水貂出血性肺炎大腸桿菌毒力基因測(cè)定和H基因分型

張海威，程悅寧，王曉旭，周玉成，喬連江，周曼莉，程世鵬，楊艷玲

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112）

水貂肺炎是一種多病原體混合感染引起的急性、熱性、高致死性的呼吸道疾病，近年來(lái)該疾病頻繁暴發(fā)，給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并嚴(yán)重影響了我國(guó)水貂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1-2]。近年來(lái)，水貂發(fā)生肺炎時(shí)，無(wú)任何癥狀突然死亡、口鼻流血，有的出現(xiàn)厭食、嗜睡、體溫升高等癥狀。剖檢時(shí)可見(jiàn)肺臟腫大出血、肺臟橫斷面可見(jiàn)血液流出、脾臟和腎臟出現(xiàn)出血性壞死[3]。水貂肺炎主要集中在6月～10月發(fā)病，該病的發(fā)生受環(huán)境的影響比較嚴(yán)重，如環(huán)境溫度驟變、水貂褪毛的毛絮等；同時(shí)被病原體污染的動(dòng)物性飼料也是該病發(fā)生的主要原因，如天氣炎熱導(dǎo)致食物變質(zhì)及被細(xì)菌污染的動(dòng)物產(chǎn)品等均是該病誘發(fā)的原因[4]。臨床上水貂肺炎多以一種或幾種混合病原感染的形式發(fā)生，現(xiàn)有疫苗防控存在缺陷，抗生素藥物治療容易產(chǎn)生耐藥性，所以目前水貂肺炎病的防控難度越來(lái)越大，因治療和防控效果不佳，每年因水貂肺炎而死亡的病例不斷增加[5-6]。

大腸桿菌是引起水貂肺炎的一種非常重要的病原體，有些大腸桿菌感染后水貂發(fā)病急，死亡快，臨床癥狀不明顯，也被誤認(rèn)為是出血性肺炎[7]。目前水貂大腸桿菌耐藥比較嚴(yán)重，抗生素治療起不到很好的效果。為此，對(duì)水貂大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，并明確其致病力、血清型、主要毒力基因及流行情況對(duì)有效防控大腸桿菌引起的水貂肺炎具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 胰蛋白胨大豆肉湯購(gòu)自美國(guó)BD公司上海有限公司；瓊脂粉購(gòu)自西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、快速革蘭式染色試劑盒、DL2000 marker均購(gòu)自購(gòu)自寶生物（大連）公司； 2×EasyTaq?PCR SuperMix、Agarose購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SuperStain核酸染料購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。大容量高速冷凍離心機(jī)（Avanti J-26XPI）購(gòu)自美國(guó)Avanti公司；電熱恒溫水槽（DK-8D型）購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)自致微（廈門(mén)）儀器有限公司；基因擴(kuò)增儀（DHS96G140504355）購(gòu)自北京鼎昊源科技有限公司；電泳儀（DYY-11型）購(gòu)自日本日立制作所；電泳槽（JY-SPFT）購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。45只4～6周齡、體重為25～30 g左右健康昆明系雄性小白鼠，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司；6只8月齡健康雄性水貂購(gòu)自吉林中特農(nóng)業(yè)科技有限公司異獸錄分公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成及病料來(lái)源 根據(jù)Banjo等[8]大腸桿菌H基分型引物和芮萍等[9]有關(guān)致病性大腸桿菌毒力基因，應(yīng)用Prime Premier5.0軟件設(shè)計(jì)56個(gè)大腸桿菌H基因分型引物和9個(gè)大腸桿菌毒力基因引物，引物名稱(chēng)及片段大小見(jiàn)表1和表2。引物均由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。采集山東省、遼寧省、河北省、黑龍江省4個(gè)省份的不同水貂養(yǎng)殖場(chǎng)疑似水貂肺炎死亡的水貂樣品28只，其中山東省10只，遼寧省9只，河北省5只，黑龍江省4只。

1.3 臟器病理檢測(cè)及病原菌分離鑒定 無(wú)菌采集死亡水貂的肺臟和脾臟，肉眼觀(guān)察病理變化，進(jìn)行病理切片，觀(guān)察發(fā)病水貂肺臟和脾臟的病理變化。同時(shí)采集病料組織樣品，用接種環(huán)劃線(xiàn)于TSA平板上，靜置3～5 min，倒置放入37℃培養(yǎng)18～24 h。根據(jù)大腸桿菌菌落形態(tài)挑取疑似菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)、革蘭氏染色、鏡檢（100×），用50%甘油進(jìn)行保種。

1.4 分離株16S rDNA擴(kuò)增與序列分析 將上述純化培養(yǎng)的細(xì)菌革蘭氏染色鏡檢無(wú)雜菌后，進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增和比對(duì)分析。以分離株基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rRNA通用引物[10]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸100 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；預(yù)期擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度約為1500 bp 。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后送往吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，并依據(jù)測(cè)序比對(duì)結(jié)果（同源性比對(duì)結(jié)果＞96%）對(duì)分離株進(jìn)行鑒定。

1.5 分離株的致病力試驗(yàn) 根據(jù)分離到的菌株數(shù)量選擇45只6～8周齡的昆明鼠，隨機(jī)分為9組，每組5只，其中致病力實(shí)驗(yàn)8組，PBS對(duì)照1組。將鑒定為大腸桿菌的分離株，采用菌落計(jì)數(shù)法調(diào)整菌液濃度為1.0×107CFU/mL。小鼠腹腔注射0.2 mL/只，觀(guān)察5～7 d，記錄小鼠死亡情況。無(wú)菌采集死亡小鼠脾臟進(jìn)行大腸桿菌的分離培養(yǎng)、革蘭氏染色和鏡檢（100×）。根據(jù)小鼠的死亡情況、臟器分離菌株的菌落形態(tài)（包括菌落顏色、大小、邊緣整齊度、是否有凸起等）、鏡檢結(jié)果，判定大腸桿菌分離株對(duì)小鼠的致病力。為了進(jìn)一步檢測(cè)分離株對(duì)水貂的致病力，將6只水貂進(jìn)行隨機(jī)分組，每組3只，用小鼠致病力較強(qiáng)的菌株感染水貂，觀(guān)察水貂的發(fā)病和死亡情況，并檢測(cè)最小感染劑量和進(jìn)行病理切片實(shí)驗(yàn)。

1.6 大腸桿菌H基因分型鑒定 提取的大腸桿菌DNA作為模板，用大腸桿菌56種H基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增體系（總體積為25 μL）：2×EasyTaq? PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性8 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

表1 H基因型PCR 產(chǎn)物片段Table 1 PCR product length of gene type H

（接上頁(yè)）

1.7 大腸桿菌毒力基因的檢測(cè) 提取大腸桿菌的DNA作為模板，用大腸桿菌9個(gè)主要毒力基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（總體積為25 μL）：2×EasyTaq?PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性8 min； 94℃變性60 s，57℃退火1 min，72℃延伸 60 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度，見(jiàn)表2。

表2 毒力基因PCR產(chǎn)物Table 2 Virulence gene PCR products

2 結(jié)果

2.1 病理檢測(cè)及病原分離鑒定 對(duì)死亡水貂的肺臟、脾臟進(jìn)行病理檢測(cè)，結(jié)果顯示肺泡壁明顯增厚，肺泡壁毛細(xì)血管淤血，部分肺泡腔狹窄或閉鎖，巨噬細(xì)胞增生。脾臟白髓的巨噬細(xì)胞（白色星隙狀）增生，散在性分布；紅髓內(nèi)紅細(xì)胞蓄積增多，如圖1所示。

圖1 感染死亡水貂肺臟和脾臟病理切片（H.E.,200×）Fig.1 The lung and spleen pathological section of dead minks （H.E.,200×）

從28只死亡水貂的肺臟和脾臟中共挑取疑似大腸桿菌的菌落共70個(gè)。觀(guān)察TSA固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈淡黃色。革蘭氏染色、鏡檢可見(jiàn)菌體呈兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌，單一存在或成對(duì)存在。

2.2 分離株16S rDNA擴(kuò)增與序列分析 對(duì)疑似大腸桿菌分離株用16S rRNA引物擴(kuò)增獲得約為1500 bp的片段，與預(yù)期目的片段大小一致。測(cè)序比對(duì)分析顯示，8株P(guān)CR陽(yáng)性樣品的核酸序列與NCBI中已登錄的大腸桿菌序列同源性位于99.86%～100%（1號(hào)、3號(hào)分離自山東省，2號(hào)、4號(hào)分離自遼寧省，5號(hào)、7號(hào)分離自河北省，6號(hào)、8號(hào)分離自黑龍江省）。1～8號(hào)分離株分別與Strain 66（GenBank登錄號(hào)：MK621262.1）、Strain 212（GenBank登錄號(hào)：MH671484.1）、Strain E84-1（GenBank登錄號(hào)：KJ477001.1）、Strain 85 （GenBank登錄號(hào)：MH671444.1）、Strain A4（GenBank登錄號(hào)：MK506924.1）、Strain 57（GenBank登錄號(hào)：MH671433.1）、StrainMS14387（GenBank登錄號(hào)：LR130564.1）、Strain A4（GenBank登錄號(hào)：MK506924.1）的同源性分別為99.93%、99.93%、99.93%、99.86%、99.86%、100%、99.86%、99.93%。

2.3 分離株對(duì)小鼠和水貂均具有較強(qiáng)的致病力 將分離到的8株大腸桿菌分離株感染小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠在感染后9～13 h部分小鼠出現(xiàn)呼吸急促、抽動(dòng)、快速死亡；感染后13～24 h部分小鼠可見(jiàn)被毛凌亂、精神萎靡、眼睛微閉癥狀；剩余存活小鼠出現(xiàn)被毛凌亂、食欲不振，飲水減少等癥狀。從死亡小鼠腫脹的脾臟中均可分離出大量的大腸桿菌，菌落形態(tài)單一，鏡檢結(jié)果與大腸桿菌形態(tài)完全相符。致病力試驗(yàn)顯示，8株大腸桿菌分離株中，有5株對(duì)小鼠有較強(qiáng)的致病力，尤其是2組大腸桿菌致病力最強(qiáng)，感染后小鼠在24 h內(nèi)全部發(fā)病并死亡，結(jié)果見(jiàn)表3。

用上述對(duì)小鼠致病力較強(qiáng)的2組菌株感染水貂，結(jié)果顯示感染的3只水貂在72 h內(nèi)全部死亡，最小感染劑量為1.0×107CFU。對(duì)死亡水貂的肺臟脾臟進(jìn)行病理檢測(cè)，結(jié)果顯示肺泡壁中度增厚，間質(zhì)小管淤血。脾臟白髓萎縮，淋巴細(xì)胞明顯減少，紅髓內(nèi)紅細(xì)胞蓄積增多，如圖2所示。

圖2 大腸桿菌感染死亡水貂肺臟和脾臟病理切片（H.E.,200×）Fig.2 The lung and spleen pathological section of Escherichia coli （H.E.,200×）

2.4 大腸桿菌H基因分型鑒定 大腸桿菌H基因分型鑒定結(jié)果顯示8株大腸桿菌分離株中分離出4種H基因型即H11、H16、H5、H25（圖3）。其中H11型4株，占50%，其能夠致小鼠全部發(fā)病，發(fā)病率100%，并且致死率為80%以上，如表3中1組、2組、3組、4組小鼠所示。H16型1株，該株細(xì)菌致病力不如H11基因型，能致小鼠大部分發(fā)病，但是致死率僅為40%，如表3中5組小鼠所示；H25型2株，這個(gè)基因型致病力比H16基因型還弱，感染后小鼠僅有40%發(fā)病，死亡率僅為20%，如表3中6組、7組小鼠所示；H5型1株，該基因型菌株無(wú)致病力，感染后小鼠均不發(fā)病，如表3中8組小鼠所示。1號(hào)、3號(hào)分離自山東省，2號(hào)、4號(hào)分離自遼寧省，5號(hào)、7號(hào)分離自河北省，6號(hào)、8號(hào)分離自黑龍江省。

圖3 大腸桿菌H基因型鑒定Fig.3 Identification of H Genotype of Escherichia coli

表3 分離菌株對(duì)小鼠致病力試驗(yàn)Table 3 Pathogenicity test of isolated strains in mice

2.5 大腸桿菌毒力基因的檢測(cè) 對(duì)大腸桿菌的9個(gè)毒力基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，其中在水貂大腸桿菌中檢測(cè)到了4個(gè)毒力基因，他們分別是papC基因、irp2基因、iutA基因和fyuA基因（圖4），其中irp2基因在8株大腸桿菌中均被檢測(cè)到。

圖4 大腸桿菌毒力基因的檢測(cè)Fig.4 Detection of virulence genes in Escherichia coli

3 討論

水貂肺炎是一種由多種病原體單獨(dú)或混合感染而引起的一種復(fù)雜的以水貂肺炎為典型癥狀的一種傳染病。近年來(lái)一些引起水貂肺炎的病原體已經(jīng)被分離鑒定，如綠膿桿菌、肺炎克雷伯等[11-12]。然而我們發(fā)現(xiàn)除了這些病原體，大腸桿菌也能夠引起水貂肺炎的發(fā)生，而且發(fā)病病例居高不下，有的是大腸桿菌單獨(dú)感染，有的是與其他病原體混合感染，因此導(dǎo)致目前水貂肺炎的病原體十分復(fù)雜。被大腸桿菌感染后的水貂往往看不到臨床癥狀便迅速死亡，剖檢可見(jiàn)肺臟等器官大面積出血等，使用抗生素治療效果不理想，且容易產(chǎn)生耐藥性[13-14]。

目前水貂肺炎主要是通過(guò)疫苗免疫和抗生素免疫等方法進(jìn)行防控，市場(chǎng)上應(yīng)用的疫苗是針對(duì)綠膿桿菌的二價(jià)肺炎疫苗，能夠有效保護(hù)綠膿桿菌引起的水貂出血性肺炎的發(fā)生[15]，然而對(duì)其他病原體引起的肺炎卻起不到保護(hù)作用，同時(shí)還沒(méi)有肺炎多價(jià)疫苗的產(chǎn)品用于防控水貂肺炎。目前有效的抗生素主要有氟苯尼考、恩諾沙星、左氧氟沙星、阿米卡星。然而使用抗生素后常會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加，治療十分困難。

造成大腸桿菌耐藥性增加的原因有多種，首先是大腸桿菌血清型眾多有關(guān)，其次是在外界高濃度抗生素壓力下，一些具備耐藥性的菌株與一些強(qiáng)耐藥性菌株生存在一起，促進(jìn)耐藥性在細(xì)菌間傳播，因而導(dǎo)致用抗生素預(yù)防及治療大腸桿菌病效果不佳[16]。

低劑量、低頻率及短療程使用抗生素間接導(dǎo)致大腸桿菌適應(yīng)性逐漸增強(qiáng)，同時(shí)多品種多樣化交替使用抗生素導(dǎo)致菌株產(chǎn)生多重耐藥和交叉耐藥[18]。因此需要對(duì)養(yǎng)殖戶(hù)進(jìn)行科普宣傳，讓其走出抗生素濫用的誤區(qū)。加強(qiáng)基層工作者工作習(xí)慣和廣播宣傳抗生素帶來(lái)的危害，改變習(xí)慣且抗生素使用要在指導(dǎo)下用藥[17]。

我們對(duì)遼寧省、山東省、黑龍江省和吉林省等地區(qū)肺炎死亡的水貂的病原體進(jìn)行分離鑒定發(fā)現(xiàn)，引起水貂肺炎的主要病原菌，除了綠膿桿菌之外，還有大腸桿菌。致病力實(shí)驗(yàn)顯示分離到的大腸桿菌能夠明顯致小鼠和水貂死亡。說(shuō)明分離到的大腸桿菌是引起水貂肺炎的另一個(gè)主要致病菌。目前大腸桿菌在毛皮動(dòng)物中廣泛流行，主要引起水貂肺炎、腸炎等疾病，并且在我國(guó)多個(gè)地區(qū)普遍流行。我們分析目前水貂的主要?jiǎng)游镄燥暳蟻?lái)源是家禽的副產(chǎn)品，如雞肝、雞架、鴨肝等，這與楊青等[19]研究結(jié)果相符。劉長(zhǎng)利等[20]研究表明大腸桿菌引起的肺炎在家禽中是很普遍的，同時(shí)大腸桿菌也是條件致病菌，可以通過(guò)飼養(yǎng)環(huán)境和飼料來(lái)源引起感染。

目前鑒定發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中有180多種O血清型，同時(shí)還有53種H血清型[21]。然而，引起水貂肺炎的大腸桿菌血清型還未知。本研究我們利用50種O血清型凝集反應(yīng)試劑盒和53種H血清型的PCR檢測(cè)方法對(duì)大腸桿菌的血清型進(jìn)行了鑒定分析。結(jié)果顯示，引起水貂肺炎的大腸桿菌均沒(méi)有檢測(cè)到試劑盒里已有的O血清型。H血清型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分離到的大腸桿菌中有4株是H11血清型，2株是H25血清型，1株是H16血清型，有1株是H5血清型。同時(shí)根據(jù)小鼠致病性試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)4株H11血清型中有一株大腸桿菌（表3的2組分離株）的致病力較強(qiáng)，同時(shí)感染水貂后也可導(dǎo)致水貂死亡。為了進(jìn)一步分析這些血清型的流行情況，我們對(duì)來(lái)自黑龍江省的167份水貂的肺臟組織進(jìn)行了4種H血清型的PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示167份水貂肺臟病料中分離出H16血清型6份，H25血清型4份，H11血清型2份，H5血清型0份?？梢?jiàn)，本研究分離到的H血清型中，除了H5外，其余血清型在臨床上均有不同程度的流行。由于本研究采集的病料均是健康水貂的肺臟，所以H16和H25兩種血清型相對(duì)分布廣泛些，這是H16和H25對(duì)小鼠的感染率和致死率均較低。然而，致病力較強(qiáng)的H11血清型也在健康群體內(nèi)有流行，許騰林等[22]報(bào)道貂源腸致病性大腸桿菌的血清型和致病性存在相關(guān)性。芮萍等[9]報(bào)道了大腸桿菌的血清型與其致病因子和毒力基因有相關(guān)性?？梢?jiàn)，H11將是引起水貂肺炎的主要大腸桿菌血清型。這在水貂出血性肺炎的病例中也是首次被發(fā)現(xiàn)，本研究結(jié)果為明確我國(guó)水貂肺炎大腸桿菌血清型提供了科學(xué)依據(jù)。

隨著抗生素的使用，水貂大腸桿菌的耐藥性逐漸增加。眾所周知，抗生素的不合理使用是產(chǎn)生耐藥菌的主要原因，為了適應(yīng)環(huán)境和抗生素的壓力，耐藥菌將通過(guò)產(chǎn)生毒力基因和耐藥基因來(lái)發(fā)揮其致病力和自我保護(hù)[23]。

為此，我們對(duì)大腸桿菌分離株進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，選擇9種大腸桿菌中比較常見(jiàn)的毒力基因，其中僅有4種在水貂大腸桿菌中被檢測(cè)到，即編碼P 菌毛的蛋白的papC基因，編碼螯鐵蛋白的iutA基因，編碼鐵調(diào)節(jié)蛋白2的irp2 基因和編碼鼠疫菌素受體與細(xì)菌的攝鐵能力調(diào)節(jié)有關(guān)的fyuA基因。這些基因分別是與大腸桿菌的黏附、毒力和代謝有密切的關(guān)系，在細(xì)菌對(duì)機(jī)體的成功感染和形成菌血癥起重要作用[24-26]。在H11血清型的菌株2中卻檢測(cè)到了irp2、iutA和fyuA 3個(gè)大腸桿菌重要的毒力基因，這也是H11血清型導(dǎo)致小鼠和水貂發(fā)病的根本原因，該菌株的鑒定對(duì)于疫苗研制奠定了理論基礎(chǔ)。

總之，本研究通過(guò)對(duì)引起水貂肺炎的大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其血清型和毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合致病力實(shí)驗(yàn)，明確了大腸桿菌引起水貂肺炎的發(fā)病機(jī)理，并全面掌握了大腸桿菌在水貂養(yǎng)殖中的流行情況及其重要的毒力作用，這是首次開(kāi)展大腸桿菌引起的水貂肺炎的研究?jī)?nèi)容，本研究為研制有效防控水貂肺炎的疫苗產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。