RNA經(jīng)過變性凝膠電泳進(jìn)行分離，分離后通過毛細(xì)管轉(zhuǎn)移技術(shù)、真空印跡技術(shù)、TurboBlotter系統(tǒng)的重力轉(zhuǎn)移技術(shù)、電印跡技術(shù)等將其轉(zhuǎn)移到尼龍膜、硝酸纖維素薄膜或聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。再經(jīng)紫外照射，將分離的RNA固定到膜上，然后用預(yù)雜交液將濾膜上的非特異核酸結(jié)合位點(diǎn)阻塞，最后利用DNA探針進(jìn)行選擇性的雜交并利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)定量檢測（見圖6）[25]。Northern印跡雜交與其他方法相比，缺乏擴(kuò)增步驟，是一種半定量的檢測方法，在檢測操作過程中需要注意酶污染和mRNA的降解問題，而且靈敏度有限，操作較為繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

1.4 納米通道傳感檢測

基于納米通道的新型生物傳感器平臺(tái)具有高度的特異性和靈敏度。陣列納米通道結(jié)構(gòu)的多孔陽極氧化鋁膜具有良好的穩(wěn)定性，常用于構(gòu)建納米通道生物傳感器。通過將多孔陽極氧化鋁膜與電化學(xué)方法相結(jié)合，可建立納米流體平臺(tái)，用于DNA和胰島素的無標(biāo)記檢測，相比于單個(gè)納米通道靈敏度可提高多個(gè)數(shù)量級(jí)。Zhao等[26]通過納米通道-離子通道雜交體固定探針識(shí)別靶miRNA。該工作將探針（ssDNA）通過化學(xué)偶聯(lián)的方法固定在離子通道的外表面，再與多孔陽極氧化鋁膜表面修飾的3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)。當(dāng)靶標(biāo)miRNA存在時(shí)，探針能特異性識(shí)別靶標(biāo)，與其雜交形成雙鏈。隨后，納米通道-離子通道雜交體的質(zhì)量傳輸性質(zhì)會(huì)隨著外表面的電荷密度及有效離子通道尺寸的變化而發(fā)生相應(yīng)的變化，可通過化學(xué)電池實(shí)時(shí)檢測（見圖7）。

圖7 納米通道-離子通道雜交體的表面修飾及修飾產(chǎn)物在miRNA檢測中的應(yīng)用[26]Figure 7 Surface modification of nanochannel-ion channel hybrids and application of the modified product in miRNA detection

2 mRNA細(xì)胞成像技術(shù)

2.1 納米探針

納米探針和成像技術(shù)的發(fā)展為動(dòng)態(tài)觀察mRNA活性奠定了基礎(chǔ)，可用于準(zhǔn)確描述基因調(diào)控機(jī)制，高分辨追蹤單個(gè)mRNA并呈現(xiàn)mRNA的動(dòng)態(tài)調(diào)控過程，更好地探索活細(xì)胞mRNA動(dòng)態(tài)特征及其對(duì)翻譯過程所產(chǎn)生的影響。

納米探針作為細(xì)胞內(nèi)成像的一種有力工具，包括金納米簇、銀納米簇（AgNC）、量子點(diǎn)、金納米顆粒（AuNP）等。其中，AuNP具有各向異性和表面等離子共振光學(xué)特性，吸收高、散射面積大，并且具有良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，被廣泛地應(yīng)用于生物成像領(lǐng)域。例如，AuNP可被一層致密的高度定向的核酸功能化，與被標(biāo)記的寡核苷酸鏈雜交形成納米耀斑。當(dāng)熒光基團(tuán)靠近AuNP表面時(shí)熒光被淬滅，不需要轉(zhuǎn)染劑的參與即可被攝取入胞，可用于檢測細(xì)胞內(nèi)的mRNA。

Lin等[27]設(shè)計(jì)了一個(gè)由AuNP和光響應(yīng)DNA發(fā)夾探針組成的新型納米耀斑。在沒有紫外線照射的情況下，DNA發(fā)夾可以保持不被喚醒并且對(duì)靶探針無反應(yīng)；在紫外線照射激活后，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞并暴露出充當(dāng)調(diào)節(jié)鏈置換反應(yīng)立足點(diǎn)的黏性末端，使耀斑從AuNP表面釋放，引起熒光信號(hào)增加。這種光活化的納米耀斑具有高度的時(shí)間可控性，可以在單細(xì)胞水平上檢測到mRNA。并且，這種方法也可以感知癌細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平的變化。

此外，基于AgNC斯托克斯位移大、生物相容性好、粒徑小、易于和生物分子偶聯(lián)的特性，Tang等[28]建立了一種無酶且無標(biāo)記的基于DNA發(fā)夾和AgNC組裝的熒光檢測方法。研究人員使用了2個(gè)發(fā)夾探針，尾部分別包含DNA穩(wěn)定的銀納米簇捕獲序列和富鳥嘌呤序列。當(dāng)靶mRNA存在時(shí)，發(fā)夾探針會(huì)觸發(fā)催化發(fā)夾組裝（catalytic hairpin assembly，CHA）循環(huán)反應(yīng)，并捕獲生成的暗色組裝產(chǎn)物。AgNC與富含鳥嘌呤的序列緊密連接后，暗色組裝物轉(zhuǎn)變?yōu)槊髁恋募t色熒光，從而點(diǎn)亮CHA組裝物。這種新型的熒光金屬納米材料具有廣泛的應(yīng)用潛力，且催化發(fā)夾的組裝物不使用外源酶，操作經(jīng)濟(jì)、簡單、靈敏度高，具有良好的選擇性。

2.2 SunTag系統(tǒng)

SunTag系統(tǒng)是一種在活細(xì)胞中進(jìn)行的單分子成像技術(shù)，用于單個(gè)mRNA分子實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)翻譯過程的成像[29-30]。其原理為將含有dCas9蛋白片段的靶向基因與串聯(lián)重復(fù)的綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，以提高熒光信號(hào)強(qiáng)度。通過識(shí)別包含Vp64的多肽和超折疊GFP蛋白的單抗片段scFV，以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)mRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記。Vinter等[30]采用SunTag系統(tǒng)，研究了果蠅胚胎mRNA在固定胚胎和活體胚胎中的翻譯動(dòng)態(tài)，揭示了果蠅胚胎mRNA翻譯在早期胚胎中的時(shí)間規(guī)律（見圖8）?；诳贵w的SunTag系統(tǒng)具有非常高的親和力和識(shí)別短肽的能力，但抗體在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)能力不強(qiáng)，且成像技術(shù)還需要不斷改進(jìn)。

圖8 SunTag法在果蠅胚胎mRNA檢測中的應(yīng)用[30]Figure 8 Application of SunTag method in detection of mRNA in drosophila embryos

2.3 原位雜交技術(shù)

DNA放大器是一種可響應(yīng)分子或環(huán)境信號(hào)執(zhí)行相應(yīng)功能的DNA組裝體，其生物相容性良好、細(xì)胞攝取量高且具有信號(hào)放大的能力。因而，該類成像技術(shù)可用來檢測低豐度的生物標(biāo)志物（如mRNA）[31-33]。

Meng等[33]將 金 屬 有 機(jī) 框 架（metal-organic framework，MOF）與熵驅(qū)動(dòng)的DNA放大器結(jié)合，形成一種納米傳感器，可響應(yīng)細(xì)胞中的磷酸并釋放出DNA放大器。如圖9所示，5'端攜帶熒光基團(tuán)的R鏈與3'端被淬滅劑修飾的Q鏈以及用以連接MOF結(jié)構(gòu)的P鏈組合成EB結(jié)構(gòu)。在該系統(tǒng)中DNA分子與MOF結(jié)構(gòu)以共價(jià)鍵相連接，在靶mRNA存在時(shí)，能夠通過響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)無機(jī)磷酸鹽釋放DNA鏈，觸發(fā)鏈置換反應(yīng)，從而產(chǎn)生一種強(qiáng)烈的熒光。該方法提高了檢測的靈敏度和特異性，可同時(shí)檢測1個(gè)以上的mRNA目標(biāo)，適用于早期癌癥檢測和生物過程的基因成像[33]。

圖9 DNA-MOF擴(kuò)增器的組裝及其在mRNA檢測中的應(yīng)用[33]Figure 9 Assembly of DNA-MOF amplifier and its application in mRNA detection

RNAscope是一項(xiàng)用于檢測細(xì)胞中mRNA的原位雜交技術(shù)。該方法允許在各種樣品類型中可視化觀察單一細(xì)胞中的單個(gè)mRNA。在腫瘤細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄效率較低且非功能性的RNA轉(zhuǎn)錄物會(huì)影響檢測的結(jié)果。RNAscope技術(shù)能夠放大特異性信號(hào)而不放大噪音信號(hào)。其原理如圖10所示，基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，利用一個(gè)Z型探針結(jié)合目標(biāo)RNA序列，2個(gè)相鄰的探針上的特異性酶與前置放大器及顯色劑結(jié)合，從而原位顯示mRNA的表達(dá)部位和相對(duì)豐度。同時(shí)，結(jié)合非特異性位點(diǎn)的單個(gè)探針不會(huì)產(chǎn)生完整的信號(hào)，且會(huì)在雜交過程中被洗脫，從而保證了高度的特異性[34]。

圖10 RNAscope在腫瘤細(xì)胞mRNA檢測中的應(yīng)用[34]Figure 10 Application of RNAscope in detection of mRNA in tumor cells

單個(gè)RNA分子熒光原位雜交（single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization，smFISH）是單細(xì)胞mRNA空間定位的強(qiáng)有力的工具。其精確測量基因表達(dá)的能力可以用來研究基因調(diào)控在各種生理過程中的作用，例如細(xì)胞遷移和極化。smFISH利用多個(gè)熒光標(biāo)記的DNA探針，同時(shí)雜交到長的靶向mRNA片段上，可獲得增強(qiáng)的熒光信號(hào)。Wadsworth等[35]介紹了一種新的單探針熒光原位雜交法，將單個(gè)酵母細(xì)胞中的mRNA與Cy5或Cy3染料標(biāo)記的單個(gè)探針進(jìn)行雜交，使用甲醇固定細(xì)胞后，以傾斜的激光進(jìn)行照射來增加從單個(gè)探針捕獲熒光所需的信噪比，從而檢測單一細(xì)胞中的單個(gè)mRNA分子，這種方法顯著提高了探針的特異性和檢測信號(hào)強(qiáng)度。

在新冠病毒的檢測中，原位雜交技術(shù)也提供了一種快速檢測的思路。Wang等[36]基于雜交捕獲熒光免疫測定（hybrid capture fluorescence immunoassay，HC-FIA）技術(shù)，將雜交和免疫熒光分析結(jié)合，開發(fā)出了一種新型無需擴(kuò)增的SARS-CoV-2核酸檢測平臺(tái)，能夠在1 h內(nèi)完成對(duì)SARS-CoV-2的檢測。首先，在反應(yīng)管中，優(yōu)化的DNA探針與SARS-CoV-2病毒基因組保守的開放閱讀框1ab（ORF1ab）、包膜蛋白（E）和核衣殼（N）區(qū)域結(jié)合，形成DNARNA復(fù)合物，進(jìn)而被熒光納米顆粒標(biāo)記的S9.6抗體捕獲；然后，在免疫熒光分析階段，將S9.6抗體以及抗兔IgG抗體分別噴涂在試紙條的測試線（T）和對(duì)照線（C）上，將反應(yīng)液滴在樣品墊上，在毛細(xì)管張力的作用下，復(fù)合物到達(dá)T區(qū)，被S9.6抗體捕獲，逐漸產(chǎn)生熒光信號(hào)。在C區(qū)，熒光納米粒子（fluorescent nanoparticles，F(xiàn)NP）標(biāo)記的兔IgG被抗兔IgG捕獲，也產(chǎn)生熒光；最后，使用熒光閱讀器讀取T/C熒光值來進(jìn)行定量分析。相比當(dāng)前常用的qPCR技術(shù)，這種新型技術(shù)的檢測限能達(dá)到每毫升500拷貝，且已被開發(fā)成用于診斷SARS-CoV-2的檢測試劑盒。

3 結(jié)語與展望

mRNA在基因調(diào)控和遺傳信息的表達(dá)方面起著重要的作用。一方面，基于中心法則，mRNA將細(xì)胞核內(nèi)DNA的遺傳信息按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則抄錄并傳送到細(xì)胞質(zhì)的核糖體中，是蛋白質(zhì)合成的模板，決定著蛋白質(zhì)合成的氨基酸排列順序。另一方面，mRNA是細(xì)胞動(dòng)態(tài)遺傳表達(dá)變化的理想指標(biāo)，可作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于疾病的診斷、檢測和治療。因此研究mRNA生物標(biāo)志物檢測方法具有重大意義。

本文對(duì)常見的幾種mRNA的分析方法進(jìn)行了綜述，主要包括各種核酸擴(kuò)增技術(shù)、mRNA成像技術(shù)、印跡雜交技術(shù)和原位雜交成像技術(shù)等。核酸擴(kuò)增技術(shù)如RT-PCR、RCA等線性范圍寬，靈敏度極高，為RNA生物標(biāo)志物的簡便、高靈敏度體外檢測提供了新的平臺(tái)；基因測序等高通量的分析方法適合于大量樣本的快速檢測，但同時(shí)也會(huì)提高實(shí)驗(yàn)的成本；mRNA分子成像技術(shù)主要指熒光成像，步驟簡單、快速且不需要昂貴的儀器，能夠?qū)崟r(shí)高分辨地追蹤mRNA的動(dòng)態(tài)過程。

盡管目前已開發(fā)出很多mRNA的檢測方法，但是針對(duì)提高檢測方法的適用性、特異性以及靈敏度等問題還有待進(jìn)一步探索。1）雖然核酸擴(kuò)增技術(shù)靈敏度高，但其特異性還有待進(jìn)一步提高。而且，核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)引物的設(shè)計(jì)要求較高，引物二聚體等因素會(huì)對(duì)檢測結(jié)果造成影響。2）mRNA具有不穩(wěn)定性、易降解，在檢測過程中需要嚴(yán)格控制溫度和pH條件并保持無核酸酶的環(huán)境。3）常見的mRNA檢測方法大多需要專業(yè)的設(shè)備儀器，因此低成本的即時(shí)化檢測試劑盒和設(shè)備開發(fā)還面臨挑戰(zhàn)。4）應(yīng)更加關(guān)注mRNA的動(dòng)力學(xué)特征以及翻譯模板與翻譯產(chǎn)物之間相互聯(lián)系的機(jī)制，深入探究活細(xì)胞mRNA的動(dòng)態(tài)特征及其對(duì)翻譯的影響。